Peaaegu kõigi nakkushaiguste laboratoorne diagnostika põhineb seroloogiliste reaktsioonide meetoditega patogeeni antigeenide vastu toodetud antikehade tuvastamisel patsiendi veres. Nad asusid meditsiinipraktikasse üheksateistkümnenda sajandi lõpust kahekümnenda sajandi alguseni.
Teaduse areng on aidanud välja selgitada mikroobide antigeense struktuuri ja nende toksiinide keemilised valemid. See võimaldas luua mitte ainult terapeutilisi, vaid ka diagnostilisi seerumeid. Need saadakse nõrgestatud patogeenide manustamisel laboriloomadele. Pärast mitmepäevast kokkupuudet valmistatakse küülikute või hiirte verest preparaadid, mida kasutatakse mikroobide või nende toksiinide tuvastamiseks seroloogiliste testide abil.
Sellise reaktsiooni väline ilming sõltub selle tekkimise tingimustest ja antigeenide seisundist patsiendi veres. Kui mikroobiosakesed on lahustumatud, sadestuvad, lüüsivad, seonduvad või immobiliseeruvad nad seerumis. Kui antigeenid on lahustuvad, ilmneb neutraliseerimise või sadestumise nähtus.
Aglutinatsioonireaktsioon (RA)
Seroloogiline aglutinatsioonireaktsioon on väga spetsiifiline. Seda on lihtne teostada ja piisavalt visuaalne, et kiiresti määrata antigeenide olemasolu patsiendi vereseerumis. Seda kasutatakse Vidali reaktsiooni (tüüfuse ja paratüüfuse diagnoosimine) ja Weigli (tüüfuspalaviku) lavastamiseks.
See põhineb spetsiifilisel interaktsioonil inimese antikehade (või aglutiniinide) ja mikroobirakkude (aglutenogeenide) vahel. Pärast nende koostoimet tekivad osakesed, mis sadestuvad. See on positiivne märk. Reaktsiooni käivitamiseks võib kasutada elusaid või tapetud mikroobseid aineid, seeni, algloomi ja somaatilisi rakke.
Keemiliselt jaguneb reaktsioon kaheks etapiks:
- Antikehade (AT) spetsiifiline seos antigeenidega (AG).
- Mittespetsiifiline - AG-AT konglomeraatide sadestumine, see tähendab aglutinaadi moodustumine.
Kaudne aglutinatsioonireaktsioon (IPHA)
Selle tootmiseks kasutatakse puhastatud lamba erütrotsüüte ja inimese punaseid vereliblesid, mis on eelnevalt töödeldud antikehade või antigeenidega (oleneb, mida laborant täpselt leida soovib). Mõnel juhul ravitakse inimese punaseid vereliblesid immunoglobuliinidega. Erütrotsüütide seroloogilised reaktsioonid loetakse toimunuks, kui need on settinud toru põhja. Me võime rääkida positiivsest reaktsioonist, kui rakud on paigutatud ümberpööratud vihmavarju kujul, mis hõivavad kogu põhja. Negatiivne reaktsioon loetakse, kui erütrotsüüdid settivad kolonni või nupu kujul põhja keskel.
Sadestumise reaktsioon (RP)
Seda tüüpi seroloogilisi teste kasutatakse väga väikeste antigeeniosakeste tuvastamiseks. Need võivad olla näiteks valgud (või nende osad), valkude ühendid lipiidide või süsivesikutega, bakterite osad, nende toksiinid.
Reaktsiooniseerumid saadakse loomade, tavaliselt küülikute kunstliku nakatamise teel. Selle meetodi abil saate absoluutselt igasuguse sadestava seerumi. Seroloogiliste sadenemisreaktsioonide toimemehhanism on sarnane aglutinatsioonireaktsioonidele. Seerumis sisalduvad antikehad ühinevad antigeenidega, moodustades suuri valgumolekule, mis ladestuvad tuubi põhjale või substraadile (geelile). Seda meetodit peetakse väga spetsiifiliseks ja see võimaldab tuvastada isegi tühiseid ainekoguseid.
Kasutatakse katku, tulareemia, siberi katku, meningiidi ja muude haiguste diagnoosimiseks. Lisaks tegeleb ta kohtuarstliku ekspertiisiga.
geelis
Seroloogilisi reaktsioone saab läbi viia mitte ainult vedelas keskkonnas, vaid ka agargeelis. Seda nimetatakse hajussadestamise meetodiks. Tema abiga uuritakse komplekssete antigeensete segude koostist. See meetod põhineb antigeenide kemotaksilsel antikehadele ja vastupidi. Geelis liiguvad nad erineva kiirusega üksteise poole ja kokkusattudes moodustavad sademejooned. Iga rida on üks AG-AT komplekt.
Eksotoksiini neutraliseerimisreaktsioon antitoksiiniga (RN)
Antitoksilised seerumid on võimelised neutraliseerima mikroorganismide poolt toodetud eksotoksiini toimet. Need seroloogilised reaktsioonid põhinevad sellel. Mikrobioloogia kasutab seda meetodit seerumite, toksiinide ja toksoidide tiitrimiseks ning nende terapeutilise aktiivsuse määramiseks. Toksiini neutraliseerimise võimsus määratakse tavaliste ühikutega - AE.
Lisaks on tänu sellele reaktsioonile võimalik määrata eksotoksiini liik või tüüp. Seda kasutatakse difteeria, botulismi korral. Uuringut saab läbi viia nii "klaasil" kui ka geelis.
