Агглютинации реакция Агглютинации реакция

(РА) - способ выявления и количественного определения Аг и Ат, основанный на их способности к образованию видимых невооруженным глазом агломератов. В д-ке инфекц. болезней или в др. целях применяется для идентификации неизвестных микробов и клеток, для определения присутствия и количества Ат в с-ке крови и др. жидкостях. Принцип определения основан на специфичности взаимодействия Аг и Ат и состоит в нахождении известного по неизвестному. Существует много вариантов РА: количественные и качественные, пробирочные и на стекле, объемные и капельные, обычные, ускоренные и экспресс-методы. Для постановки РА необходимы: 1) с-ка крови. В варианте с определением вида (вара) бактерий используют производственные агглютинирующие с-ки, изготовляемые путем иммунизации кроликов. В варианте с определением вида Ат берут с-ку крови, получаемую от иссл. людей или животных. С-ка должна быть стерильной и не содержать взвешенных частиц. Готовят основное разведение на физ-растворе. Оно должно быть в 2 -4 раза ниже диагностического титра при данном заболевании; 2) Аг . В варианте реакции с определением типа Ат используют производственные диагностикумы; в варианте с определением Аг диагностикумы готовят сами в виде 1 -3-миллиардной взвеси на физрастворе 18-20-часовой агаровой (реже бульонной) к-ры иссл. микроба, инактивированной прогреванием на водяной бане при 70°С в течение 1 ч или 24-часовой инкубацией при 37°С с формалином (конечная концентрация 0,2%); 3) электролит в виде физраствора. Техника постановки объемной серийной пробирочной РА для определения титра Ат в с-ке: из основного разведения с-ки готовят несколько рядов рабочих разведении. Число рядов зависит от количества взятых в опыт диагностикумов, число и факторы разведения определяются диагностическим титром предполагаемого заболевания. В ряду по меньшей мере должны быть разведение, соответствующее диагностическому титру Ат, два разведения ниже и два разведения выше его. напр., если диагностический титр равен 1:100, то при объемном способе постановки РА должны быть приготовлены следующие разведения с-ки: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1"400; при капельном методе первое разведение (1:25) не нужно, зато необходимо еще одно более высокое разведение - 1:800. В научных исследованиях с-ку титруют до отрицательной реакции. Разводят ее следующим образом: во все опытные пробирки, кроме 1-й, наливают по 0,25 мл физраствора при постановке реакции в объеме 0,5 мл и по 0,5 мл при постановке реакции в объеме 1 мл. В 1-ю и 2-ю пробирки вливают по 0,25 (0,5) мл основного разведения с-ки, из 2-й пробирки, в к-рой объем и разведение с-ки увеличились в 2 раза, 0,25 (0,5) мл переносят в 3-ю, из 3-й в 4-ю и т.д. до последней, из к-рой 0,25 (0,5) мл для уравновешивания объемов выливают во все. Каждое разведение с-ки осуществляют с помощью отдельной пипетки. Если в опыт берут несколько диагностикумов, то для каждого из них готовят таким же способом свой ряд разведении. В каждое разведение с-ки доливают диагностикум в объеме, равном объему с-ки, в результате чего разведение в каждой пробирке увеличивается в 2 раза. Опыту соответствуют контроль с-ки (0,25 -0,5 мл основного разведения с-ки и столько же физраствора) и контроль Аг (0,25 - 0,5 мл диагностикума и столько же физраствора). Если в опыт берут несколько диагностикумов, то каждому соответствует свой контроль Аг. Штатив с пробирками хорошо встряхивают и помещают в термостат при 37°С на 4 ч, а затем оставляют при комнатной температуре до следующего дня, после чего проводят учет РА, основываясь на количестве осадка и степени просветления жидкости. Определение этих показателей в зависимости от характера агглютинатов осуществляют невооруженным глазом на темном фоне, в агглютиноскопе или над вогнутой поверхностью зеркала от микроскопа. Учет начинают с контролей: контроль с-ки должен быть прозрачным, Аг - равномерно мутным (после встряхивания пробирки). Если контроли хорошие, устанавливают наличие и степень агглютинации во всех опытных пробирках, к-рую обозначают плюсами: большой осадок и полное просветление жидкости - 4 плюса; большой осадок и неполное просветление жидкости -3 плюса; заметный осадок и заметное просветление жидкости- 2 плюса. После этого определяют титр: наибольшее разведение с агглютинацией интенсивностью не менее 2 плюсов. Титр иссл. с-ки сравнивают с диагностическим титром для этого заболевания. Если титр иссл. с-ки в 2 раза ниже диагностического, реакцию оценивают как сомнительную; если титр равен диагностическому -как слабоположительную; если в 2-4 раза выше его- как положительную, если в 8 и более раз выше - как резко положительную. При широком распространении Ат у здоровых людей для оценки РА применяют нарастание титра Ат. Для определения вида Аг в серийной РА число рядов должно соответствовать числу взятых для идентификации диагностических с-к. Из основного разведения диагностической с-ки готовят ряд последовательных двукратных разведении таким же способом, как и в РА для определения титра Ат. Факторы разведении зависят от титра агглютинирующей с-ки В опыте необходимо присутствие разведения, равного титру с-ки, а также в 2, 4, 6, 8 раз ниже его напр., если титр диагностической с-ки равен 1 3200, то следует использовать разведения 1 3200, 1 1600, 1 800, 1 400, 1 200 К разведениям с-ки доливают такой же объем иссл Аг, в результате разведение с-к увеличивается в 2 раза К опыту ставят 2 контроля с-ки и Аг Если в опыте участвует несколько с-к, то к каждой из них нужен свой контроль По завершении реакции штатив энергично встряхивают и помещают в термостат при 37°С Результаты учитывают, как описано выше Оценка реакции имеет особенности Для того чтобы сделать вывод о соответствии иссл. Аг взятой в опыт с-ке, титр реакции должен соответствовать не менее половине титра стандартной диагностической с-ки Титры в 1 4 и ниже рассматривают как групповую реакцию Капельный м д постановки РА отличается от объемного тем, что с-ку разводят в объеме 1 мл, Аг применяют в более высокой концентрации (10 млрд/мл) и добавляют его по 1 - 2 капли в пробирку Разведение с-ки после внесения Аг считают неизмененным В остальном методика постановки, учета и оценки аналогична объемному методу

(Источник: «Словарь терминов микробиологии»)

по микробиологии

«Реакция агглютинации и ее виды (РА)»

План:

1. Введение……………………………………………………………………………………..3

2. РА на стекле………………………………………………………………………………….4

3. Пробирочная РА…………………………………………………………………………….5

4. Используемая литература…………………………………………………………………..7

1. Введение.

Взаимодействие микробного антигена и антител носит строго специфический характер и направлено в животном организме на нейтрализацию возбудителя и его токсинов. Взаимодействие антигена и антител in vitro при определенных условиях сопровождаеют видимые феномены (агглютинация, преципитация, иммунный лизис), что позволяет использовать АГ-АТ-реакции, получившие название серологических (от лат. serum-сыворотка), в практических целях. Биофабрики выпускают антигены и иммуные сыворотки (антитела) известной специфической направленности (диагностические). При помощи таких сывороток в серологических реакциях можно идентифицировать неизвестный микроорганизм или, применяя известный антиген, обнаружить в организме антитела, синтезированные в ответ на внедрение возбудителя, и таким образом поставить диагноз (серологическая диагностика). Кроме того, серологические реакции можно использовать для оценки интенсивности иммунного ответа после вакцинации или перенесенной инфекционной болезни.

