Эмбрионы используют в возрасте от 8 до 14 дней в зависимости от вида вируса, способа заражения. Размножение в куриных эмбрионах происходит в разных частях зародыша.Способы заражения: на хорионаллантоисную оболочку, в аллотоисную и амниотическую, желточный мешок, тело эмбриона.
29.Тканевые культуры.
В зависимости от техники приготовления 3 вида клеток:
Однослойные способны размножаться на поверхности химически нейтрального стекла в виде монослоя;
Суспензионные, размн-я во всем объеме питательной среды;
Органные-цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие исходную структуру.
Приготовление первичной культуры клеток складываются из нескольких этапов: измельчение ткани, разъединение клеток, отмывание полученной суспензии от трипсина.
Индикация:
- цитопатичекое действие- видимые под микроскопом морфологические изменения клеток, вплоть до отторжения от стекла.
Вирусные включения- это скопление вирусных частиц или отделение компонентов вирусов в цитоплазме или ядре клеток.
Бляшки-ограниченные участки, состоящие из дегенеративных клеток. Они видны как светлые пятна на фоне окрашенных клеток.
Цветная проба
Гемадсорбция-способность культур клеток адсорбировать на своей поверхности эритроциты.
Интерференция.
30.Классификация, хим.Состав бактериофагов.
Бактериофаги- вирусы бактерий, обладающие способностью проникать в бактериальные клетки, вызывать их растворение. Имеют форму головастика, некоторые кубической нитевидной формы. Состоят из икосаэдрической головки и хвостого отростка. Внутри хвостого отростка цилиндрический стержень,снаружи- чехол, отросток заканчивается шестиугольной базальной пластинкой с короткими шипами. Фаги состоят из нуклеиновой кислоты и белка. У фагов имеющих форму сперматозойда, двунитчатая ДНК плотно упакована в виде спирали внутри головки. Белки входят в состав оболочки. Кроме структурных белков обнаружены внутренние белки, связанные с нуклеиновой кислотой и белки-ферменты, участвующие во взаимодействии фага с клеткой.
31. Процесс взаимодействия вирулентных фагов и чувствительной к ним бактериальной клетки
Вирулентные фаги могут только увеличиваться в количестве посредством литического цикла. Процесс взаимодействия вирулентного бактериофага с клеткой складывается из нескольких стадий: адсорбции бактериофага на клетке, проникновения в клетку, биосинтеза компонентов фага и их сборки, выхода бактериофагов из клетки.
Первоначально бактериофаги прикрепляются к фагоспецифическим рецепторам на поверхности бактериальной клетки. Хвост фага с помощью ферментов, находящихся на его конце (в основном лизоцима), локально растворяет оболочку клетки, сокращается и содержащаяся в головке ДНК инъецируется в клетку, при этом белковая оболочка бактериофага остается снаружи. Инъецированная ДНК вызывает полную перестройку метаболизма клетки: прекращается синтез бактериальной ДНК, РНК и белков. ДНК бактериофага начинает транскрибироваться с помощью собственного фермента транскриптазы, который после попадания в бактериальную клетку активируется. Синтезируются сначала ранние, а затем поздние иРНК, которые поступают на рибосомы клетки-хозяина, где синтезируются ранние (ДНК-полимеразы, нуклеазы) и поздние (белки капсида и хвостового отростка, ферменты лизоцим, АТФаза и транскриптаза) белки бактериофага. Репликация ДНК бактериофага происходит по полуконсервативному механизму и осуществляется с участием собственных ДНК-полимераз. После синтеза поздних белков и завершения репликации ДНК наступает заключительный процесс - созревание фаговых частиц или соединение фаговой ДНК с белком оболочки и образование зрелых инфекционных фаговых частиц.