Lüüsireaktsioon (RL)
Patsiendi kehasse siseneval immuunseerumil on lisaks passiivse immuunsuse põhifunktsioonile ka lüüsivad omadused. See on võimeline lahustama mikroobseid aineid, rakulisi võõrelemente ja viirusi, mis sisenevad patsiendi kehasse. Sõltuvalt seerumis sisalduvate antikehade spetsiifilisusest eraldatakse bakteriolüsiinid, tsütolüsiinid, spirohetolisiinid, hemolüsiinid ja teised.
Neid spetsiifilisi antikehi nimetatakse "komplemendiks". Seda leidub peaaegu kõigis inimese kehavedelikes, see on keerulise valgustruktuuriga ning on äärmiselt tundlik temperatuuritõusu, raputamise, hapete toime ja otsese päikesevalguse suhtes. Kuid kuivatatud olekus suudab see säilitada oma lüüsivad omadused kuni kuus kuud.
Seda tüüpi seroloogilisi reaktsioone on olemas:
Bakteriolüüs;
Hemolüüs.
Bakteriolüüs viiakse läbi, kasutades patsiendi vereseerumit ja spetsiifilist immuunseerumit elusate mikroobidega. Kui veres on piisavalt komplemendi, näeb uurija, et bakter lüüsib ja reaktsioon loetakse positiivseks.
Vere teine seroloogiline reaktsioon seisneb selles, et patsiendi erütrotsüütide suspensiooni töödeldakse hemolüsiine sisaldava seerumiga, mis aktiveeritakse ainult teatud komplimendi olemasolul. Kui see on olemas, jälgib laborant punaste vereliblede lahustumist. Seda reaktsiooni kasutatakse tänapäeva meditsiinis laialdaselt komplemendi tiitri (st selle väikseima koguse, mis kutsub esile erütrotsüütide lüüsi) määramiseks vereseerumis ja komplemendi sidumise testimiseks. Sel viisil viiakse süüfilise seroloogiline reaktsioon läbi -
Komplemendi fikseerimise reaktsioon (CFR)
Seda reaktsiooni kasutatakse nakkustekitaja antikehade tuvastamiseks patsiendi vereseerumis, samuti patogeeni tuvastamiseks selle antigeense struktuuri järgi.
Siiani oleme kirjeldanud lihtsaid seroloogilisi reaktsioone. RSK-d peetakse keeruliseks reaktsiooniks, kuna selles ei interakteeru kaks, vaid kolm elementi: antikeha, antigeen ja komplement. Selle olemus seisneb selles, et antikeha ja antigeeni vaheline interaktsioon toimub ainult komplementvalkude juuresolekul, mis adsorbeeritakse moodustunud AG-AT kompleksi pinnale.
Antigeenid ise läbivad pärast komplemendi lisamist olulisi muutusi, mis näitavad reaktsiooni kvaliteeti. See võib olla lüüs, hemolüüs, immobiliseerimine, bakteritsiidne või bakteriostaatiline toime.
Reaktsioon ise toimub kahes faasis:
- Antigeen-antikeha kompleksi moodustumine, mis ei ole uurijale visuaalselt nähtav.
- Antigeeni muutmine komplemendi toimel. Seda faasi saab kõige sagedamini jälgida palja silmaga. Kui reaktsioon pole visuaalselt nähtav, kasutatakse muutuste tuvastamiseks täiendavat indikaatorisüsteemi.
indikaatorite süsteem
See reaktsioon põhineb komplemendi sidumisel. Tund pärast RSC seadistamist lisatakse katseklaasi puhastatud jäära erütrotsüüdid ja komplemendivaba hemolüütiline seerum. Kui katseklaasi jääb sidumata komplement, ühineb see lamba vererakkude ja hemolüsiini vahel moodustunud AG-AT kompleksiga ning põhjustab nende lahustumist. See tähendab, et RSK on negatiivne. Kui erütrotsüüdid jäid puutumata, on reaktsioon positiivne.
Hemaglutinatsiooni reaktsioon (RHA)
On kaks põhimõtteliselt erinevat hemaglutinatsioonireaktsiooni. Üks neist on seroloogiline, seda kasutatakse veregruppide määramiseks. Sel juhul interakteeruvad erütrotsüüdid antikehadega.
Ja teine reaktsioon ei kehti seroloogiliste kohta, kuna punased verelibled reageerivad viiruste toodetud hemaglutiniinidega. Kuna iga patogeen toimib ainult spetsiifilistele erütrotsüütidele (kana, lammas, ahv), võib seda reaktsiooni pidada väga spetsiifiliseks.
Kas reaktsioon on positiivne või negatiivne, saate teada vererakkude asukohast toru põhjas. Kui nende muster sarnaneb ümberpööratud vihmavarjuga, on soovitud viirus patsiendi veres olemas. Ja kui kõik erütrotsüüdid on moodustunud nagu mündisammas, siis pole soovitud patogeene.
Hemaglutinatsiooni pärssimise reaktsioon (HITA)
See on väga spetsiifiline reaktsioon, mis võimaldab teil määrata viiruste tüübi, tüübi või spetsiifiliste antikehade olemasolu patsiendi vereseerumis.
Selle olemus seisneb selles, et koos uuritava materjaliga katseklaasi lisatud antikehad takistavad antigeenide ladestumist erütrotsüütidele, peatades seeläbi hemaglutinatsiooni. See on kvalitatiivne märk konkreetse huvipakkuva viiruse spetsiifiliste antigeenide olemasolust veres.
Immunofluorestsentsreaktsioon (RIF)
Reaktsioon põhineb võimel tuvastada AG-AT komplekse pärast nende töötlemist fluorokroomvärvidega. Seda meetodit on lihtne käsitseda, see ei nõua puhaskultuuri eraldamist ja võtab vähe aega. See on hädavajalik nakkushaiguste kiireks diagnoosimiseks.