Реакции агглютинации, например непрямой агглютинации и Кумбса основаны на взаимодействии in vitro корпускулярных антигеновс антителами и способности образовавшихся комплексов выпадать в осадок. В качестве корпускулярных антигенов используют бактериальные клетки или растворимые антигены, экстрагированные из микроорганизмов и сорбированные на корпускулах носителей: эритроцитах, частицах латекса и т.д.

Антигенные детерминанты корпускулярных антигенов специфически взаимодействуют с гомологичными антителами (специфическая, невидимая фаза реакции), а затем комплексы антиген-антитело образуют крупные, идимые невооруженным глазом конгломераты, которые выпадают в осадок - агглютинат (неспецифическая, видимая фаза реакции). У безжгутиковых форм микробов (бруцелл) образуются зернистые агглютинанты, у жгутиковых (эшерихии, салмонеллы) - крупнохлопчатые, которые оседают на дно пробирки в виде перевернутого зонтика и при встряхивании легко разбиваются. Антигены и антитела взаимодействуют лишь в присутствии электролита (в 0,8%-м растворе хлорида натрия). На течение реакции влияют концентрация соли в электролите, количество микробных клеток во взвеси, крнцентрация сыворотки, рН, температура и другие факторы.

Реакция агглютинации (ра).

Различают агглютинацию специфическую, в основе к-рой лежит взаимодействие антигена с гомологичным антителом, содержащимся в организме животного, к-рому был введен данный антиген (иммуноагглютинация); неспецифическую (химическую), возникающую от изменения рН среды, концентрации электролитов; спонтанную, к-рую наблюдают при суспендировании бактерий (находящихся в R-форме) в физиологическом растворе и при нагревании, что связано с изменением коллоидного состояния бактериальной клетки. Антиген, участвующий в РА, называется агглютиногеном, антитело - агглютинином, образующийся осадок - агглютинатом. При образовании агглютината имеет значение количественное соотношение антигена и антител (феномен оптимума). При избытке или недостатке антител происходит задержка А.

Реакция агглютинации (РА) одна из первых иммунологических реакций, которую применяют в микробиологической практике. Впервые (1895) РА для диагностики брюшного тифа применил Ф. Видаль. Позже (1897) эту же реакцию для диагностики бруцеллеза у людей использовал А. Райт. РА нашла применение также при диагностике пуллороза цыплят, лептоспироза, инфекционного аборта кобыл, а также для типизации неизвестных культур микробов по заведомоизвестной агглютинирующей сыворотке. РА высокочувствительна; с ее помощью можно выявить 0,01 мкг азота белка антител в 1 мл.

Разработано несколько вариантов реакции агглютинации, различающихся по методическому исполнению и цели исследования.

2. Ра на стекле.

При этом варианте РА испытуемыми могут быть как сыворотка, так и антиген, но чаще всего этот вариант используют для идентификации микроорганизмов.

1. Для идентификации микроорганзма (м/о) на обезжиренное предметное стекло наносят раздельно каплю известной агглютинирующей сыворотки, например сальмонелиозной, и каплю физиологического раствора (контроль). Затем бактериологической петлей берут бактериальную массу изучаемой культуры из колонии в чашке Петри или с поверхности скошенного МПА в пробирке и суспендируют раздельно в иммунной сыворотке и физиологическом растворе до получения гомогенной взвеси. Результат учитывают через 2…4 мин.

Учет результатов: в контрольной пробе изменения должны отсутствовать. При специфическом соответствии культуры бактерий иммунной сыворотке появляются хлопья агглютината (положительный результат), в случае отсутствия феномена агглютинации делают заключение о том, что исследуемая культура бактерий не соответствует иммунной сыворотке.

2. Обнаружение аниттел в исследуемой сыворотке крови рассмотрим на примере роз-бенгал пробы, применяемой при серодиагностике бруцеллеза. На предметное стекло наносят 0,3 мл исследуемой сыворотки крови животного и 0,03 мл бруцеллезного антигена (окрашенные розовым-бенгальским клетки бруцелл). Компоненты тщательно перемешивают покачиванием стекла и через 4 мин учитывают результат.

Учет результатов: при положительной реакции появляются розовые хлопья агглютината. Серологическую реакцию подобного типа относят к качественной, так как с ее помощью можно выявлять антитела к возбудителю в сыворотке крови животного, но невозможно оценить их количественное содержание.

Цель: Владеть техникой постановки реакции агглютинации и реакции преципитации для диагностики инфекционных заболеваний.

Модуль 1. Морфология и физиология микроорганизмов. Инфекция. Иммуни-тет.

Тема 16: Реакция агглютинации. Реакция преципитации.

Актуальность темы. Под иммунитетом подразумевают невосприимчивость организма к инфекционным и неинфекционным агентам (патогенных микроорганизмов, чужеродных белков и др. веществ). Эти агенты получили названия антигенов. Иммунитет бывает врожденным и приобретенным. Врожденный – когда формируются тканевые и гуморальные защитные приспособления, обуславливающие невосприимчивость к инфекционным заболеваниям, передающимся по наследству.

Приобретенный – осуществляется иммунной системой организма в виде выработки антител или накопления сенсибилизированных лимфоцитов. Он подразделяется на естественный и искусственный . По механизму действия разделяется на активный и пассивный . Во всех иммунологических реакциях основным компонентом является антиген.

Основной функцией иммунной системы, которая состоит из лимфоидной ткани, является распознавание чужеродных агентов (антигенов) и обезвреживание их.

Антигены могут попадать в организм через дыхательные пути, пищеварительный тракт, через кожные и слизистые покровы. Каждый антиген стимулирует образование особых белковых веществ – антител.

Антигены подразделяются на полноценные и неполноценные (гаптены). Полноценные антигены вызывают полный иммунный ответ. Неполноценные антигены самостоятельно не вызывают иммунного ответа, но иногда приобретают эту способность при конъюгации с высокомолекулярными белковыми носителями. Кроме того, бывают антигены: полугаптены, проантигены, гетероантигены и изоантигены.

Антитела представляют собой иммуноглобулины сыворотки крови человека или животного. Образуются антитела после перенесенной инфекции, и в результате иммунизации ослабленными или убитыми бактериями, риккетсиями, вирусами, токсинами и другими агентами. Антитела – белки иммуноглобулинов по химическому составу относятся к гликопротеидам. По структуре и иммунобиологическим свойствам иммуноглобулины подразделяются на 5 классов : IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.

Нормальные антитела обнаруживают у людей и животных не иммунизированных. Специфические антитела образуются в результате перенесенной инфекции или же иммунизации.

Реакции взаимодействия антитела с антигеном называются серологическими . Серологические реакции отличаются высокой специфичностью и применяются при диагностике многих инфекционных заболеваний. Различают реакции агглютинации и преципитации.

