Реакцията е зададена:
1) за откриване на полизахариди, протеини, екстракти от бактерии и други силно диспергирани вещества, рикетсии и вируси, чиито комплекси с аглутинини не могат да се видят при конвенционален RA,
2) за откриване на антитела в серума на пациентите срещу тези високо диспергирани вещества и най-малките микроорганизми.
Под непряка или пасивна аглутинация се разбира реакция, при която антителата взаимодействат с антигени, предварително адсорбирани върху инертни частици (латекс, целулоза, полистирол, бариев оксид и др. или еритроцити на овен, I (0) - човешки кръвни групи)
В реакцията на пасивна хемаглутинация (RPHA) се използва носител еритроцити. Натоварените с антиген еритроцити се слепват в присъствието на специфични антитела към този антиген и се утаяват. Антиген-сенсибилизираните еритроцити се използват в RPHA като еритроцитна диагностика за откриване на антитела (серодиагностика). Ако еритроцитите са заредени с антитела (диагностикум на еритроцитни антитела), тогава може да се използва за откриване на антигени.
Ориз. 3. Схема на RPGA: еритроцитите (1), заредени с антиген (3), се свързват със специфични антитела (4).
постановка. В ямките на полистиролови таблетки пригответе серия от серийни разреждания на серум. В предпоследната ямка внесете - 0,5 ml известен положителен серум и в последната 0,5 ml физиологичен разтвор (контроли). След това към всички ямки се добавя 0,1 ml разреден еритроцитен диагностикум, разклаща се и се поставя в термостат за 2 часа.
Счетоводство. В положителен случай еритроцитите се установяват на дъното на дупката под формата на равномерен слой клетки със сгънат или назъбен ръб (обърнат чадър), в отрицателен случай се установяват под формата на копче или пръстен .
Фиг.4. Счетоводна RNGA (RPGA).
Отчитане на резултатите от комплекта rnga за откриване на ботулинов токсин.
Причинителят на ботулизма - Clostridium botulinum произвежда токсини от седем серовара (A, B, C, D, E, F, G), но серовари A, B, E са по-чести от останалите.Всички токсини се различават по антигенни свойства и могат да да се диференцират в реакциите чрез специфични за типа серуми. За тази цел може да се извърши реакция на пасивна (непряка) хемаглутинация със серум на пациента, в който се очаква наличието на токсин, и с еритроцити, натоварени с антитела на антитоксични антиботулинови серуми от типове А, В, Е. Нормално серумът служи като контрола.
Ориз. 3. Изявление и резултат от RNGA.
Счетоводство. В положителен случай еритроцитите се установяват на дъното на дупката под формата на равномерен слой клетки със сгънат или назъбен ръб (обърнат чадър), в отрицателен случай се установяват под формата на копче или пръстен .
Заключение: В серума на пациента е открит ботулинов токсин тип Е.
Реакция на инхибиране на хемаглутинацията (hrga).
Ориз. 8. Реакция на инхибиране на хемаглутинацията (RTGA) (схема).
Принципът на реакцията се основава на способността на AT да свързва различни вируси и да ги неутрализира, което прави невъзможно аглутинацията на еритроцитите. Визуално този ефект се проявява в "инхибирането" на хемаглутинацията. RTHA се използва при диагностицирането на вирусни инфекции за идентифициране на специфични антихемаглутинини и идентифициране на различни вируси чрез техните хемаглутинини, които проявяват свойствата на Ag.
Типизирането на вируса се извършва в RTGA реакция с набор от специфични за типа серуми. Резултатите от реакцията се вземат предвид при липса на хемаглутинация. Подтипове на вирус тип А с антигени H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 и други могат да бъдат диференцирани в RTGA с набор от хомоложни типово специфични серуми
Ориз. 9. Резултати от RTGA при типизиране на грипния вирус
Символи: - инхибиране на хемаглутинацията (бутон); - хемаглутинация (чадър).
Заключения: Изследваният материал съдържа грипен вирус тип А с антиген H3N2.
Реакция на аглутинация - РА(от лат. аглутинация- свързване) - проста реакция, при която антителата свързват корпускулни антигени (бактерии, еритроцити или други клетки, неразтворими частици с адсорбирани върху тях антигени, както и макромолекулни агрегати). Това се случва в присъствието на електролити, например, когато се добави изотоничен разтвор на натриев хлорид.
Използват се различни варианти на реакцията на аглутинация: разширена, приблизителна, индиректна и др. Реакцията на аглутинация се проявява чрез образуване на люспи или утайка
RA се използва за:
определяне на антитела в кръвния серум на пациенти, например с бруцелоза (реакции на Райт, Хеделсън), коремен тиф и паратиф (реакция на Видал) и други инфекциозни заболявания;
определяне на патогена, изолиран от пациента;
определяне на кръвни групи с помощта на моноклонални антитела срещу еритроцитни алогени.