Praktikas jagunevad need seroloogilised reaktsioonid kahte tüüpi: otsesed ja kaudsed.
Direct RIF tehakse antigeeniga, mida on eelnevalt töödeldud fluorestseeruva seerumiga. Ja kaudselt töödeldakse ravimit esmalt tavapärase diagnostilise ainega, mis sisaldab huvipakkuvate antikehade antigeene, ja seejärel kantakse uuesti peale luminestsentsseerum, mis on spetsiifiline AG-AT kompleksi valkude suhtes ja mikroobirakud muutuvad mikroskoopias nähtavaks.
Komplemendi fikseerimise reaktsioon (RCC) seisneb selles, et kui antigeenid ja antikehad vastavad üksteisele, moodustavad nad immuunkompleksi, mille külge kinnitub komplement (C) antikehade Fc fragmendi kaudu, st komplement on seotud antigeeniga. antikehade kompleks. Kui antigeen-antikeha kompleksi ei moodustu, jääb komplement vabaks.
AG ja AT spetsiifilise interaktsiooniga kaasneb komplemendi adsorptsioon (seondumine). Kuna komplemendi sidumise protsess visuaalselt välja ei paista, tegid J. Bordet ja O. Zhangu ettepaneku kasutada indikaatorina hemolüütilist süsteemi (lamba erütrotsüüdid + hemolüütiline seerum), mis näitab, kas komplement on fikseeritud AG-AT kompleksiga. Kui AG ja AT vastavad üksteisele, st on tekkinud immuunkompleks, siis komplement seondub selle kompleksiga ja hemolüüsi ei toimu. Kui AT ei vasta AG-le, siis kompleks ei moodustu ja vabaks jääv komplement ühendub teise süsteemiga ja põhjustab hemolüüsi.
Reaktsiooni edenemine
Reaktsioon kulgeb kahes faasis, mis hõlmavad kahte süsteemi; bakteriaalne ja hemolüütiline. Esimene reaktsioon (spetsiifiline) hõlmab antigeen 4-+ antikeha + komplementi. Reaktsiooni positiivset tulemust, mis tekib siis, kui antikehad vastavad antigeenile, iseloomustab spetsiifilise bakteriaalse antigeeni-antikeha kompleksi moodustumine adsorbeeritud või, nagu öeldakse, "seotud" komplemendiga. Jäädes nähtamatuks, ei põhjusta kompleks väliseid muutusi keskkonnas, kus see tekkis. Negatiivne CSC tulemus ilmneb siis, kui antigeeni ja seerumi antikeha vahel puudub spetsiifiline afiinsus ja seda iseloomustab vaba aktiivse komplemendi peetus. RSC esimese faasi saab läbi viia termostaadis temperatuuril 37 °C (1-2 tundi) või külmkapis temperatuuril 3-4 °C (18-20 tundi). Antigeen-antikeha immuunkompleksi pikaajalisel moodustumisel külmas toimub komplemendi täielikum seondumine ja selle tulemusena suureneb reaktsiooni tundlikkus. Võrdlevate katsete püstitamisel nõukogude immunoloogi Acad. V. I. Ioffe ja tema õpilased näitasid, et pikaajalise komplemendi sidumise tingimustes külmas võib immuunseerumi kõrgete lahjenduste korral püüda kinni 100–500 korda väiksemas koguses antigeeni ja saada positiivseid tulemusi kui komplemendi sidumise katses temperatuuril 37 ° C 1-2 tunni jooksul. Reaktsiooni teine faas (indikaator) toimub hemolüütilise süsteemi reagentide vahel (3% erütrotsüütide suspensiooni ja hemolüütilise seerumi segu võrdsetes kogustes) temperatuuril 37 ° C ainult komplemendi juuresolekul, mis jääb reaktsiooni esimesest faasist vabaks (negatiivne reaktsioon) . Vaba aktiivse komplemendi puudumisel ei toimu erütrotsüütide hemolüüsi spetsiifiliste hemolüsiinide toimel (reaktsioon on positiivne).
Komponendid
Komplemendi fikseerimise test (RCC) on kompleksne seroloogiline test. Selle rakendamiseks on vaja 5 koostisosa, nimelt: AG, AT ja komplement (esimene süsteem), lamba erütrotsüüdid ja hemolüütiline seerum (teine süsteem).
CSC antigeeniks võivad olla erinevate tapetud mikroorganismide kultuurid, nende lüsaadid, bakterite komponendid, patoloogiliselt muutunud ja normaalsed elundid, kudede lipiidid, viirused ja viirust sisaldavad materjalid.
Täiendusena kasutatakse värsket või kuiva merisea seerumit.
reaktsiooni mehhanism
RSK viiakse läbi kahes faasis: 1. faas - antigeeni + antikeha + komplementi kolme komponenti sisaldava segu inkubeerimine; 2. faas (indikaator) - vaba komplemendi tuvastamine segus, lisades sellele hemolüütilise süsteemi, mis koosneb lamba erütrotsüütidest ja nende antikehi sisaldavast hemolüütilisest seerumist. Reaktsiooni 1. faasis toimub antigeen-antikeha kompleksi moodustumise ajal komplemendi sidumine ja seejärel 2. faasis antikehadega sensibiliseeritud erütrotsüütide hemolüüsi ei toimu; reaktsioon on positiivne. Kui antigeen ja antikeha ei ühti (uuritavas proovis ei ole antigeeni ega antikeha), jääb komplement vabaks ja 2. faasis liitub erütrotsüütide-antierütrotsüütide antikehade kompleksiga, põhjustades hemolüüsi; reaktsioon on negatiivne.