1. Реакция агглютинации (РА) основана на взаимодействии антигена (агглютиногена) и антитела (агглютинина), при котором происходит склеивание и выпадение в осадок микробных тел в присутствии электролита. Существуют различные модификации постановки реакции агглютинации.

Наибольшее значение имеют:

- Макроскопическая (развернутая) агглютинация в пробирках. К сыворотке больного добавляют взвесь микробов (диагностикум) и через 1 час в термостате при температуре 37 градусов отмечают разведение (титр) сыворотки, при котором произошла реакция. Положительной считают реакцию агглютинации тогда, когда на дне пробирки образуется осадок с выраженным просветлением надосадочной жидкости. Этот осадок называется агглютинатом.

По характеру агглютината различают мелкозернистую (О) и крупнозернистую (Н) агглютинацию. Для выявления мелкозернистого агглютината пользуются агглютиноскопом. Учет результатов начинают с контрольных пробирок. Последнее разведение сыворотки, в которой наблюдается агглютинация, считают ее титром.

Цель реакции: обнаружение антител в сыворотке больного.

- Микроскопическая (ускоренная) ориентировочная агглютинация на стекле. К капле диагностической иммунной сыворотки вносят каплю бактериальной культуры и равномерно перемешивают. Реакция протекает при комнатной температуре через 5-10 минут. Затем производят учет. При положительной реакции в капле с сывороткой отмечают скопление бактерий в виде зернышек или хлопьев. Цель реакции: определение вида возбудителя по известной диагностической сыворотке.

- Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА). Сущность этой реакции заключается в том, что эритроциты барана способны адсорбировать на своей поверхности антигены. Под воздействием специфических антител, эритроциты склеиваются и выпадают в осадок, образуя на дне гемагглютинат. Реакция отличается высокой чувствительностью и специфичностью. РНГА позволяет обнаружить минимальное количество антител и неполноценные антигены полисахаридной природы. Эту реакцию применяют при диагностики многих инфекционных заболеваний (брюшного и сыпного тифа, паратифов, туберкулеза и др.).

2. Реакция преципитации (РП) – осаждение комплекса антиген-антитело. Основным отличием РП от РА является то, что при РА применяется корпускулярный антиген, а при РП – антиген представляет собой коллоидное вещество белковой или полисахаридной природы. В этой реакции антиген называется преципитиноген, а антитела – преципитины. Реакцию ставят в пробирках наслоением раствора антигена на иммунную сыворотку. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе

этих растворов образуется кольцо преципитата. Если в качестве антигена используют прокипяченные и профильтрованные экстракты органов и тканей, реакция называется реакцией термопреципитации (реакция Асколи, которую ставят при диагностике сибирской язвы, чумы, туляремии и др.).

Широкое распространение получили реакции преципитации в агаре: метод простой диффузии, метод двойной диффузии .

Разновидностью преципитации является реакция флокуляции – для определение активности анатоксина или антитоксической сыворотки. Кроме того, можно использовать эту реакцию для определения токсигенности штаммов Corynebacterium diphtheriae.

Конкретные цели:

· Объяснить роль антигенов, как индукторов иммунного ответа;

· Описать структуру антигенов, в том числе антигенов микроорганизмов;

· Описать механизм реакции агглютинации;

· Описать механизм реакции преципитации.

Уметь:

· Пояснить роль антигенов, как индукторов иммунного ответа;

· Описать структуру антител (разных классов иммуноглобулинов);

· Проанализировать механизм взаимодействия антител с антигенами;

· Трактовать результаты реакции агглютинации;

· Трактовать результаты реакции преципитации;

· Анализировать полученные результаты.

Теоретические вопросы:

1. Определение понятия «антигены», «антитела».

2. Роль антигенов как индукторов иммунного ответа.

3. Структура антител (разных классов иммуноглобулинов).

4. Механизм взаимодействия антител с антигенами.

5. Реакции иммунитета, их роль в иммунном ответе и диагностике инфек-ционных болезней.

6. Механизм реакции агглютинации.

7. Механизм реакции преципитации.

Практические задания, которые выполняются на занятии:

1. Постановка реакции агглютинации для выявления антител в сыворотке больного.

2. Постановка реакции микроагглютинации на стекле с диагностическими сыворотками для идентификации чистой культуры бактерий.

3. Оценка результатов реакции агглютинации.

4. Постановка реакции преципитации для выявления антигена бактерий.

5. Оценка результатов реакции преципитации.

6. Оценка результатов реакции непрямой гемагглютинации.

7. Оформление протокола.

Литература:

1. Пяткин К.Д., Кривошеин Ю.С. Микробиология с вирусологией и имму-нологией.– Киев: Высшая школа, 1992.- 431с.

2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А.М. Микробиоло-гия.- М.: Медицина, 1998.- 336с.

3. Медицинская микробиология /Под редакцией В.П. Покровского.– М.: ГЕОТАР-МЕД, 2001.– 768с.

4. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммуноло-гия и вирусология /Учебник для медицинских ВУЗов, С-Пб.: «Специальная литература», 1998.- 592с.

5. Тимаков В.Д., Левашев В.С., Борисов Л.Б. Микробиология /Учебник.- 2-е изд., перераб. и доп.– М.: Медицина, 1983.- 512с.

6. Конспект лекции.

Дополнительная литература:

1. Титов М.В. Инфекционные болезни.- К., 1995.– 321с.

2. Шувалова Е.П. Инфекционные болезни.– М.: Медицина, 1990.- 559с.

Иммунодиагностические реакции. Реакции антиген-анитело и реакции с меченными компонентами. Использование в целях идентификации микроорганизмов и диагностики инфекционных заболеваний.

Иммунные реакции используют при диа­гностических и иммунологических исследо­ваниях у больных и здоровых людей. С этой целью применяют серологические методы (от лат. serum - сыворотка и logos - учение), т. е. методы изучения антител и антигенов с помо­щью реакций антиген-антитело, определяе­мых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма.

Обнаружение в сыворотке крови боль­ного антител против антигенов возбудите­ля позволяет поставить диагноз болезни. Серологические исследования применяют также для идентификации антигенов микро­бов, различных биологически активных ве­ществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепто­ров клеток и др.

При выделении микроба от больного про­водят идентификацию возбудителя путем изу­чения его антигенных свойств с помощью иммунных диагностических сывороток, т. е. сывороток крови гипериммунизированных животных, содержащих специфические ан­титела. Это так называемая серологическая идентификация микроорганизмов.

В микробиологии и иммунологии широко применяются реакции агглютинации, преци­питации, нейтрализации, реакции с участи­ем комплемента, с использованием меченых антител и антигенов (радиоиммунологичес­кий, иммуноферментный, иммунофлюорес- центный методы). Перечисленные реакции различаются по регистрируемому эффекту и технике постановки, однако, все они осно- . ваны на реакции взаимодействия антигена с антителом и применяются для выявления как антител, так и антигенов. Реакции иммуните­та характеризуются высокой чувствительнос­тью и специфичностью.

Ниже приводятся принципы и схемы ос­новных иммунодиагностических реакций. Детальная техника постановки реакций дана в. практических руководствах по иммуноди­агностике.