За определяне на антителата на пациента слагамудължена реакция на аглутинация:добавете към разрежданията на кръвния серум на пациента диагностикум(суспензия от убити микроби) и след няколко часа инкубация при 37 ° C се отбелязва най-високото серумно разреждане (серумен титър), при което настъпва аглутинация, т.е. образува се утайка.
Характерът и скоростта на аглутинацията зависят от вида на антигена и антителата. Пример за това е взаимодействието на диагностикуми (О- и R-антигени) със специфични антитела. Реакция на аглутинация с О-диагностикум(бактерии, убити от топлина, запазвайки термостабилен О антиген)протича под формата на финозърнеста аглутинация. Реакцията на аглутинация с H-diagnosticum (бактерии, убити от формалин, запазващи термолабилния флагеларен H-антиген) е едрозърнеста и протича по-бързо.
Ако е необходимо да се определи патогенът, изолиран от пациента, поставете ориентировъчна реакция на аглутинация,с помощта на диагностични антитела (аглутиниращ серум), т.е. извършва се серотипиране на патогена. Приблизителна реакция се провежда върху предметно стъкло. Към капка диагностичен аглутиниращ серум в разреждане 1:10 или 1:20 се добавя чиста култура на патогена, изолиран от пациента. В близост се поставя контрола: вместо серум се прилага капка разтвор на натриев хлорид. Когато се появи флокулентна утайка в капка със серум и микроби, те поставят обширна реакция на аглутинацияв епруветки с нарастващи разреждания на аглутиниращ серум, към които се добавят 2-3 капки от суспензията на патогена. Аглутинацията се взема предвид от количеството на утайката и степента на избистряне на течността. Реакцията се счита за положителна, ако се забележи аглутинация в разреждане, близко до титъра на диагностичния серум. В същото време се вземат предвид контролите: серумът, разреден с изотоничен разтвор на натриев хлорид, трябва да бъде прозрачен, суспензията от микроби в същия разтвор трябва да бъде равномерно мътна, без утайка.
Различни свързани бактерии могат да бъдат аглутинирани от един и същ диагностичен аглутиниращ серум, което затруднява идентифицирането им. Затова се наслаждавайте адсорбирани аглутиниращи серуми,от които кръстосано реактивните антитела са били отстранени чрез адсорбция от техните сродни бактерии. В такива серуми остават антитела, специфични само за тази бактерия. Приготвянето на монорецепторни диагностични аглутиниращи серуми по този начин е предложено от A. Castellani (1902).
Реакцията на индиректна (пасивна) хемаглутинация(RNHA, RPHA) се основава на използването на еритроцити с антигени или антитела, адсорбирани на повърхността, взаимодействието на които със съответните антитела или антигени на кръвния серум на топката кара еритроцитите да се слепват и да падат на дъното на топката. епруветката или клетката впод формата на назъбена утайка (фиг. 13.2). При отрицателна реакция еритроцитите се утаяват под формата на "копче". Обикновено антителата се откриват в RNHA с помощта на антигенен еритроцитен диагностикум, който представлява еритроцити с адсорбирана натехни антигени. Понякога използваме антитяло еритроцитна диагностика, върху която се адсорбират антитела. Например, ботулиновият токсин може да бъде открит чрез добавяне на еритроцитно антитяло botulinum diagnosticum към него (тази реакция се нарича реакция на обратна индиректна хемаглутинация- РОНГА). RNHA се използва за диагностициране на инфекциозни заболявания, определяне на гонадотропен хормон вурина при установяване на бременност, за откриване на свръхчувствителност към лекарства, хормони и в някои други случаи.
РЕАКЦИЯ НА КУМБС
(тест на Coombs) - метод за определяне на Rh антитела на повърхността на червените кръвни клетки, които причиняват утаяване на глобулини в кръвния серум. Този тест се използва за диагностициране на хемолитична анемия при бебета с Rh несъвместимост, които имат разрушаване на червените кръвни клетки.
Реакция на коаглутинация. Патогенните клетки се определят с помощта на стафилококи, предварително обработени с имунен диагностичен серум. Протеин, съдържащ стафилококи НО,имащи афинитет към Fc фрагмента на имуноглобулините, неспецифично адсорбират антимикробни антитела, които след това взаимодействат с активни центрове със съответните микроби, изолирани от пациенти. В резултат на коаглутинацията се образуват люспи, състоящи се от стафилококи, диагностични серумни антитела и определяния микроб.
Реакция на инхибиране на хемаглутинацията(RTGA) се основава на блокада, потискане на антигени на вируси от антитела на имунен серум, в резултат на което вирусите губят способността си да аглутинират червените кръвни клетки (фиг. 13.3). RTHA се използва за диагностициране на много вирусни заболявания, чиито причинители (грип, морбили, рубеола, кърлежов енцефалит и др.) Могат да аглутинират еритроцитите на различни животни.