Rakendus
Komplemendi fikseerimist saab kasutada:
1) spetsiifiliste antikehade tuvastamine tundmatus seerumis, lähtudes nende interaktsioonist teadaoleva iseloomuga antigeeniga;
2) antigeeni omaduste uurimine reaktsioonis teadaoleva spetsiifilise seerumiga. Koostisosade ettevalmistamine RSK seadistamiseks.
1. Uuringu jaoks saadud vereseerumit kuumutatakse reaktsiooni käivitamise eelõhtul veevannis temperatuuril 56 °C 30 minutit, et inaktiveerida selle enda komplement. Inaktiveeritud seerumit võib hoida temperatuuril 3-4°C 5-6 päeva. Katsepäeval lahjendatakse seerum isotoonilise naatriumkloriidi lahusega vahekorras 1:5 (0,1 ml uuritavat seerumit + 0,4 ml isotoonilist naatriumkloriidi lahust).
2. RSK lavastamise antigeeniks võivad olla erinevate mikroobide kultuurid, bakteriaalsed valgud ja ekstraktid, mis on saadud mikroobikultuuridest, patoloogiliselt muutunud ja normaalsetest elunditest ja kudedest. Antigeeni valmistamise tunnused määravad nakkusprotsessi olemus ja selle patogeeni omadused.
3. Komplement on seerumisegu, mis on saadud 3-5 tervelt merisealt või kuiv komplement ampullides.
Vahetult enne kasutamist lahjendatakse merisea seerum isotoonilise aatriumkloriidi lahusega vahekorras 1:10, saades põhilahuse.
4. Hemolüütiline seerum inaktiveeritakse kuumutamisel temperatuuril 56 °C 30 minutit enne katse seadistamist. Kolmetiitrilist hemolüütilist seerumit kasutatakse RSK põhikogemuse kindlakstegemiseks, samuti komplemendi ja antigeeni tiitrimiseks. Näiteks kui hemolüütilise seerumi tiiter on 1:1800, kasutatakse reaktsioonis seerumi lahjendust 1:600.
5. Erütrotsüüdid saadakse defibrineeritud lambaverest. Veri fibriinikilede eemaldamiseks filtreeritakse läbi kolmekihilise marlifiltri. Saadud filtraati tsentrifuugitakse, seerum aspireeritakse ja kurnatakse ning erütrotsüüte pestakse 3-4 korda tsentrifuugimisega isotoopnaatriumkloriidi lahusega. Erütrotsüütide viimasel pesemisel peaks vedeliku supernatant olema täiesti läbipaistev. Pestud erütrotsüütidest valmistatakse 3% suspensioon isotoonilises naatriumkloriidi lahuses. Olles valmistanud CSC-s sisalduvad koostisosad ülaltoodud viisil, hakkavad nad hemolüütilist seerumit, komplemendi ja antigeeni tiitrima.
Reaktsiooni töötasid välja J. Bordet ja O. Zhangu 1901. aastal. Nad leidsid, et antigeen-antikeha kompleksi moodustumise ajal toimub komplemendi sidumine.
Moodustunud ühend on peeneks dispergeeritud ja seda ei määrata visuaalselt. Komplemendi adsorptsiooni (seondumise) tuvastamiseks kasutasid autorid hemolüütilist indikaatorsüsteemi: lamba erütrotsüüte ja hemolüütilist seerumit. Kui antigeen ei ühti testitavas süsteemis oleva antikehaga, siis immuunkompleks ei moodustu, komplement jääb vabaks. Komplement adsorbeeritakse ainult antigeeni-antikeha kompleksile, seda ei adsorbeerita eraldi antigeenile või antikehale. Seetõttu, kui testitavasse süsteemi lisada hemolüütiline süsteem, mis koosneb valmis antigeen-antikeha kompleksist (lamba erütrotsüüdid ja nende vastased antikehad), kinnitub selle kompleksi külge komplement, mis põhjustab lamba erütrotsüütide hemolüüsi – nähtav tulemus.
Komplemendi fikseerimise reaktsiooni (RCC) iseloomustab kõrge tundlikkus ja spetsiifilisus. RSK-d kasutatakse gonorröa, süüfilise, läkaköha, kõigi riketsiooside ja paljude viirushaiguste serodiagnostikas. Sarnaselt teiste seroloogiliste testidega saab RSK-d kasutada ka serotüpiseerimiseks.
RSK on keeruline seroloogiline reaktsioon. See hõlmab kahte antigeenisüsteemi - antikeha ja komplementi.
RSC seadistamiseks vajate:
Reaktsiooni keerukus on tingitud kaasatud koostisosade arvust ja peamiselt vajadusest määrata nende täpne kvantitatiivne suhe. Seetõttu eelneb põhikatse seadistamisele selle koostisosade tiitrimine.
Hemolüütiline seerum valmistatakse tööstuslikes tingimustes küüliku 3-4-kordse intravenoosse immuniseerimisega 50% lamba erütrotsüütide suspensiooniga ja inaktiveeritakse 56 ° C juures 30 minutit. Selle tiitrimiseks võetakse järjest kahanevaid annuseid (1:1200, 1:1500, 1:1800, 1:2000, 1:2500), 3% erütrotsüütide suspensiooni, komplementi 1:10 võrdsetes kogustes (kuid 0,5 ml). Hemolüütilise seerumiga ampullide etiketil on märgitud selle tiiter - maksimaalne lahjendus, mis tagab lamba erütrotsüütide 3% suspensiooni täieliku lüüsi komplemendi juuresolekul tunni jooksul temperatuuril 37 ° C. CSC puhul kasutatakse seerumi lahjendust, mida suurendatakse tiitri suhtes 3 korda.
Lamba erütrotsüütide suspensioon 3% saadakse defibrineeritud lambaverest isotoonilise NaCl lahusega pesemise teel.