Реакция агглютинации - РА (от лат. aggluti - natio - склеивание) - простая по постановке реакция, при которой происходит связыва­ние антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекуляр- ных агрегатов). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изо­тонического раствора натрия хлорида.

Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировоч­ная, непрямая и др. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осад­ка

РА используют для:

определения антител в сыворотке крови боль­ных, например, при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реак­ция Видаля) и других инфекционных болезнях;

определения возбудителя, выделенного от больного;

определения групп крови с использова­нием моноклональных антител против алло- антигенов эритроцитов.

Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации: к разве­дениям сыворотки крови больного добавля­ют диагностикум (взвесь убитых микробов,) и через несколько часов инкубации при 37 °С отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.

Характер и скорость агглютинации зави­сят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диа- гностикумов (О- и Я-антигенов) со специ­фическими антителами. Реакция агглютина­ции с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернис­той агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые фор­малином, сохранившие термолабильный жгу­тиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.

Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентиро­вочную реакцию агглютинации, применяя диа­гностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диа­гностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больно­го. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микроба­ми хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увели­чивающимися разведениями агглютинирую­щей сыворотки, к которым добавляют по 2-3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмеча­ется в разведении, близком к титру диагнос­тической сыворотки. Одновременно учитыва­ют контроли: сыворотка, разведенная изото­ническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе - равномерно мутной, без осадка.

Разные родственные бактерии могут агглю­тинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудня­ет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыво­ротками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыво­ротках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии. Получение таким:^особом монорецепторных диагностических агглютинирующих сывороток было предло­жено А. Кастелляни (1902).

Реакция непрямой (пассивной) гемагглюти­нации (РНГА, РПГА) основана на использо­вании эритроцитов с адсорбированными на ■х поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соответствующими антителами или антигенами сыворотки крови бальных вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка (рис. 13.2). При отрицательной реакции эритроциты оседают ■ виде «пуговки». Обычно в РНГА выявляют антитела с помощью антигенного эритроцитарного диагностикума, который представ­ляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами. Иногда применяют антительные эритроцитарные диагностику мы, на которых адсорбированы антитела. Например, можно обнаружить ботулинический токсин, добавляя к нему эритроцитарный антитель­ный ботулинический диагностикум (такую реакцию называют реакцией обратной непря­мой гемагглютинации - РОНГА). РНГА при­меняют для диагностики инфекционных бо­лезней, определения гонадотропного гормона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительности к лекарственным препаратам, гормонам и в не­которых других случаях.

Реакция коагглютинации . Клетки возбуди­теля определяют с помощью стафилококков, предварительно обработанных иммунной диагностической сывороткой. Стафилококки, содержащие белок А, имеющий сродство к Fc -фрагменту иммуноглобулинов, неспеци­фически адсорбируют антимикробные анти­тела, которые затем взаимодействуют актив­ными центрами с соответствующими микро­бами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состо­ящие из стафилококков, антител диагности­ческой сыворотки и определяемого микроба.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на блокаде, подавлении ан­тигенов вирусов антителами иммунной сы­воротки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты (рис. 13.3). РТГА применяют для диагностики мно­гих вирусных болезней, возбудители которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещево­го энцефалита и др.) могут агглютинировать эритроциты различных животных.

Реакцию агглютинации для определения групп крови применяют для установления системы АВО (см. разд. 10.1.4.1) с помощью агглютина­ции эритроцитов антителами иммунной сы­воротки против антигенов групп крови А (II), В (III). Контролем служат: сыворотка, несодер- жащая антител, т. е. сыворотка AB (ГУ) группы крови; антигены, содержащиеся в эритроцитах групп А (II), В (III). Отрицательный контроль не содержит антигенов, т. е. используют эрит­роциты группы 0 (I).

В реакции агглютинации для определения резус-фактора (см. разд. 10.1.4.1) используют антирезусные сыворотки (не менее двух раз­личных серий). При наличии на мембране ис­следуемых эритроцитов резус-антигена проис­ходит агглютинация этих клеток. Контролем служат стандартные резус-положительные и резус-отрицательные эритроциты всех групп крови.

Реакцию агглютинации для определения антирезусных антител (непрямую реакцию Кумбса) применяют у больных при внутрисосудистом гемолизе. У некоторых таких боль­ных обнаруживают антирезусные антитела, которые являются неполными, одновалент­ными. Они специфически взаимодействуют с резус-положительными эритроцитами, но не вызывают их агглютинации. Наличие таких неполных антител определяют в непрямой реакции Кумбса. Для этого в систему анти- резусные антитела + резус-положительные эритроциты добавляют антиглобулиновую сыворотку (антитела против иммуноглобули­нов человека), что вызывает агглютинацию эритроцитов (рис. 13.4). С помощью реакции Кумбса диагностируют патологические состо­яния, связанные с внутрисосудистым лизисом эритроцитов иммунного генеза, например ге­молитическую болезнь новорожденных: эрит­роциты резус-положительного плода соединя­ются с циркулирующими в крови неполными антителами к резус-фактору, которые пере­шли через плаценту от резус-отрицательной матери.

Реакции преципитации

Реакция преципитации - РП (от лат. praeci- pito - осаждать,) - это формирование и осаж­дение комплекса растворимого молекулярно­го антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эк­вивалентных количествах; избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса.

Реакции преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации), в гелях, пита­тельных средах и др. Широкое распростране­ние получили разновидности реакции преци­питации в полужидком геле агара или агаро- зы: двойная иммунодиффузия по Оухтерлони. радиальная иммунодиффузия, иммуноэлектро- форез и др.

Реакция кольцепреципитации . Реакцию про­водят в узких преципитационных пробирках с иммунной сывороткой, на которую наслаивают растворимый антиген. При оптимальном соот­ношении антигена и антител на границе этих двух растворов образуется непрозрачное кольцо преципитата (рис. 13.5). Избыток антигена не влияет на результат реакции кольцепреципи­тации вследствие постепенной диффузии ре­агентов к границе жидкости. Если в качестве антигенов в реакции кольцепреципитации ис­пользуют прокипяченные и профильтрованные водные экстракты органов или тканей, то такая реакция называется реакцией термопреципита- иии (реакция Асколи, при сибирской язве/

Реакция двойной иммунодиффузии по Оухтерюни . Для постановки реакции растопленный агаровый гель тонким слоем выливают на стек­лянную пластинку и после его затвердевания в нем вырезают лунки размером 2-3 мм. В эти лунки раздельно помещают антигены и иммун­ные сыворотки, которые диффундируют на­встречу друг другу. В месте встречи в эквивален­тных соотношениях они образуют преципитат в виде белой полосы. У многокомпонентных систем между лунками с разными антигенами и антителами сыворотки появляется несколько линий преципитата; у идентичных антигенов линии преципитата сливаются; у неидентич­ных - пересекаются (рис. 13.6).

Реакция радиальной иммунодиффузии . Иммун­ную сыворотку с расплавленным агаровым гелем равномерно наливают на стекло. После застыва­ния в геле делают лунки, в которые помещают антиген в различных разведениях. Антиген, диф­фундируя в гель, образует с антителами кольце- зые зоны преципитации вокруг лунок (рис. 13.7). Диаметр кольца преципитации пропорционален концентрации антигена. Реакцию используют лля определения содержания в крови иммуног­лобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др.