- Група лекари пристигнаха в Индия чрез СЗО, за да идентифицират пациенти с полиомиелит и да помогнат при общата ваксинация срещу полиомиелит. В едно от изследваните села при лекарите е заведено 6-годишно момче от многодетно семейство, което се е разболяло преди 5 дни. Температурата внезапно се повиши, главата ме болеше много, имаше многократно повръщане, болки в ръцете и краката. При преглед: висока температура, тежка слабост, менингеални симптоми, намален мускулен тонус на десния крак, рязко отслабени сухожилни рефлекси, стъпалото виси. При пункция на гръбначномозъчния канал гръбначно-мозъчната течност изтича под повишено налягане, увеличава се броят на лимфоцитите, не се изолират бактерии. Поставена е предварителна диагноза "паралитична форма на полиомиелит". Как може да се е заразило момчето? Как се провежда специфичната активна профилактика на полиомиелита? Има ли риск от заразяване на други деца в това семейство, какво трябва да се направи?
Отговор:Момчето може да се зарази по фекално-орален път чрез храна, вода, а също и по въздушно-капков път. Основната мярка за профилактика на полиомиелит е имунизацията с жива култура от ваксина от 3 серотипа на щамовете Sabin.В Русия се използва полиомиелитна ваксиназа перорално приложение, произведено от Института по полиомиелит и вирусен енцефалит. М.П. Чумаков. Ваксината е тривалентен препарат от атенюирани щамове Sabin на полиовирус типове 1, 2, 3, получени в първична култура от бъбречни клетки на африканска зелена маймуна. . Рутинни ваксинации срещу полиомиелит подлежат на деца на възраст от 3 месеца до 6 години. Ваксинациите с перорална полиомиелитна ваксина се извършват чрез 2 или 4 капки от ваксината перорално три пъти на 3, 4, 5 и 6 месеца с трикратна реваксинация на 18, 20 месеца и 14 години. Болното момче трябва да бъде прието в болница, а всички останали деца в това семейство трябва да бъдат ваксинирани с жива полиомиелитна ваксина.
- Състав и употреба на противогрипна ваксина тривалентна полимерна субединица течност (grippol)
Това е молекулярна ваксина. Състав: повърхностен AG на грипния вирус от три подтипа (A / H1N1, A / H3N2, B). Приложение: за профилактика на грип
Изпитен билет №23
Реакцията на непряка хемаглутинация (RIHA)
Използването на адсорбирани диагностични препарати се основава на принципа на имунологично разпознаване на повърхностни структури, който постоянно се прилага в природата. От тази гледна точка няма принципни разлики между използването например на микробна клетка или изкуствен носител, зареден с антиген (антитела). За основа на сорбираните препарати се използват различни носители - микробни клетки, еритроцити, латекс, бентонин, холестерол, сефадекс, дерматол, активен въглен, гъбични спори и др.
След работата на A.T.Kravchenko (1945) еритроцитите, лишени от жизнеспособност и фиксирани с различни химически реагенти, станаха най-широко използвани като носители на антиген или антитела. На принципа на използване на еритроцити (както естествени, така и фиксирани) като носител на антигена, реакцията на индиректна (пасивна) хемаглутинация е широко разпространена.
Предложението за използване на реакцията на индиректна хемаглутинация (IHA) за диагностични цели възникна въз основа на предварително разработени знания за високата сорбционна активност на еритроцитите. В сравнение с много други носители на антигени и антитела, еритроцитите имат някои предимства в реакцията на индиректна хемаглутинация. Първо, в изотоничните физиологични разтвори те образуват доста стабилна кохезия и не се утаяват за кратко време. Второ, червените кръвни клетки на един и същи животински вид са еднакви по размер. И накрая, еритроцитите сравнително лесно директно или в резултат на специална обработка прикрепят различни серологично активни компоненти.
Създаването на еритроцитни диагностикуми от стабилизирани еритроцити позволява да се преодолеят трудностите, възникващи при използването на нативни еритроцити.
При изследване на еритроцити, третирани с различни фиксатори, са установени някои от техните общи свойства:
По морфология те практически не се различават от пресните;
Не се хемолизира в хипотонични разтвори, във вода и след замразяване-размразяване;
Може да се изсуши чрез замразяване;
Техните повърхностни структури запазват способността си да бъдат химически модифицирани (напр. танин, диазо съединения) и да реагират с антигени и антитела.
Основният критерий за качеството на фиксираните еритроцити е възможността за тяхното използване за получаване на сенсибилизирани препарати при липса на неспецифична аглутинация в стабилизиращи течности.