Komplement – värske või kuivatatud merisea seerum – tiitritakse enne katset: järjest kahanevad annused (1:10, 1:15, 1:20, 1:25, 1:30, 1:35, 1:40) + hemolüütiline süsteem ( lamba erütrotsüüdid ja hemolüütiline seerum). Pärast inkubeerimist termostaadis 37°C juures määratakse komplemendi tiiter – kõrgeim lahjendus, mis põhjustab erütrotsüütide täielikku lüüsi hemolüütilise seerumi juuresolekul. Komplemendi töödoos peaks olema tiitrist 25% kõrgem, sest. komplemendi aktiivsust katses võivad teised reaktsioonikomplemendid (antigeen, seerum) mõnevõrra alla suruda.
Antigeen – tapetud mikroorganismide, nende lüsaatide, terviklike antigeenide, hapteenide, koelipiidide ekstraktide suspensioon – seob mõnikord komplemendi isegi immuunseerumi puudumisel, mistõttu tuleb seda ka tiitrida. Võetakse järjest kahanevaid antigeeni annuseid + komplemendi tööannus + hemolüütiline süsteem. Antigeeni tiiter on selle madalaim annus, mille juures toimub selge hemolüüs. CSC puhul võtke komplemendi sidumise vältimiseks antigeeni annus poole võrra tiitri suhtes.
Testseerum inaktiveeritakse 56 °C juures 30 minutit enne katset. Enda täienduse inaktiveerimiseks.
Kõik komplemendi sidumise reaktsiooni komponendid võetakse võrdsetes kogustes.
Põhikogemuse avaldus.
Pärast kõigi koostisosade tiitri ja tööannuste kindlaksmääramist pannakse RSK põhikogemus. Reaktsioonis osalevad ka tiitritud seerumid: ilmselgelt terved ja ilmselgelt haiged (vastavalt negatiivsed ja positiivsed seerumid). Lisaks testitud seerumile inaktiveeritakse ka kontrollseerumid 56 °C juures 30 minutiks.
RSK viiakse läbi kahes etapis:
I faas - spetsiifiline - antigeeni, antikeha ja komplemendi segu inkubeerimine termostaadis temperatuuril 37 ° C 30 minutit.
II faas - indikaator - vaba komplemendi olemasolu määramine segus hemolüütilise süsteemi lisamisega (eelnevalt 30 minutiks termostaadisse pandud) ja inkubeerimine termostaadis 37 °C juures 20-30 minutit.
Katse tulemusi hinnatakse hemolüüsi olemasolu või puudumise märgimise teel kõigis katseklaasides (vt tabelit). Reaktsioon loetakse positiivseks, kui hemolüüs on täielikult hilinenud, kui vedelik katseklaasis on värvitu ja erütrotsüüdid settivad põhja, negatiivseks, kui vedelik on intensiivselt määrdunud ("lakiveri"). Hemolüüsi intensiivsuse astet hinnatakse sõltuvalt vedeliku värvuse intensiivsusest ja erütrotsüütide setete hulgast põhjas (+ + + +, + + +, + +, +).
RSC tulemuste arvestus.
Katse tulemusi (testseerumiga) on võimalik arvesse võtta ainult siis, kui kõik kontrollid on õigesti läbinud.
Positiivse seerumiga (sisaldab selle antigeeni antikehi) katseklaasis nr 2 ei tohiks olla hemolüüsi, sest. komplement on seotud esimeses spetsiifilises süsteemis ja hemolüütiline süsteem jäi ilma komplemendita - erütrotsüüdid settivad põhja, supernatant on läbipaistev.
Negatiivse seerumiga katseklaasis nr 3, terve inimese seerum, mis ei sisalda selle antigeeni antikehi, peaks olema hemolüüs, kuna reaktsiooni esimeses faasis antigeeni-antikeha kompleksi ei moodustunud (tingituna selle antigeeni vastaste antikehade puudumisele) ja komplement jäi vabaks. Kui reaktsiooni teises faasis lisati hemosüsteem, adsorbeeriti komplement valmis immuunkompleksile, jäära erütrotsüüdid pluss nende vastased antikehad; toimus lamba erütrotsüütide lüüs (hemolüüs).
Hemolüüsi esinemine seerumis ja antigeeni kontrollides (tuubid 4 ja 5) näitab, et nende annused valiti õigesti ning seerum ega komplemendi antigeen ei seondu iseenesest. Konkreetses süsteemis vabaks jäänud komplement adsorbeerub hemolüütilise süsteemi immuunkompleksi poolt ja toimub hemolüüs.
Hemolüüs komplemendi kontrollis (toru nr 6) näitab komplemendi aktiivsust ja selle tööannuse õiget valikut.
Hemolüütilise süsteemi (katseklaas nr 7) juhtimisel ei tohiks selle süsteemi õige töö korral olla isegi hemolüüsi jälgi, sest sellel puudub täiendus.
Täiuslike kontrollitulemuste korral saate kogemusi arvesse võtta (toru nr 1). Hemolüüsi puudumist peetakse positiivseks tulemuseks. See näitab, et uuritavas seerumis leiti selle antigeeni vastaseid antikehi (inimene on haige). Kui antigeen vastab antikehale, moodustub antigeen-antikeha kompleks, mis seob komplementi (I faas). Hemolüütilise süsteemi lisamisega ei toimu II faasis erütrotsüütide hemolüüsi. Hemolüüsi esinemine on negatiivne tulemus, mis näitab selle antigeeni antikehade puudumist (inimene on terve). Komplement jääb vabaks ja hemolüütilise süsteemi lisamisel liitub erütrotsüütide-hemolüsiini kompleksiga, põhjustades hemolüüsi.