Иммуноэлектрофорез - сочетание метода электрофореза и иммунопреципитации: смесь антигенов вносится в лунки геля и разделяет­ся в геле с помощью электрофореза. Затем в канавку параллельно зонам электрофореза зносят иммунную сыворотку, антитела кото­рой, диффундируя в гель, образуют в месте - встречи» с антигеном линии преципитации.

Реакция флоккуляции (по Рамону) (от лат. floccus - хлопья шерсти)- появление опалес- ценции или хлопьевидной массы (иммуноп- реципитации) в пробирке при реакции ток­син-антитоксин или анатоксин-антитоксин. Ее применяют для определения активности антитоксической сыворотки или анатоксина.

Иммунная электронная микроскопия - элек­тронная микроскопия микробов, чаще ви­русов, обработанных соответствующими ан­тителами. Вирусы, обработанные иммунной сывороткой, образуют иммунные агрегаты (микропреципитаты). Вокруг вирионов обра­зуется «венчик» из антител, контрастирован- ный фосфорно-вольфрамовой кислотой или другими электронно-оптически плотными препаратами.

Реакции с участием комплемента

Реакции с участием комплемента основаны на активации комплемента комплексом анти­ген-антитело (реакция связывания компле­мента, радиального гемолиза и др.).

Реакция связывания комплемента (РСК ) за­ключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммун­ный комплекс, к которому через Fc -фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комп­лексом антиген-антитело. Если же комплекс антиген-антитело не образуется, то комп­лемент остается свободным (рис. 13.8). РСК проводят в две фазы: 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (инди­каторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемоли­тической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содер­жащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген-антите­ло происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизирован­ных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и ан­титело не соответствуют друг другу (в иссле­дуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - ан- тиэритроцитарное антитело, вызывая гемо­лиз; реакция отрицательная.

РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифи­лиса (реакция Вассермана).

Реакцию радиального гемолиза (РРГ ) ставят в лунках геля из агара, содержащего эрит­роциты барана и комплемент. После внесе­ния в лунки геля гемолитической сыворотки (антител против эритроцитов барана) вокруг них (в результате радиальной диффузии анти­тел) образуется зона гемолиза. Таким образом можно определить активность комплемента и гемолитической сыворотки, а также антитела в сыворотке крови у больных гриппом, крас­нухой, клещевым энцефалитом. Для этого на эритроцитах адсорбируют соответствующие антигены вируса, а в лунки геля, содержащего данные эритроциты, добавляют сыворотку крови больного. Противовирусные антитела взаимодействуют с вирусными антигенами, адсорбированными на эритроцитах, после че­

го к этому комплексу присоединяются ком­поненты комплемента, вызывая гемолиз.

Реакция иммунного прилипания (РИП ) ос­нована на активации системы комплемента корпускулярными антигенами (бактериями, вирусами), обработанными иммунной сыво­роткой. В результате образуется активирован­ный третий компонент комплемента (СЗЬ), который присоединяется к корпускулярному антигену в составе иммунного комплекса. На эритроцитах, тромбоцитах, макрофагах имеются рецепторы для СЗЬ, благодаря чему при смешивании этих клеток с иммунными комплексами, несущими СЗЬ, происходят их соединение и агглютинация.

Реакция нейтрализации

Антитела иммунной сыворотки способны нейтрализовать повреждающее действие мик­робов или их токсинов на чувствительные клетки и ткани, что связано с блокадой микро­бных антигенов антителами, т. е. их нейтрали­зацией. Реакцию нейтрализации (РН) проводят путем введения смеси антиген-антитело жи­вотным или в чувствительные тест-объекты (культуру клеток, эмбрионы). При отсутствии у животных и тест-объектов повреждающего действия микроорганизмов или их антигенов, токсинов говорят о нейтрализующем дейс­твии иммунной сыворотки и, следовательно, о специфичности взаимодействия комплекса антиген-антитело (рис. 13.9).

Реакция иммунофлюоресценции - РИФ (метод Кунса)

Различают три основные разновидности метода: прямой, непрямой (рис. 13.10), с ком­плементом. Реакция Кунса является методом экспресс-диагностики для выявления антиге­нов микробов или определения антител.

Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, ме­ченными флюорохромами, способны светить­ся в УФ-лучах люминесцентного микроскопа.

Бактерии в мазке, обработанные такой люми- несцирующей сывороткой, светятся по пери­ферии клетки в виде каймы зеленого цвета.

Непрямой метод РИФ заключается в вы­явлении комплекса антиген-антитело с по­мощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабаты­вают антителами антимикробной кроличьеи диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, от­мывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобули­новой (антикроличьей) сывороткой, мечен­ной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела +антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

Иммуноферментный метод, или анализ (ИФА)

ИФА - выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой хре­на, бета-галактозидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с ме­ченной ферментом иммунной сывороткой в смесь добавляют субстрат/хромоген. Субстрат расщепляется ферментом, и изменяется цвет продукта реакции - интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связав­шихся молекул антигена и антител.

Твердофазный ИФА - наиболее распростра­ненный вариант иммунологического теста, когда один из компонентов иммунной реак­ции (антиген или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках план­шеток из полистирола

При определении антител в лунки планше­ток с сорбированным антигеном последова­тельно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную фер­ментом, и субстрат (хромоген) для фермента.

Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшие- ся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный но­ситель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителами. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят иско­мый антиген, добавляют иммунную сыворот­ку против антигена, меченную ферментом, а затем субстрата для фермента.

Конкурентный вариант ИФА . искомый ан­тиген и меченный ферментом антиген кон­курируют друг с другом за связывание ог­раниченного количества антител иммунной сыворотки. Другой тест - искомые антитела

и меченые антитела конкурируют друг с дру­гом за антигены.

Радиоиммунологический метод, или анализ (РИА)

Высокочувствительный метод, основанный на реакции антиген-антитело с примене­нием антигенов или антител, меченных ра­дионуклидом (125 J, 14 С, 3 Н, 51 Сг и др.). После их взаимодействия отделяют образовавшийся радиоактивный иммунный комплекс и опре­деляют его радиоактивность в соответствую­щем счетчике (бета- или гамма-излучение):

интенсивность излучения прямо пропорцио­нальна количеству связавшихся молекул ан­тигена и антител.

При твердофазном варианте РИА один из компонентов реакции (антиген или антитела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках микропанелей из полистирола. Другой вариант метода - конкурентный РИА. ис­комый антиген и меченный радионуклидом антиген конкурируют друг с другом за свя­зывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки. Этот вариант исполь­зуют для определения количества антигена в исследуемом материале.

РИА применяют для выявления антигенов микробов, определения гормонов, фермен­тов, лекарственных веществ и иммуноглобу­линов, а также иных веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концент­рациях - 10~ |0 -И0~ 12 г/л. Метод представляет определенную экологическую опасность.