Подготовката на повърхността на еритроцитите с цел повишаване на сорбционния капацитет за антигени е важна при проектирането на диагностични препарати. Особено разпространено е третирането на еритроцитите с танин.
Под негово влияние се променят антигенните свойства на еритроцитите (пропускливост, скорост на утаяване), повишава се устойчивостта им към хемолитичните ефекти на някои мастни киселини. Основното обаче се постига - танизираните еритроцити имат много по-висока сорбционна способност на протеини, което в момента се използва широко в производството на висококачествени антигенни и антитела диагностикуми.
Наред с танизирането на еритроцитите, за производството на еритроцитни диагностикуми и получаването на антигенен носител се използват химически реагенти като бромелаин, триопсин и калиев периодат, които също модифицират мембраните на еритроцитите.
След подготовката на повърхността на еритроцитите се извършва най-важният процес - процесът на хемосенсибилизация - последният етап в производството на еритроцитни диагностикуми.
За укрепване на връзката между носителя и антигена се използват различни конюгиращи вещества - бисдиазобензидин, дифлуородинитробензин, цианид хлорид, кадмиев хлорид и оцетна киселина, бромен хлорид, формалдехид, глутаралдехид, цианоген бромид, риванол, амидол и др.
Използването на конюгиращи вещества помага да се премахнат недостатъците, които имат танизираните еритроцити, използвани за сенсибилизация без конюгиращи вещества.
Най-широко използваните конюгиращи вещества са хромов хлорид, глутаралдехид, диазол черен С и амидол. Процесът на сенсибилизация с хромов хлорид протича много бързо - от 4 до 10 минути, което привлича вниманието на изследователите. В този случай се използват концентрации на хромен хлорид от 0,05 до 2%, рН не по-ниско от 5,0 при температура на реакционната смес от 20-250 С. В процеса на сенсибилизация с хромен хлорид, карбоксилните групи на протеините на еритроцитната мембрана са активирани. В резултат на това се образува ковалентна връзка между еритроцитната мембрана и сенситина.
Реакцията на непряка хемаглутинация има висока специфичност, тъй като аглутинацията на еритроцитите възниква в резултат на взаимодействието на антигена с антителата, адсорбирани върху еритроцитите. Неговата отличителна черта е високата чувствителност: в него се откриват 0,02-0,05 μg протеин на антитялото. По отношение на чувствителността, той значително надвишава реакциите на имунодифузия, имунофлуоресценция, радиална имунодифузия, фиксиране на комплемента и неутрализация. RNGA е по-малко чувствителен от методите на радиоимуноелектрофореза, определяне на количеството протеин на радиоактивни антитела в имуносорбента, ензимен имуноанализ.
Предимствата на RNGA включват достатъчно висока възпроизводимост, лекота на изпълнение и необходимостта от минимални количества съставки, особено при използване на микрометода.
През последните години RNHA намери широко приложение в диагностиката на инфекциозен ринотрахеит, диария, аденовирусна инфекция, рота- и коронавирусна инфекция, параинфлуенца-3 и респираторна синцитиална инфекция.
Даваме пример за производството и използването на еритроцитна диагностика за откриване на антитела срещу рота- и коронавирусни инфекции.
Методът за приготвяне на диагностикуми на антитела за откриване на рота- и коронавирусни антигени в RNGA е както следва: получаване на суспензия от еритроцити; фиксиране на техните акролеини; танизиране, което позволява получаване на стабилна сорбция на необходимия протеин върху еритроцитите; сенсибилизация на танизирани еритроцити с имуноглобулини; определяне на спецификата на изготвения диагностикум. Приготвянето на суспензия от еритроцити се извършва чрез вземане на кръв от клинично здрав овен в колба със стъклени перли. След дефибриниране на кръвта еритроцитите се промиват 3-5 пъти с изотоничен (0,9%) разтвор на натриев хлорид чрез центрофугиране за 15-20 минути при 400g.
За да се стабилизират червените кръвни клетки, те се третират с акролеин. Както знаете, действието му е малко по-меко от формалдехида и осигурява стабилност и по-висока активност на еритроцитите. За тази цел равни обеми от 10% суспензия от еритроцити се смесват с 0,2% разтвор на акролеин, приготвен във фосфатен буферен разтвор (PBS) с рН 7,2. Получената суспензия се държи 30 min при 37°C, като се разбърква добре, последвано от освобождаване на акролеин чрез многократно центрофугиране за 5 min при 600-800 g, докато специфичната миризма изчезне напълно. Предимството на така приготвените еритроцити е, че се събират за в бъдеще, могат да се съхраняват дълго време, без да се подлагат на хемолиза.
След това стабилизираните еритроцити в 10% концентрация се държат при 2-4 °C в PBS с рН 7,2 в продължение на два месеца.