Komplemendi sidumisreaktsioon seisneb selles, et antigeeni kombinatsioon vastava antikehaga eemaldatakse värskest seerumist ja säilitab (seondub) selles kindlalt komplemendi. Seda kasutatakse antikehade tuvastamiseks ja antigeenide olemuse määramiseks. Spetsiifilise afiinsuse puudumisel antigeeni ja seerumi vahel ei toimu komplemendi adsorptsiooni.
Selle reaktsiooni jaoks on vaja järgmisi koostisosi:
- 3 või 5% lamba erütrotsüütide suspensiooni;
- hemolüütiline seerum annuses, mis vastab selle kolmekordsele tiitrile;
- komplement tiitrimisega määratud annuses; antigeen, mis ei põhjusta iseseisvalt hemolüüsi ega selle hilinemist, tiitrimisega määratud annuses;
- testitav seerum, mis aktiveeritakse 56°C juures 15–30 min veevannis ja lahjendatakse vahekorras 1:5 või 1:10; steriilne soolalahus (0,85%).
Lamba erütrotsüüdid. Lamba erütrotsüüdid saadakse reaktsiooni eelõhtul, torgates aseptilistes tingimustes kanüüli abil lamba kaelaveeni. Veri kogutakse steriilsesse klaashelmestega purki, mida loksutatakse defibrineerimiseks 10–15 minutit. Pärast seda filtreeritakse veri läbi mitme kihi marli ja erütrotsüüte pestakse kolm korda tsentrifuugis soolalahuses. Viimane osa pesuvedelikku peab olema värvitu.
Reaktsiooni seadistamiseks kasutatakse 1–3% erütrotsüütide suspensiooni, mis valmistatakse 1 ml pestud erütrotsüütide settest + 33 ml soolalahusest. Külmikus võivad punased verelibled vastu pidada viis kuni kuus päeva. Pikemaks säilitamiseks pestakse neid järgmise koostisega Ringer-Locke'i vedelikus: NaCl - 9,0 g, KCl - 0,2 g, CaCl2 - 0,2 g, NaHCO3 - 1,0 g 1 liitri destilleeritud vee kohta. Vedelikku steriliseeritakse auruga 30 minutit ja seejärel lisatakse 10 g kristalset boorhapet. Liustikul säilib see vedelik kaks kuni kolm nädalat.
Erütrotsüüte saab konserveerida ka formaliiniga, lisades 10 ml erütrotsüütide settele 1 ml järgmise koostisega formaliinilahust: 4 ml 40% formaliini 200 ml soolalahuse kohta.
Hemolüütiline seerum. Hemolüütilise seerumi saamiseks süstitakse küülikutele kolm kuni neli korda intravenoosselt 50% lamba erütrotsüütide suspensiooni, 2–5 miljonit kahe-kolmepäevaste intervallidega. Kuuendal või seitsmendal päeval pärast immuniseerimise lõppu kontrollitakse seerumi tiitrit. Kui see ei ole madalam kui 1:1200, võetakse loomalt verd südamest või kõrva ääreveenist. Pärast 30-minutilist inaktiveerimist veevannis temperatuuril 55°C säilitatakse seerum, lisades sellele 1% kuiva boorhapet. Seerumi säilitamiseks võite kasutada võrdses koguses steriilset glütseriini, mida kuumutatakse 180 ° C juures 15 minutit, või lisada 1 ml segu 9 ml selle koostisega seerumi kohta - 5,5 ml karboolhapet + 20 ml glütserooli + 74,5 ml destilleeritud vett. Võite kasutada ka 0,05% chinosooli. Seerumit tuleks hoida liustikul suletud katseklaasides.
Hemolüütilise seerumi tiiter määratakse vastavalt järgmisele skeemile.
Katsudes mõõdetakse järjestikku 0,5 ml saadud lahjendusi, alustades vahekorrast 1:1000. Seejärel lisatakse 0,5 ml 3% erütrotsüütide suspensiooni, 0,5 ml lahjendatud 1:10 komplementi ja 1 ml soolalahust. iga toru. Seerumi lahjendusi tuleb mõõta gradueeritud pipetiga, alustades viimasest katsutist, mis sisaldab seerumi minimaalset lahjendust, et mitte rikkuda lahjenduste täpsust.
Allpool on toodud hemolüütilise seerumi tiitrimisskeem.
Hemolüütilise seerumi tiiter on selle maksimaalne lahjendus, millest 0,5 ml võib lahustada 0,5 ml erütrotsüütide suspensiooni 0,5 ml (lahjendatud) komplemendi juuresolekul 1 tunni jooksul sobival temperatuuril.
Hemolüütilist seerumit (hemolüsiin, Ehrlichi hemolüütiline amboceptor) saab osta vastavatest tarneorganisatsioonidest. See vabaneb 1-2 ml ampullides ja on kasutatav kuus kuud. Ampullidel on näidatud tiiter, st seerumi maksimaalne lahjendus, mis segamisel võrdse mahu (igaüks 0,5 ml) 10% komplemendiga hemolüüsib täielikult 0,5 ml lamba erütrotsüütide suspensiooni pärast 1-tunnist seismist. termostaat. Seerumi tiitrit tuleb aeg-ajalt kontrollida. Põhieksperimendi seadistamiseks, samuti antigeeni ja komplemendi tiitrimiseks kasutatakse lahjendust, mis on kolm korda väiksem tiitrist. Näiteks kui tiiter on 1:1200, võtke lahjendus 1:400 (0,1 ml hemolüütilist seerumit + 40 ml soolalahust).
Pärast ampulli avamist valatakse järelejäänud seerum kuiva steriilsesse tuubi ja hoitakse külmas.