Иммуноблоттинг

Иммуноблоттинг (ИБ) - высокочувстви­тельный метод, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА.

Антиген выделяют с помощью электрофоре­за в полиакриламидном геле, затем переносят его (блоттинг - от англ. blot , пятно) из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлоз- ную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами»

антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем после инкубации отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов челове­ка, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс антиген + антитело больно­го + антитело против Ig человека выявляют до­бавлением субстрата/хромогена, изменяющего окраску под действием фермента (рис. 13.12).

ИБ используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.

Иммунные реакции. Применение иммунных реакций в диагностике инфекционных заболеваний.

ПЛАН:

Виды иммунных реакций.

Условия проведения серологических реакций.

Требования к сыворотке.

Понятие положительный и отрицательный результат.

ОНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ:

Виды иммунных реакций.

Иммунологическая реакция – это взаимодействие антигена с антителом, которое определяется специфическим взаимодействием активных центров антитела (паратопа) с эпитопами антигенов.

Общая классификация иммунологических реакций:

серологические реакции – реакции между антигенами (Aг) и антителами (Ig)

in vitro ;

клеточные реакции с участием иммунокомпетентных клеток;

аллергические пробы – выявление гиперчувствительности.

Серологические реакции: 1) определение, 2) фазы, 3) цели постановки, 4) общая классификация.

1) Определение

Серологические методы исследования (от лат. Serum - сыворотка и logos - учение) с помощью реакции антиген-антитело.

2) Фазы

2 фазы взаимодействия:

I. Специфическая (видимая) – наступает быстро, aнтитела соединяются с соответствующими им антигенами. В эту фазу взаимодействуют детерминантные группы антигенов (АГ) и активных центров антител (АТ).

В образовании комплекса АГ+ АТ участвуют силы:

Кулона;

Ван дер Ваальса

Водородные связи.

Никаких видимых изменений в этой фазе нет. При электронной микроскопии комплекс АГ+АТ в виде решетки.

II. Неспецифическая – наступает медленно, образовавшийся комплекс антиген – антитело реагирует с дополнительным неспецифическим фактором среды, в которых происходит реакция, и это видимо глазом – склеивание, растворение, выпадение хлопьев осадка и т. п. В присутствии электролита снижается заряд, уменьшается растворимость, образуются видимые конгломераты, выпадающие в осадок (агглютинат).

3) Цели постановки :

а) для идентификации антигена (антитело известно-диагностическая сыворотка):

• в патологическом материале (экспресс-диагностика);

  в чистой культуре:

  1. серологическая идентификация (определение вида);

     серотипирование (определение серовара) – определение штамма;

б) для выявления антител (Ig) (антиген известен-диагностикум):

• наличия (качественные реакции);

  количества (нарастание титра – метод «парных сывороток»).

4) Общая классификация серологических реакций :

а) простые (2-х компонентные: Ag+Ig):

реакции агглютинации РА (с корпускулярным антигеном);

реакции преципитации РП (с растворимым антигеном);

б) сложные (3-х компонентные: Ag+Ig+C);

в) с использованием метки.

Варианты реакции агглютинации и преципитации

Реакция агглютинации :

Реакция агглютинации (РА) - иммунная реакция взаимодействия суспензии АГ (эритроцитов, бактерий) с АТ в физиологическом растворе.

При агглютинации происходит склеивание частиц АТ с образованием хлопьевидного осадка.

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) является разновидностью реакции агглютинации, в которой используют антительный или антигенный эритроцитарный диагностикум (эритроциты с адсорбированными на их поверхности АТ или АГ).

Эритроциты в этой реакции выполняют роль пассивных носителей.

Оценка результатов РПГА проводится следующим образом:

- при положительной реакции пассивно склеенные эритроциты покрывают дно U- или V-образной лунки ровным слоем с фестончатыми краями («зонтик»);

- при отрицательной реакции (отсутствии агглютинации) эритроциты скапливаются в центральном углублении лунки, образуя компактную «пуговку» с резко очерченными краями.

Реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) используют при диагностике вирусных инфекций. Некоторые вирусы содержат на своей поверхности белок гемагглютинин, склеивающий эритроциты. Добавление специфических противовирусных АТ блокирует вирусный гемагглютинин - гемагглютинация отсутствует.

Реакцию непрямой гемагглютинации (РНГА), или реакцию Кумбса, применяют для определения неполных АТ. Добавление антиглобулиновой сыворотки (АТ против Ig человека) усиливает результаты реакции. РНГА применяют при определении резус-фактора.

Для постановки реакции агглютинации (РА) необходимы три компонента:

1) антиген (агглютиноген) АГ;

2) антитело (агглютинин) АТ;

3) электролит (изотонический раствор натрия хлорида).
Аг + АТ + электролит = агглютинат

Агглютинация (от лат. agglutinatio - склеивание) - склеивание корпускул (бактерий, эритроцитов и др.) антителами в присутствии электролитов - натрия хлорида.

РА проявляется в виде хлопьев или осадка, состоящих из корпускул-тел (например бактерий, эритроцитов), "склеенных" антителами.

РА используют для:

Реакция прямой агглютинации микробов (РА).

В этой реакции антитела (агглютинины) непосредственно агглютинируют корпускулярные антигены (агглютиногены).

Обычно они представлены взвесью инактивированных микроорганизмов (реакция микробной агглютинации).

Для определения вида микроорганизмов используют стандартные диагностические агглютинирующие сыворотки ( известные АТ ).

Наиболее распространены пластинчатая (ориентировочная) и развернутая РА.

Пластинчатую РА ставят на стекле. Используют ее как ускоренный метод обнаружения антител или идентификации микроорганизмов.

Компоненты:

1. стандартные диагностические агглютинирующие сыворотки (АТ);

2. исследуемая чистая культура от пациента;

3. физ.раствор.

В исследуемой чистой культуре антигены (АГ) в виде частиц (микробные клетки, эритроциты и другие корпускулярные антигены), которые склеиваются антителами и выпадают в осадок.

Пример:

Постановка ориентировочной реакции агглютинации (РА ) на стекле с целью идентификации бактерий кишечной группы.

На предметное стекло наносят каплями:

1 дизентерии ;
2 -ая капля: - агглютинирующая сыворотка к возбудителям брюшного тифа ;

(1-2 диагностические сыворотки)
3 -я капля: - физиологический раствор (контроль).
Добавляют в каждую каплю исследуемую чистую культуру бактерий. Перемешивают.

Результат : положительный - наличие хлопьев агглютината,
отрицательный - отсутствие хлопьев агглютината
Заключение: Исследуемые бактерии являются возбудителями брюшного тифа (определялись антигены).

Для определения АТ в сыворотке больного (серологический диагноз) используют стандартный микробный диагностикум , содержащий взвесь известных микробов или их антигенов АГ .

Определение групп крови системы АВО (реакция гемагглютинации (РГА)) – агглютинируют эритроциты.

Компоненты реакции:

1. АГ (эритроциты крови) исследуемая кровь

2. АТ (эритротесты- цоликлоны)

Набор цоликлонов:

Реагент Цоликлон анти-А (розовый)

Реагент Цоликлон анти-В (синий)

Реагент Цоликлон анти-АВ (бесцветный)

3. электролит (физиологический раствор)

Техника определения:

1 .