За да се увеличи сорбционната способност и седиментацията на еритроцитите, е необходимо да се танизират чрез смесване на равни части от 10% суспензия от промити еритроцити и разтвор на танин в PBS и рН 7,2 при разреждане 1:30 000. Сместа се разбърква старателно и се държи при 370 С в продължение на 15 минути, след което еритроцитите се промиват старателно от танин два пъти в PBS с рН 7,2 и три пъти с изотоничен разтвор на натриев хлорид с рН 7,2-7,4.
Оптималното време за гарантиране на получаването на висококачествени еритроцитни диагностикуми е тяхната сенсибилизация в рамките на 24-48 часа след третирането им с танин.
В процеса на приготвяне на диагностикуми като разтворител и консервант се използва 0,3% фенолизиран изотоничен разтвор на натриев хлорид с 0,1% нормален заешки или конски серум, предварително инактивиран при 56°C за 30 минути и адсорбиран от нормални овчи еритроцити.37°C за 30 мин.
Сенсибилизирането на танизираните еритроцити трябва да се извършва с хиперимунен серум, съответно срещу говежди рота- и коронавируси (произведен от Всеруския изследователски институт по експериментална ветеринарна медицина Я. Р. Коваленко). В същото време сенсибилизиращата доза (концентрация на протеин) на антиротавирусния имунен серум е 280 μg/ml, а тази на имунния серум към коронавирус е 260 μg/ml.
Сенсибилизацията се извършва чрез смесване на равни обеми танизирани еритроцити и имунен серум, предварително загрят за 30 минути при 560C в оптимална концентрация. Освен това се добавят 3 части изотоничен разтвор на натриев хлорид с рН 7,2 и 5 части 0,1% разтвор на хромен хлорид. Сместа, като се разбърква от време на време, се оставя на стайна температура за 5 минути. След определеното време сместа се промива старателно с PBS с рН 7,2 и след това приготвените еритроцитни диагностикуми се ресуспендират в консервант до 1% концентрация. Приготвеният диагностикум запазва основните си качества 8 месеца, ако се съхранява при 4°C.
На всички етапи от производството на диагностикуми се наблюдава самоаглутинацията. Специфичността на подготвените диагностикуми се определя чрез поставяне на RNGA, където като антигени се използват стандартни диагностикуми на RTI вируси, PG-3, аденовируси, вирусна диария, както и рота- и коронавирусни антигени.
При настройване на RNHA се приготвят серийни двойни разреждания на изследвания вирус-съдържащ материал (20-50% суспензия от фекални проби), след което към всяка ямка се добавя равен обем еритроцитна диагностика. Плаките трябва да се разклатят старателно няколко пъти, да се оставят на стайна температура, докато еритроцитите се утаят напълно в контролата. Показател за положителна реакция е аглутинацията на еритроцитния диагностикум с интензитет на аглутинация 2+ в титър 1:4 и повече.
Сайтът предоставя справочна информация само за информационни цели. Диагностиката и лечението на заболяванията трябва да се извършват под наблюдението на специалист. Всички лекарства имат противопоказания. Необходим е експертен съвет!
Серологични кръвен анализе метод за лабораторно изследване на определени антигени или антитела ( специфични протеини) в серума на пациента въз основа на имунните отговори на организма. Този метод се прилага, когато диагностикаинфекциозни заболявания за установяване наличието на антитела в кръвта на пациента към определен вид вирус или бактерия, както и за определяне на кръвната група.Проучван материал
На първо място, за серологичен анализ се използва биологичен материал, събран от пациента:- кръвен серум
- слюнка
- фекална материя
- почвата
Метод за анализ или вземане на кръвна проба
Този анализ не изисква специална подготовка на пациента. Вземането на кръв се извършва сутрин на празен стомах и се извършва в лечебните зали на лечебните заведения, съгласно общоприетите хематологични методи. За серологично изследване вземането на кръв се извършва по два метода: венозна кръв се взема от кубиталната вена на пациента и капилярна от безименния пръст. Кръвта се поставя в стерилни запечатани епруветки.Характеристики на кръвния транспорт и съхранението на серума
Веднага след вземането на кръвта тя се транспортира в специална лаборатория, където на същия ден се приготвя серумът. Серумът се съхранява не повече от 4-6 дни в хладилник при температура 2-4 градуса. Ако е необходимо по-дълго съхранение, серумът се замразява. За да се избегне нарушаване на качеството на серума, е разрешено да се замрази веднъж и съответно да се размрази. При дългосрочно съхранение антителата губят свойствата си и стават частично неактивни, най-чувствителни към замразяване са имуноглобулините от класа М. След размразяване на серума е необходимо да се разбърка старателно до хомогенна маса, която помага да се възстанови концентрацията на антитела, съдържащи се в този серум.
За какво се използва серологията?