Куриный эмбрион Куриный эмбрион
(КЭ) - куриный зародыш, находящийся на разных стадиях эмбрионального развития. В микробиол. практике используют для выделения, культивирования и идентификации вирусов, риккетсий и иногда бактерий. Для лабораторных целей отбирают свежие, оплодотворенные, с хорошо просвечивающей и не имеющей трещин скорлупой КЭ. Инкубацию проводят в гнездах штатива тупым концом яйца вверх в хорошо вентилируемых инкубаторах или термостатах при 37 -37,5 °С, относительной влажности 63-65%. Для заражения отбирают 4- 13-дневные эмбрионы с выраженными кровеносными сосудами, желточным мешком и подвижной тенью. Перед заражением скорлупу яиц обрабатывают спиртом, обжигают и в области введения (чаще над воздушной камерой) смазывают 2% йодной настойкой. Материал или иссл. к-ру вводят, вскрывая или не вскрывая скорлупу, в желточный мешок (риккетсий), в аллантоисную или амниотическую полости (большинство вирусов), наносят на хорион-аллантоисную оболочку. Реже к-ру вводят в тело эмбриона или в/в. Зараженные КЭ помещают в термостат в условиях и на сроки, к-рые зависят от вида микроба и целей исследования. Некоторые данные о результатах заражения можно получить при внешнем осмотре КЭ под микроскопом (инъекция сосудов, потеря подвижности и др.). Однако в большинстве случаев КЭ вскрывают. Для этого после обработки спиртом и йодной настойкой скорлупу срезают выше границы воздушного мешка, пастеровской пипеткой или шприцем отсасывают сначала аллантоисную, а затем амниотическую жидкость, избегая повреждения сосудов и желточного мешка. Эмбрион и хорионаллантоисную оболочку извлекают из скорлупы, помещают в стерильные чашки, промывают стерильной дистил. водой и осматривают. Дальнейший ход исследования эмбриона и его жидкостей зависит от вида микроба или вируса и целей опыта.
(Источник: «Словарь терминов микробиологии»)
Смотреть что такое "Куриный эмбрион" в других словарях:
ЭМБРИОТОКСИЧНОСТЬ - эмбриотоксичность, способность физических, биологических, химических и других агентов оказывать отрицательное действие на развивающийся эмбрион. Эмбриотоксическое действие различных веществ устанавливают путем воздействия ими на самок… … Ветеринарный энциклопедический словарь
Запрос «Куры» перенаправляется сюда; см. также другие значения. ? Домашняя курица … Википедия
Куры Куры украшение любого двора Научная классификация Царство: Животные Тип: Хордовые Класс … Википедия
Большое значение в развитии вирусологии имело введение методов культивирования вирусов в куриных эмбрионах. Для репродукции вируса используют куриные эмбрионы 7-12-дневного возраста, инкубированные в термостате при 37 С. Необходимым условием для правильного развития зародыша является соблюдение определенной влажности воздуха, которую можно создать, поместив в термостат сосуд с водой. Культивирование вирусов в куриных эмбрионах проводится в разных местах эмбриона, который заражают:
1) на хорион-аллантоисную оболочку;
2) в аллантоисную полость;
3) в амниотическую полость;
4) в желточный мешок.
Заражение куриных эмбрионов проводят в боксе с использованием стерильных инструментов. Перед: заражением куриные эмбрионы двукратно протирают ватным тампоном, смоченным спиртом.
Заражение на хорион-аллантоисную оболочку . После дезинфекции яйца осторожно срезают кусочек скорлупы с тупого концы, снимают подскорлупную оболочку - при этом обнаруживается хорион-аллатиоисная оболочка. Инфекционный материал в количестве 0,1-0,2 мл при помощи шприца или пастеровской пипетки наносят па хорион-аллантоисную оболочку. После заражения отверсто закрывают колпачком и просвет между ним и куриным эмбрионом заливают парафином. На другой стороне яйца простым карандашом пишут название инфекционного материала и дату заражения.
Заражение в амниотическую полость. Яйцо овоскопируют и на боковой стороне выбирают участок, где хорион-аллантоис лишен крупных кровеносных сосудов. Этот участок отмечают карандашом. Яйца укладывают на подставку в горизонтальном положении, дезинфицируют и специальным стерильным копьем прокалывают отверстие и скорлупе на глубину 2-3 мм, через которое вводят на это же расстояние иглу с инфекционным материалом непосредственно в амниотическую полость. Для того чтобы вводимая жидкость не вытекала обратно, предварительно делают прокол над воздушным мешком. После чего оба отверстия заливают парафином.
Заражение в аллантоисную полость. Заражение производят и затененном боксе. Отмечают воздушное пространство, скорлупу над воздушным пространством дезинфицируют и через отверстие в скорлупе вводят по направлению к эмбриону иглу шприца с материалом. Если игла попала в аллантоисную полость, то наблюдается смещение тени эмбриона. После заражения отверстие заливают парафином.
Заражение, в желточный мешок. Скорлупу дезинфицируют. Яйцо помещают на подставку тупым концом вправо так, чтобы желточный меток был обращен вверх. Над воздушной камерой в центре прокалывают отверстие. Через отверстие в скорлупе в скорлупе в горизонтальном направлении на глубину 2-3 мм вводят иглу шприца, которая попадает в желточный мешок. Материал вводят в объёме 0,2-0,3 мл. После введения материала отверстие парафинируют.