В лунки планшета наносится по одной капле (0,1 мл) цоликлона анти - А, анти - В и анти – АВ (для контроля).

2.

Рядом с каждой каплей реагента наносится маленькую (0,05-0,01 мл) каплю исследуемой крови.

Затем капля цоликлона смешивается с каплей крови индивидуальной чистой стеклянной палочкой.

3.

Реакция агглютинации развивается в течение первых 3-5 секунд при мягком покачивании пластинки.

Результаты реакции учитываются через 2,5 - 3 минуты после смешивания капель. Слева направо в лунках анти-А, анти-В, анти-АВ.

Положительный результат-появление зернистого осадка (агглютината).

положительная РА (+)

Отрицательный - осадка нет.

отрицательная РА(-)

4.

Анализ результатов.

O (I ) α β – агглютинации нет

A (II ) β – агглютинация с анти-А

B (III ) α – агглютинация с анти-В

AB (IV )О – агглютинация с анти-А, с анти-В

Схематичное изображение агглютинации.

Антигены АГ на эритроцитах (определяемые) + антитело АТ (цоликлон) диагностическая сыворотка

Учет агглютинации в планшетах

Реакция преципитации:

Реакция преципитации - иммунная реакция взаимодействия АГ в растворимом состоянии с АТ в физиологическом растворе.

При преципитации происходит образование макромолекулярного иммунного комплекса, что проявляется переходом прозрачного коллоидного раствора в непрозрачную суспензию, или преципитат.

Количество обоих реагентов должно быть в строго определенных соотношениях, так как избыток одного из них снижает результат.

Существуют различные способы постановки реакции преципитации.

1. Реакцию кольцепреципитации ставят в преципитационных пробирках с малым диаметром. В пробирку вносят иммунную сыворотку и осторожно наслаивают растворимый АГ. АГ и АТ смешиваются за счет теплового движения молекул, и они взаимодействуют. При положительном результате на границе двух растворов образуется кольцо непрозрачного преципитата.

2. Реакцию двойной иммунодиффузии по Оухтерлони проводят в агаровом геле, в лунки которого вносят по схеме либо раствор АГ, либо раствор АТ. АГ и АТ диффундируют в гель навстречу друг другу и при положительном результате реакции образуют иммунные комплексы, видимые как линии преципитации.

Реакция преципитации – это формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного антигена с антителами в виде помутнения, называемого преципитатом. Он образуется при смешивании антигенов и антител в эквивалентных количествах.

Компоненты РА:

преципитирующая сыворотка (известное АТ-преципитин);

исследуемая сыворотка (неизвестный АГ-преципитиноген);

физ. Раствор.

Реакцию преципитации ставят в или в специальных узких пробирках (реакция кольцепреципитации), или в чашках Петри в гелях, питательных средах и др.

Реакция кольцеприципитации

Постановка и учет результатов реакции кольцепреципитации для обнаружения возбудителя сибирской язвы (Асколи реакция).

Постановка .

1. Исследуемый материал (кожа, шерсть, войлок, щетина, сукно, мясо, земля, испражнения животных и т. д.) кипятят в физ растворе5-45 мин. для получения изотонической вытяжки (экстракта). Фильтруют.

2. В пробирку наливают преципитирующую противосибиреязвенную сыворотку.

3. Осторожно наслаивают на нее исследуемый материал (экстракт).

Учет .

В течение ближайших 10 мин. на границе между сывороткой и экстрактом в положительных случаях появляется кольцо помутнения (кольцепреципитация). Асколи реакция очень чувствительна и специфична

С ее помощью удается быстро выявить материалы, инфицированные сибирской язвой.

Реакция преципитации в агаре

Постановка и учет результатов реакции преципитации в агаре для определения токсигенности коринебактерий (возбудители дифтерии)

Постановка

Ставится на фосфатно-пептонном агаре в чашке Петри.

1. Вдоль чашки посередине помещают полоску стерильной фильтровальной бумаги, смоченной антитоксической сывороткой .

2. После подсушивания на расстоянии 1 см от края полоски бляшками диаметром 10 мм подсевают выделенные культуры .

В одной чашке можно сеять от 3 до 10 культур, одна из которых, контрольная , должна быть заведомо токсигенной .

Посевы помещают в термостат.

Учет

Анализ проводят через 24-48-72 ч.

Положительный результат - (культура токсигенная) - на некотором расстоянии от полоски бумаги возникают линии преципитата , « стрелы-усики », которые хорошо видны в проходящем свете.

На рисунке представлена реакция преципитации в агаре на определение токсигенности дифтерийных палочек. Средние культуры не образовали «стрел-усиков», это не токсикогенные возбудители.

Штаммы возбудителя дифтерии могут быть токсигенными (продуцирующими экзотоксин) и нетоксигенными. Образование экзотоксина зависит от наличия в бактериях профага, несущего tox-ген, кодирующий образование экзотоксина.

При заболевании все возбудители дифтерии тестируются на токсигенность - продукцию дифтерийного экзотоксина с помощью реакции преципитации в агаре

Сложные серологические реакции ( 3–х компонентные:Aг+Ig+C):

Реакция связывания комплемента (РСК).

Реакцию проводят в два этапа.

На первом этапе АТ взаимодействуют с АГ и комплементом, на втором этапе добавляют индикатор - гемолитическую систему (смесь эритроцитов и антиэритроцитарной сыворотки).

При положительном результате на первом этапе АТ образуют с АГ иммунный комплекс, связывающий комплемент реакционной смеси.

В этом случае эритроциты гемолитической системы, добавленные на втором этапе, не разрушаются.

В противном случае несвязанный комплемент вызывает лизис индикаторных эритроцитов.

Для ее проведения необходимо пять ингредиентов: АГ, AT и комплемент (первая система), эритроциты барана и гемолитическая сыворотка (вторая система) (рис.1).

Реакция протекает в две фазы (рис. 3).

Первая фаза - взаимодействие антигена и антител при обязательном участии комплемента.

Вторая - выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка). Разрушение эритроцитов гемолитической сывороткой происходит только в случае присоединения комплемента к гемолитической системе. Если же комплемент адсорбировался ранее на комплексе антиген-антитело, то гемолиз эритроцитов не наступает (рис).

Результат опыта оценивают (рис.2), отмечая наличие или отсутствие гемолиза во всех пробирках. Реакцию считают положительной при полной задержке гемолиза, когда жидкость в пробирке бесцветна и эритроциты оседают на дно, отрицательной - при полном лизисе эритроцитов, когда жидкость интенсивно окрашена («лаковая» кровь).

Степень задержки гемолиза оценивают в зависимости от интенсивности окраски жидкости и величины осадка эритроцитов на дне (++++, +++, ++, +).

Рис. 4. Постановка и результат РСК.

Вывод: В исследуемой сыворотке выявлены антитела.

РСК позволяет выявить антитела к любому штамму одного и того же серотипа вируса.

Диагностическое значение имеет:

четырехкратное увеличение титра антител в парных сыворотках (в период эпидемии гриппа) ;

двукратное нарастание в сыворотках крови больных при характерной клинической картине.