Täiendage. Komplementaarne funktsioon avaldub kõige intensiivsemalt imetajate seerumis ja eriti merisea seerumis. Seetõttu kasutatakse täiendusena aktiivset merisea seerumit.
Seerum saadakse südamepunktsiooni teel kolmest-viiest tervest mittetiine ja töötlemata merisea proteiinist, segades üksikuid portsjoneid omavahel. Pärast fibriini trombi moodustumist eraldatakse viimane katseklaasi seintest, mis asetatakse liustikule. Järgmisel päeval imetakse ära selge seerum, mida nimetatakse komplemendiks. Reaktsiooni jaoks on vaja kasutada ainult eelmisel päeval saadud komplementi, kuna selle aktiivsus püsib liustikul üks või kaks päeva. Komplementi saab säilitada 4% boorhappe ja 5% kuiva naatriumsulfaadi lisamisega. Pärast nende ainete lahustumist asetatakse komplement liustikule. Enne iga katset tehakse komplemendi tiitrimine, et määrata nn töödoos. Valmistage gradueeritud pipetiga ette komplemendi põhilahjendus 1:10 (1 ml komplementi + 9 ml soolalahust), mis valatakse 0,05–0,5 ml katsutitesse, mille järel reguleeritakse iga katseklaasi maht soolalahusega. 1,5 ml-ni, asetades need seejärel termostaadi. 15 minuti pärast lisatakse 3% lamba erütrotsüütide suspensioonile võrdne kogus hemolüsiini, mis on võetud kolmekordse tiitrina. Pärast kolme vereülekannet ühest anumast teise hoitakse saadud segu veel 30 minutit termostaadis. Seejärel lisatakse kõikidesse komplemendi lahjendustega katseklaasidesse 1 ml hemolüütilist segu, loksutatakse põhjalikult ja asetatakse uuesti 30 minutiks termostaadi. Kahe kontrollina kasutatakse 1 ml hemolüütilist süsteemi + 1,5 ml füsioloogilist lahust ja 0,5 ml komplementi, mis on lahjendatud 1:10 + + 0,5 ml erütrotsüütide suspensiooni + 1,5 ml soolalahust.
Komplemendi tiiter on minimaalne kogus, mille juuresolekul 0,5 ml hemolüütilist seerumit kolmekordses tiitris suudab 37 ° C juures 30 minuti jooksul lüüsida 0,5 ml 3% erütrotsüütide suspensiooni.
Teiste reaktsioonis osalevate koostisosade (antigeen, hemolüütiline seerum) antagonistliku toime tõttu komplemendile tuleks praktikas suurendada komplemendi annust 20–35%, mis on nn töödoos. Nii et tiitriga 0,25 on töödoos 0,3–0,33. Teadaoleva antikomplementaarse võimega antigeenide kasutamisel on aga vaja määrata komplemendi töödoos antigeeni juuresolekul vastavalt järgmisele skeemile.
Kui antigeenil ei ole komplementaarseid omadusi, jääb komplemendi tööannuseks see, mis määrati komplemendi tiitrimisega per se.
Sama sea südame torke võib korrata mitu korda kolme- kuni neljanädalaste intervallidega.
Antigeen. Antigeen valmistatakse bakterikultuurist. Lihtsaim antigeen on mikroobide suspensioon destilleeritud vees või soolalahuses, mis tapetakse kuumutamisel 60 °C juures 1 tund või 100 °C juures 15–20 minutit.
Antigeenina võib kasutada ka formaliini aurude poolt tapetud või alkoholiga töödeldud mikroobisuspensiooni. Alkoholiga töödeldud antigeeni saamiseks toimige järgmiselt: 24-tunnise agarkultuuri suspensiooni, mida on eelnevalt pestud soolalahusega, tsentrifuugitakse. Vedelik dekanteeritakse ja sade valatakse 95° alkoholiga vahekorras 1:5, misjärel jäetakse kaheks kuni kolmeks päevaks toatemperatuurile. Pärast alkoholi eemaldamist valatakse mikroobide setted füsioloogilise soolalahusega ja konserveeritakse 1% kuiva boorhappe lisamisega. Reaktsiooni jaoks lahjendatakse esialgne suspensioon vastavalt optilisele standardile, mis sisaldab 1 miljardit bakterikeha 1 ml kohta, kasutades seda antigeenina koguses 0,5 ml.
Antigeenina võivad toimida ka mikroobsed lüsaadid destilleeritud vees või soolalahuses, mis on saadud Schutteli aparaadis või pärast töötlemist antiformiiniga.
Antigeeni saamiseks tuleb kultuuri töötlemisel antiformiiniga lisada 2 ml 3–4% antiformiini, mis on neutraliseeritud lakmusega 4% H2SO4 lisamisega, igapäevasele bakterite agarkultuurile, mida pestakse 1,5 ml lahusega. füsioloogiline soolalahus. Kloor eemaldatakse lüsaadi kuumutamisel veevannis 55–65°C juures 30 min joodi-tärklise paberi kontrolli all, mis kloori mõjul omandab mustjasvioletse värvuse.
Dialüüsitud bakteriaalsel polüsahhariidil ja ka Boivini meetodil saadud täielikul antigeenil on kõrged antigeensed omadused.
Erinevate meetoditega saadud antigeenides määratakse tiiter, samuti antagonistlikud omadused seoses komplemendi aktiivsusega (antikomplementaarsus) ja hemotoksilisusega - võime põhjustada erütrotsüütide lüüsi seerumi ja komplemendi puudumisel.