Серологичните лабораторни диагностични методи се използват за откриване на заболявания като ехинококоза, трихинелоза, токсокароза, описторхоза, цистицеркоза, токсоплазмоза, амебиаза, ламблиоза, за да се определи ефективността на курса на лечение и накрая да се открие рецидив на заболяването след пълно възстановяване на пациента.Основни методи за серологична диагностика
Имунофлуоресцентна реакция (RIF)
Тази реакция е индиректна версия на серологично изследване, т.е. извършва се на два етапа. На първия етап необходимото антитяло се открива в циркулиращия комплекс антиген-антитяло с помощта на антиглобулин, който е подобен по структура на имунните серумни протеини. Идентифицирането на желаното антитяло е възможно и при изследване на предварително приготвен антигенен препарат под флуоресцентен микроскоп, без използване на антиглобулини.Имунофлуоресцентната реакция е много времеемък процес, който изисква много време и отговорност от специалист. Реакцията започва с приготвянето на разтвори, след което серумите и техните контролни проби се подлагат на титруване ( процес, който позволява определянето на съдържанието на определено вещество чрез постепенно смесване на тестов разтвор с контролирано количество реагент). Предварително приготвените разреждания и техните контролни проби се нанасят внимателно върху предметни стъкла с антиген. След това препаратите се подлагат на инкубиране, последвано от измиване и сушене на въздух. Тънък слой антисерум се нанася върху предметните стъкла, съдържащи антиген, след което препаратите се инкубират повторно и се повтаря цялата предишна верига от действия, завършваща със сушенето на препарата. В резултат препаратът върху предметно стъкло се обработва с глицерол и се изследва под флуоресцентен микроскоп.
Резултатите от реакцията се оценяват по четиристепенна скала, която се характеризира с интензитета на повърхностния жълто-зелен блясък на антигенните клетки:
+
много слаб блясък на клетката, забележим само по нейната периферия
++
слаб блясък на клетъчната периферия, но с ясно видим зелен оттенък
+++/++++
яркозелен блясък на клетъчната периферия
Реакционният титър се счита за такова серумно разреждане, при което най-малко 50% от антигенните клетки показват ясен повърхностен блясък, тоест резултатът от реакцията +++
или ++++
. Стойността на реакционния диапазон е от 1/80 до 1/100.
Интензивността на реакцията зависи от броя на утаените еритроцити на дъното на образуваните ямки:
–
отрицателна реакция, която се характеризира с отлагане на еритроцити на дъното на ямките под формата на малък пръстен с гладки ръбове или "копчета"
+
ниска интензивност, тази реакция се характеризира с малки единични отлагания на дъното на отвора. Неаглутинираните еритроцити образуват "малък пръстен" в центъра на ямката
++
средна интензивност, характеризира се с образуването на "широк плътен пръстен" от неаглутинирани еритроцити на дъното на ямката
+++
интензивна реакция, аглутинираните еритроцити образуват така наречените "чадъри", в центъра на които ясно се виждат пръстени, образувани от утаени неаглутинирани еритроцити
++++
рязко интензивна реакция, при която всички еритроцити се аглутинират и, образувайки "чадъри", покриват дъното на дупките.
Титърът на тази реакция се счита за последното разреждане на серума, при което се открива поне очевидна аглутинация на еритроцитите +++
, тоест с интензивна или рязко интензивна реакция.
Надеждността и качеството на серологичните диагностични методи зависят от организацията на вътрешния и външния лабораторен контрол, състоящ се от няколко независими процедури, предназначени да оценят качеството на резултатите от анализа.
Реакцията на непряка (пасивна) хемаглутинация (RIHA) се основава на факта, че еритроцитите, ако разтворим антиген се адсорбира на тяхната повърхност, придобиват способността да аглутинират при взаимодействие с антитела срещу адсорбирания антиген. Схемата на RNGA е показана на фиг. 34. RNHA се използва широко в диагностиката на редица инфекции.
Ориз. 34. Схема на реакцията на пасивна хемаглутинация (RPHA). A - получаване на еритроцитна диагностика: B - RPHA: 1 - еритроцит: 2 - изследван антиген; 3 - еритроцитен диагностикум; 4 - антитяло към изследвания антиген: 5 - аглутинат
Настройка на реакцията. Тестовият серум се нагрява в продължение на 30 минути при 56 ° C, разрежда се последователно в съотношение 1:10 - 1:1280 и се излива в 0,25 ml в епруветки или ямки, където след това се добавят 2 капки еритроцитна диагностика (еритроцити с антиген адсорбирани върху тях).
Контроли: суспензия от еритроцитна диагностика с очевидно имунен серум; суспензия на диагностикум с нормален серум; суспензия от нормални еритроцити с тествания серум. При първата контрола трябва да има аглутинация, при втората и третата не трябва да има.