Температурный режим и длительность инкубации зависят от биологических свойств данного вируса. Инфицированные яйца ежедневно проверяют, овоскопируют для проверки жизнеспособности эмбриона. Если эмбрионы погибают в первые сутки, то причиной этого обычно бывает травма при заражении. Такие яйца выводят из опыта. Наличие вируса в заражённом эмбрионе определяют по характерным изменениям хорион-аллантоисной оболочки зараженного куриного эмбриона. Вирусы, не обладающие гемагпотинирующей активностью, выявляют с помощью РСК. Для выявления вируса в аллантоисной или амниотической жидкостях зараженных эмбрионов ставят РГА.
С тех пор как обнаружили, что вирусы гриппа размножаются в куриных эмбрионах, этот метод стал широко применяться в вирусологии, так как прост в применении и не является дорогим.
Используют 7-9 дневные куриные эмбрионы (полный цикл развития 21 день).
Перед заражением поверхность обрабатывают спиртом, раствором йода, в скорлупе делают отверстие и заражают стерильным шприцем.
Способы заражения: в амниотическую полость, в аллантоисную полость или в желточный мешок. Вирусы размножаются на соответствующих оболочках, накапливаются в полостной жидкости, которую затем и можно собрать для дальнейшего исследования.
Эмбрионы культивируют при 37 град. 3 суток, затем снова обрабатывают скорлупу, вскрывают стерильными инструментами эмбрион и собирают вируссодержащую жидкость. Все работы по заражению и вскрытию производят в боксе.
Культивирование на культурах клеток.
Культуры клеток стали применять в вирусологии в последние десятилетия, это дало возможность культивировать и изучать гораздо более широкий спектр вирусов, так как не все человеческие вирусы возможно выделить на животных или на эмбрионах. Таким образом, современная вирусология пользуется клеточными культурами, которых получено в настоящее время огромное множество.
Разновидности клеточных культур
а) первичные - получают из эмбриональной ткани, путем ее измельчения, обработки трипсином для дезагрегации (разъединения) клеток и дальнейшего культивирования
in vitroв специальной культуральной жидкости.
б) перевиваемые – получают из опухолевой ткани, они отличаются тем, что их можно культивировать неограниченно долго, меняя только культуральную среду и посуду.
В процессе культвирования на стекле получается монослой: то есть один слой клеток.
Теперь можно заразить эти клетки исследуемым материалом с предполагаемым вирусом, либо уже имеющимися вирусами. Посуду с клетками, зараженными и незараженными, культивируют в термостате при 37 градусах.
Процесс накопления вирионов в клеточной культуре длится примерно 48 – 72 часа.
Подбирая подходящие культуры, можно культивировать практически все человеческие вирусы.
Следующая стадия изучения – индикация и идентификация вирусов.
Методы индикации.
Индикация – это обнаружение вирусов непосредственно в исследуемом материале или в культуральной жидкости или в зараженных клетках.
I.Если вирионы находятся в жидкости, то обнаружить их можно с помощью реакции гемагглютинации.
Суть реакции: некоторые виды вирусов способны спонтанно склеивать (то есть вызывать гемагглютинацию) каких – либо эритроцитов. Например, вирионы гриппа склеивают эритроциты кур, некоторые аденовирусы – эритроциты крысы и т.д.
Таким образом, с помощью взвеси эритроцитов в физиологическом растворе можно обнаружить вирусы в вируссодержащей жидкости.
II. Если вирусы размножаются в клеточной культуре, но являются гемагглютинирующими, то можно обнаружить их с помощью реакции гемадсорбции: на культуру наносят взвесь эритроцитов, инкубируют, сливают – если культура заражена, то эритроциты прилипнут прямо к зараженным клеткам – это видно в световой микроскоп.
III.Другие эффекты:
а) вирусы вызывают разрушение монослоя – это называется цитопатогенное действие вируса - ЦПД.
б) вирусы вызывают морфологические изменения клеток: внутриклеточные или внутриядерные включения, образование синцития, симпластов (то есть слияние нескольких клеток в одно образование из-за повреждения клеточных мембран).
Выделение и культивирование вирусов
Выделение и идентификация возбудителя - «золотой стандарт» в диагностике вирусных инфекций.
Культуры клеток
Вирусы размножаются только в живых клетках, и выделение возбудителя в заражённой культуре клеток - один из основных методов диагностики вирусных инфекций. Поскольку большинство патогенных вирусов отличает тканевая и типовая специфичность, то почти к каждому вирусу можно подобрать соответствующие клеточные или тканевые культуры, а также создать стандартные условия культивирования (наличие клеток одного типа). Размножение вируса обеспечивают чувствительные (пермиссивные) клетки. Поэтому при выделении неизвестного возбудителя проводят одномоментное заражение 3-4 культур клеток, предполагая, что одна из них может оказаться пермиссивной. Культуры клеток получают диспергированием соответствующих органов и тканей, но чаще используют эмбриональные ткани (человека и животных) либо трансформированные опухолевые клетки. При помещении на соответствующую плоскую поверхность клеточные культуры обычно растут в виде монослоя.