Реакции с использованием метки :

Эти методы высокочувствительны. В качестве метки антигенов или антител применяют красители, радиоактивные изотопы, ферменты и др.

РИФ – реакция иммунофлюоресценции

Реакция иммунофлуоресценции основана на световой индикации комплекса антиген-антитело

Иммуноферментный анализ.

Современное лабораторное исследование, в ходе которого ведется поиск специфических антител в крови либо антигенов к конкретным заболеваниям с целью выявления не только этиологии, но и стадии болезни.

Результаты ИФА могут выдаваться качественно и количественно.

В настоящее время ИФА применяется в следующих ситуациях:

1) поиск специфических антител к любому инфекционному заболеванию;

2) поиск антигенов каких-либо заболеваний (инфекционных, венерологических);

3) исследование гормонального статуса пациента;

4) обследование на онкомаркеры;

5) обследование на предмет наличия аутоиммунных заболеваний.

На рисунке твердофазный ИФА – известные АГ (слева) адсорбировн а на лунке планшета, (справа) на лунках планшета известные АТ

Преимущества метода ИФА:

1) Высокая специфичность и чувствительность метода ИФА (более 90%).

2) Возможность определения заболевания и отслеживания динамики процесса, то есть сравнивание количества антител в разных временных промежутках.

3) Доступность ИФА-диагностики в любом медицинском учреждении.

Относительный недостаток:Выявление иммунного ответа (антител), но не самого возбудителя., конъюгированных с ферментом-меткой.

Постановка ИФА (общий механизм):

Основу иммуноферментного анализа составляет иммунная реакция антигена и антитела с образованием иммунного комплекса: антиген-антитело, в результате которого происходит изменение ферментативной активности специфических меток на поверхности антител.

Компоненты реакции:

1. АГ(АТ) известное – на лунке планшета.

2. АТ (АГ) исследуемое.

3. АТ с ферментом, специфичное комплексу АТ(АГ)-АГ(АТ)

4.хромогенный субстрат, взаимодействующий с фермент

5. стоп раствор

Основные этапы проведения ИФА

1. На поверхности лунок планшета находится очищенный антиген определенного возбудителя. В них добавляется биологический материал пациента происходит специфическая реакция между этим антигеном и искомым антителом (иммуноглобулином). Образуется комплекс.

2. Добавляется конъюгант – АТ с ферментом. Конъюгант специфичен к комплексу АТ- АГ первого этапа. Фермент активизируется.

3. Добавляется субстрат и активный фермент взаимодействует с ним, изменяя бесцветный цвет раствора.

4. Добавляется стоп раствор для прекращения взаимодействия фермент-субстрат.

Учет.

Положительный результат- изменение цвета, на рисунке – желтый цвет.

Иммунохроматографический анализ

Метод иммунохроматографического анализа (ИХА, экспресс-тесты) – качественный скрининговый предварительный метод, позволяющий быстро, в течение нескольких минут, провести анализ в любых условиях, в т.ч. «полевых».

К преимуществам ИХА следует отнести:

Быстроту и легкость в использовании;

Малые объемы образца, отсутствие пробоподготовки;

Дешевизну для производителя и потребителя;

Возможность производства тестов в больших объемах;

Простоту чтения и интерпретации результата;

Высокую чувствительность и вопроизводимость;

Возможность количественного определения;

Возможность использования портативных ридеров, совместимых с компьютером;

Возможность мультианализа.

Компоненты (нанесены на тест-полоску):

1. Конъюгат с меткой коллоидного золота – специфичен к определяемому АГ.

2. АТ тестовой линии – специфичны к комплексу АТ-АГ

3. АТ контрольной линии – специфичны к конъюгату.

Постановка ИХА:

1.Нанесение образца на обозначенный стартовый участок полоски.

2. Получение результата в виде появления окрашенных полос на месте тестовой и контрольной линии.

Учет

Положительный – при окрашивании тестовой линии.

Отрицательный - при отсутствии окрашивания тестовой линии.

Недостоверный – при отсутствии окрашивания контрольной линии.

Общий механизм ИХА:

1. Образец вносится на стартовое поле (подушку образца) и связывается с конъюгатом (специфичное тело с цветной меткой), которые находятся на подушке конъюгата. В результате образуется окрашенный комплекс.

2. Образовавшийся окрашенный иммунный комплекс движется под действием капиллярных сил вдоль нитроцеллюлозной мембраны и взаимодействует с АТ тестовой линии. В результате появляется одна окрашенная розово-красная полоса.

3. Не связавшиеся на тестируемой полосе АТ (конъюгат) движется дальше и достигает контрольной линии, связывается с АТ контрольной линии. В результате появляется вторая окрашенная полоса. Если анализ проведен правильно, Контрольная линия должна проявляться всегда, независимо от присутствия исследуемого антигена (антитела) в образце биологической жидкости.

2. Условия проведения серологических реакций.

1. Наличие гомологичных – соответствующих друг другу антигена и антитела.

2. Чистая, сухая посуда.

3. Определенное соотношение препаратов (чаще всего равное).

4. Обязательное присутствие электролита (изотонический раствор NaCl).

5. рН нейтральный или близкий к слабощелочному.

6. Температура +37°С или комнатная (обязательно плюсовая).

7. Проводится контроль антигена и контроль сыворотки (антител).

3 Требования к сыворотке

Сыворотка должна быть совершенно прозрачная без примеси клеток

Получают на 2 неделе болезни обычно, когда уже есть в наличии антитела.

Кровь берут в количестве 3-5 мл натощак или через 6 ч. после еды.

Для получения сыворотки кровь оставляют на 1 час при комнатной температуре или центрифугируют. Отсасывают сыворотку очень осторожно, чтобы не захватить форменные элементы.

Иммунные сыворотки получают из крови людей или животных (чаще кроликов и лошадей), иммунизированных по определённой схеме соответствующим антигеном (вакциной). Готовят сыворотки обычно на производстве.

4. Понятие положительный и отрицательный результат.

РА.

При положительной реакции пассивно склеенные эритроциты покрывают дно лунки ровным слоем с фестончатыми краями («зонтик»); при отсутствии агглютинации эритроциты скапливаются в центральном углублении лунки, образуя компактную «пуговку» с резко очерченными краями (см. рисунки выше).

РП.

При положительном результате на границе двух растворов образуется кольцо молочного цвета (см. рисунки выше).

ИФА.

Изменение цвета раствора происходит при положительной реакции.

РСК.

Задержка гемолиза - реакция положительна; если комплемент свободен, наблюдается гемолиз - реакция отрицательна (см. рисунки выше).

Результаты реакции Вассермана:

а - полная задержка гемолиза (+ + ++);

б - выраженная задержка гемолиза (+ ++);

в - частичная задержка гемолиза (++);

г - слабая задержка гемолиза (+);

д - полный гемолиз (-).

Реакция положительна при частичной, выраженной и полной задержке гемолиза, определяемой по степени окрашивания содержимого пробирок от светло-розового до ярко-красного негемолизированные эритроциты впоследствии образуют осадок красного цвета.

Домашнее задание:

1. Изучите материал

Составьте 3 конспекта по видео