С помощта на RIGA е възможно да се определи неизвестен антиген, ако известните антитела са адсорбирани върху еритроцитите.
Реакцията на хемаглутинация може да се настрои в обем от 0,025 ml (микрометод), като се използва микротитър Takachi.
тестови въпроси
1. Какво означава положителен RGA резултат между еритроцитите и материала, изследван за наличие на вируса?
2. Ще настъпи ли аглутинация на еритроцитите, ако към тях се добави вирус и съответния серум? Как се нарича реакцията, която разкрива това явление?
Упражнение
Обмислете и регистрирайте резултата от RIGA.
реакция на утаяване
При реакцията на утаяване се утаява специфичен имунен комплекс, състоящ се от разтворим антиген (лизат, екстракт, хаптен) и специфично антитяло в присъствието на електролити.
Мътният пръстен или утайка, образувани в резултат на тази реакция, се наричат утайка. Тази реакция се различава от реакцията на аглутинация главно по размера на частиците на антигена.
Реакцията на утаяване обикновено се използва за определяне на антигена при диагностицирането на редица инфекции (антракс, менингит и др.); в съдебната медицина - за определяне вида на кръвта, спермата и др.; при санитарно-хигиенни изследвания - при установяване на фалшифициране на продукти; с негова помощ определят филогенетичната връзка на животните и растенията. За реакцията ви трябва:
1. Антитела (преципитини) - имунен серум с висок титър на антитела (не по-нисък от 1:100 000). Титърът на преципитиращия серум се определя от най-високото разреждане на антигена, с който той реагира. Серумът обикновено се използва неразреден или разреден 1:5 - 1:10.
2. Антиген - разтворени вещества от протеинова или липоидна полизахаридна природа (пълни антигени и хаптени).
3. Изотоничен разтвор.
Основните методи за провеждане на реакцията на утаяване са: реакция на пръстеновидно утаяване и реакция на утаяване в агар (гел).
внимание! Всички компоненти, участващи в реакцията на утаяване, трябва да бъдат напълно прозрачни.
Реакция на пръстеновидно утаяване. 0,2-0,3 ml (5-6 капки) серум се добавят към епруветката за утаяване с помощта на пипета на Пастьор (серумът не трябва да пада върху стените на епруветката). Антигенът внимателно се наслоява върху серума в същия обем, като се излива с тънка пастьорска пипета по стената на епруветката. Епруветката се държи в наклонено положение. При правилно наслояване трябва да се получи ясна граница между серума и антигена. Внимателно, за да не се смеси течността, поставете епруветката в статив. При положителен резултат от реакцията на границата на антигена и антитялото се образува мътен "пръстен" - утайка (виж фиг. 48).
Реакцията е последвана от редица контроли (Таблица 18). Последователността на въвеждане на реакционните съставки в епруветката е много важна. Не можете да наслоите серума върху антигена (в контролата - върху изотоничния разтвор), тъй като относителната плътност на серума е по-голяма, той ще потъне на дъното на епруветката и границата между течностите няма да бъде открита .
Таблица 18
Забележка. + наличието на "пръстен"; - липса на "пръстен".
Резултатите се записват след 5-30 минути, в някои случаи след час, както винаги, започвайки с контроли. "Пръстенът" във 2-ра епруветка показва способността на имунния серум да влезе в специфична реакция със съответния антиген. В 3-5-та епруветка не трябва да има "пръстени" - няма кореспондиращи помежду си антитела и антигени. "Пръстенът" в 1-ва епруветка - положителен резултат от реакцията - показва, че тестваният антиген съответства на взетия имунен серум, липсата на "пръстен" ("пръстен" само във 2-ра епруветка) показва тяхното несъответствие - отрицателна реакция резултат.
Реакция на утаяване в агар (гел). Особеността на реакцията е, че взаимодействието на антигена и антитялото се осъществява в плътна среда, т.е. в гел. Получената утайка дава мътна ивица в дебелината на средата. Липсата на лента показва несъответствие между реакционните компоненти. Тази реакция се използва широко в биомедицинските изследвания, по-специално при изследването на образуването на токсини в причинителя на дифтерия.
тестови въпроси
1. Каква е основната разлика между реакцията на аглутинация и утаяване?
2. Защо мътните съставки не могат да се използват в реакцията на утаяване?
Упражнение
1. Настройте реакцията на пръстеновидно утаяване и изчертайте резултата.
2. Проучете естеството на взаимодействието на антигена с антитялото в реакцията на утаяване на агар, изчертайте резултата (вземете чашата от учителя).
Реакция на лизис (имунна цитолиза)
Имунният лизис е разпадането на клетките под въздействието на антитела със задължителното участие на комплемента. За реакцията ви трябва:
1. Антиген – микроби, еритроцити или други клетки.