Первично-трипсинизированные культуры. Суспензии клеток получают гомогенизированием соответствующих тканей, предварительно обработанных трипсином. Культуры часто представлены клетками смешанного типа и не подлежат повторному культивированию. Жизнеспособность таких культур составляет 2-3 нед.
Полуперевиваемые линии клеток представлены диплоидными клетками человека и животных. Культуры ограниченно пригодны к повторному диспергированию и росту (как правило, не более 20-30 пересевов), сохраняя при этом жизнеспособность и не подвергаясь спонтанной трансформации.
Перевиваемые линии клеток (гетероплоидные культуры) представлены клетками, подвергнутыми длительному культивированию и спонтанным трансформациям. Культуры способны к многократному диспергированию и перевиванию. Работа с ними менее трудоёмка по сравнению с приготовлениями первичных культур; перевиваемые клетки относительно одинаковы по своей морфологии и стабильны по свойствам.
Культуры органов
Не все виды клеток способны расти в виде монослоя, в некоторых случаях поддержание дифференцированных клеток возможно только в культуре органа. Обычно это суспензия ткани, обладающей специализированной функцией, также обозначаемая как культура переживающей ткани.
Куриные эмбрионы (рис. 1-20) - практически идеальные модели для культивирования некоторых вирусов (например, гриппа и кори). Замкнутая полость эмбриона препятствует проникновению микроорганизмов извне, а также развитию спонтанных вирусных инфекций. Эмбрионы применяют для первичного выделения вирусов из патологического материала; для пассирования и сохранения их, а также для получения необходимых количеств вируса. Некоторые возбудители (например, герпесвирусы) вызывают характерные изменения (по ним можно распознавать заболевание). Заражение проводят на хорион-аллантоисную оболочку, в амниотическую или аллантоисную полость либо в желточный мешок.
Заражение на хорион-аллантоисную мембрану. Обычно используют 10-12-суточные эмбрионы. Яйца просматривают в проходящем свете, отмечают локализацию воздушного мешка и выбирают область без сосудов. Осторожно удаляют фрагмент скорлупы, освобождают наружную оболочку и отслаивают её осторожным надавливанием. Затем делают отверстие у края воздушного мешка. При отсосе через это отверстие хорион-аллантоисная оболочка отслаивается от наружной оболочки. На неё наносят исследуемый материал, свободный от бактерий и простейших (пропущенный через бактериальные фильтры и обработанный бактерицидами).
Заражение в амниотическую полость. Обычно используют 7-14-суточные эмбрионы, у которых после отслоения хорион-аллантоисной оболочки (см. выше) расширяют отверстие, захватывают пинцетом амниотическую оболочку и выводят через хорион-аллантоисную оболочку. Через неё в амниотическую полость вводят исследуемый материал.
Заражение в аллантоисную полость. 10-суточные эмбрионы заражают через отверстия, сделанные в скорлупе и подлежащих оболочках (см. выше).
Заражение в желточный мешок. Используют 3~8-суточные эмбрионы, у которых в этом возрасте желточный мешок занимает почти всю полость яйца. Заражение проводят через отверстие, сделанное в воздушном мешке
Наблюдение и учёт результатов. В качестве вируссодержащего материала можно использовать содержимое желточного мешка, аллантоисную и амниотическую жидкости либо весь эмбрион, нарезанный вместе с окружающими
тканями на кусочки. Для выявления Рис. 1-20.Схематическое изображение
характерных поражений на хорион- развивающегося куриного эмбриона.
аллантоисной мембране удаляют скорлупу
и наружную оболочку. Затем мембрану извлекают и помещают в стерильную воду. Характер поражений изучают на тёмном фоне.
Животные модели
При невозможности выделить и идентифицировать вирус стандартными методами in vitro инфекционный материал вводят чувствительным к возбудителю животным, и после развития типичного инфекционного процесса проводят повторное заражение чувствительных клеточных культур. Наиболее часто используют мышей, кроликов и обезьян; для выделения некоторых вирусов (например, вирусов Коксаки) заражают мышат-сосунков. Вследствие дороговизны и сложности содержания лабораторных животных, практически повсеместно их вытеснили клеточные культуры. Тем не менее, животные модели активно используют для изучения особенностей патогенеза и формирования иммунных реакций при вирусных инфекциях.