2. Антитяло (лизин) - имунен серум, по-рядко серум на пациента. Бактериолитичният серум съдържа антитела, участващи в лизиране на бактерии; хемолитични - хемолизини, които допринасят за лизиране на червените кръвни клетки; за лизиране на спирохети са необходими спирохетолизини, клетки - итолизини и др.
3. Допълване. Повечето допълват в серума на морски свинчета. Този серум (смес от няколко животни) обикновено се използва като допълнение. Пресният (местен) комплемент е нестабилен и лесно се разрушава при нагряване, разклащане, съхранение, така че може да се използва не повече от два дни след получаване. За да се запази комплементът, към него се добавят 2% борна киселина и 3% натриев сулфат. Тази добавка може да се съхранява при 4°C до две седмици. Сухият комплемент се използва по-често. Преди употреба се разтваря в изотоничен разтвор до първоначалния обем (посочен на етикета).
4. Изотоничен разтвор.
Реакция на хемолиза(Таблица 19). За реакцията ви трябва:
1. Антиген - 3% суспензия от промити овчи еритроцити в размер на 0,3 ml еритроцитна утайка и 9,7 ml изотоничен разтвор.
2. Антитяло - хемолитичен серум (хемолизин) срещу овчи еритроцити; обикновено се приготвя в производството, лиофилизира се и титърът е посочен на етикета.
Титърът на хемолизина е най-високото серумно разреждане, при което настъпва пълна хемолиза на 3% суспензия от еритроцити в присъствието на комплемент. За реакцията на хемолиза хемолизинът се взема в троен титър, т.е. той се разрежда 3 пъти по-малко, отколкото преди титъра. Например, ако серумният титър е 1:1200, серумът се разрежда 1:400 (0,1 ml серум* и 39,9 ml изотоничен физиологичен разтвор). Необходим е излишък от хемолизин, тъй като част от него може да бъде адсорбирана от други компоненти на реакцията.
* (Не трябва да се вземат по-малко от 0,1 ml серум - точността на измерване страда.)
3. Комплементът се разрежда 1:10 (0,2 ml комплемент и 1,8 ml изотоничен физиологичен разтвор).
4. Изотоничен разтвор.
Таблица 19. Схема на реакцията на хемолиза
Отчитане на резултатите. При правилно зададена реакция в първата епруветка ще настъпи хемолиза - съдържанието й ще стане прозрачно. В контролите течността остава мътна: във 2-ра епруветка липсва комплемент за началото на хемолизата, в 3-та епруветка няма хемолизин, в 4-та епруветка няма нито хемолизин, нито комплемент, в 5-та епруветка, антигенът не съвпада с антитялото,
Ако е необходимо, хемолитичният серум се титрира съгласно следната схема (Таблица 20).
Преди титруване се приготвя първоначално серумно разреждане 1:100 (0,1 ml серум и 9,9 ml изотоничен физиологичен разтвор), от което се правят необходимите разреждания, например:
От тези разреждания 0,5 ml серум се добавят към епруветките за титруване, както е показано в таблица. двадесет.
Таблица 20. Схема на титруване на хемолитичен серум (хемолизин)
В примера, даден в табл. 20, титърът на хемолитичния серум е 1:1200.
Когато се използва пресен хемолитичен серум, той трябва да бъде инактивиран, за да се разруши неговият комплемент. За да направите това, той се нагрява в продължение на 30 минути при 56 ° C на водна баня или в инактиватор с термостат. Последният метод е по-добър: той елиминира възможността за прегряване на серума, т.е. неговата денатурация. Денатурираните серуми не са подходящи за тестване.
реакция на бактериолиза. При тази реакция бактериите се допълват в присъствието на подходящ (хомоложен) серум. Схемата на реакцията е фундаментално подобна на схемата на реакцията на хемолиза. Разликата е, че след двучасова инкубация всички епруветки се посяват върху петриеви панички със среда, благоприятна за микроорганизма, взет в експеримента, за да се установи дали е лизиран. При правилно зададен опит в посевите от 2-ра-5-та епруветки (контроли) трябва да има изобилен растеж. Липсата на растеж или слабият растеж на културата от 1-ва епруветка (експеримент) показва смъртта на микробите, т.е. че те са хомоложни на антитялото.
внимание! Реакцията на бактериолиза трябва да се проведе при асептични условия.
тестови въпроси
1. Какво ще се случи с еритроцитите, ако се използва дестилирана вода вместо изотоничен разтвор на натриев хлорид? Какво стои в основата на това явление?
2. Каква реакция ще настъпи, когато еритроцитите взаимодействат с хомоложен имунен серум при липса на комплемент?
Упражнение
Настройте реакцията на хемолиза. Запишете и начертайте резултата.
Подобна информация.