Antigeeni tiitrit nimetatakse selle koguseks 1 ml-s, reaktsiooni kogumahuga 2,5 ml, mille juures toimub selge hemolüüs. Antigeeni võetakse koguses 0,5 ml. Töödoosi määramiseks mõõdetakse mitmes katseklaasis antigeeni koguses 0,1; 0,2 jne. kuni 0,5 ml, millele lisatakse füsioloogilist soolalahust kuni 1 ml. Seejärel lisage 0,5 ml tööannust sisaldavat komplemendi lahjendust ja 0,5 ml soolalahust, loksutage ja asetage 1 tunniks termostaadi. Pärast seda võtavad nad selle termostaadist välja ja märgistavad tuubi maksimaalse antigeenisisaldusega, milles hemolüüsi veel täheldatakse. Antigeeni kogus selles katseklaasis näitab antigeeni lahjendusannust. Edasiseks testimiseks vajalik antigeeni ligikaudne annus on 1/2 või 2/3 lahustuvast annusest. Spetsiifilisuse määramiseks testitakse seda teadaolevate positiivsete ja negatiivsete seerumitega. Seda tüüpi antigeeni eduka tiitrimise korral võetakse leitud doos selle tiitriks, mida kasutatakse reaktsiooni seadistamiseks. Antigeeni ligikaudse annuse määramise skeem on järgmine.
Antikomplementaarsus määratakse paralleelse komplemendi filtreerimisega per se antigeeni juuresolekul, mis ei tohi komplemendi aktiivsust pärssida rohkem kui 30%, vastasel juhul ei sobi see reaktsiooniks.
Hemotoksilisuse määramiseks lisatakse 1 ml tiitriga lahjendatud antigeenile 0,5 ml 3% erütrotsüütide suspensiooni ja 1 ml füsioloogilist lahust ning asetatakse 1 tunniks termostaadi. Hemolüüsi puudumine näitab antigeeni hemotoksiliste omaduste puudumist. Tuleb märkida, et kõik bakteriaalse päritoluga antigeenid (suspensioonid, lüsaadid, ekstraktid) tuleb enne katset tiitrida, välja arvatud bakteriaalne alkoholi antigeen, mis on üldiselt võimeline oma tiitrit pikka aega säilitama. Lisaks välistab teatud kontsentratsiooniga bakterisuspensioon (näiteks optilise standardi järgi 1 miljard rakku 1 ml-s) ka tiitrimise vajaduse, kuna 0,5 ml sellisel suspensioonil puuduvad komplementaarsed ja hemotoksilised omadused. Säilitusantigeenid peaksid olema liustikul.
Seerumid. Tundmatu antigeeni määramiseks kasutatakse spetsiifilist immuunseerumit, mis saadakse küülikute immuniseerimisel ja millel on enamasti kõrge tiiter. Saadud seerum inaktiveeritakse veevannis temperatuuril 55–56 °C 30 minutit. Inaktiveerimine viiakse läbi seerumi kolloidide stabiliseerimiseks. Sellist vadakut võib liustikul säilitada viis kuni kuus päeva. Selle säilivusaeg pikeneb kahe kuni kolme nädalani, kui inaktiveeritud seerumile lisatakse 2% kuiva boorhapet või 4% kuiva boorhappe ja 5% kristalse naatriumsulfaadi segu. Seerumeid hoitakse suletud ampullides.
Reaktsiooni läbiviimine. Reaktsiooni seadistamisel segatakse esmalt testitav seerum, antigeen ja komplement nii, et iga koostisosa kogus oleks 0,5 ml. Pärast iga katsuti põhjalikku loksutamist asetatakse alus 1 tunniks 37 ° C juures termostaadi. 30 minuti pärast valmistatakse hemolüütiline süsteem, st 3% lamba erütrotsüütide suspensiooni segatakse võrdsetes kogustes lahjendatud hemolüütilise seerumiga. kolmekordse tiitri järgi. Segu asetatakse 30 minutiks termostaadi. Pärast määratud ajavahemikku lisatakse kõikidesse katsutitesse 1 ml hemolüütilist süsteemi, segatakse põhjalikult ja asetatakse 40–60–120 minutiks termostaadi, sõltuvalt hemolüüsi ajast antigeeni mittesisaldavates kontrollkatsutites. Seejärel tehakse esimene katse tulemuste määramine, misjärel asetatakse statiiv 12–18 tunniks jääkasti või jäetakse toatemperatuurile. Pärast seda perioodi võetakse arvesse katse lõpptulemusi.
Täieliku hemolüüsi (lakivere) juuresolekul kõigis neljas seerumi uurimiseks võetud katsutis loetakse tulemus negatiivseks. Esimese kolme katseklaasi positiivsete tulemuste korral hemolüüs viibib ja neljandas (seerumi kontroll), mis ei sisalda antigeeni, täheldatakse täielikku hemolüüsi. Hemolüüsi hilinemise astet tähistatakse tavaliselt ristide arvuga.
(++++) - hemolüüsi täielik hilinemine (värvitu vedelik, märkimisväärne muutumatute erütrotsüütide sete);
(+++) - selge viivitus (kergelt roosa värvi vedelik, märkimisväärne erütrotsüütide sete);
(++) - osaline peetus (vedelik on intensiivselt värvitud, üsna kompaktne erütrotsüütide sete);
(+) - nõrk peetus (vedelik on intensiivse värvusega, ebaoluline erütrotsüütide sete);
(±) - hilinemise jäljed (vedelik on intensiivselt värvitud, sete on pilve kujul);
(-) - täielik hemolüüs (vedelik on intensiivse värvusega, setted puuduvad, negatiivne reaktsioon).
Siin on diagramm põhikogemusest.
Komplemendi fikseerimise reaktsioon (CFR) kasutatakse spetsiifilise antigeeni vastaste antikehade tuvastamiseks või antigeeni tüübi määramiseks teadaoleva antikeha abil. See on keeruline seroloogiline reaktsioon, mis hõlmab kahte süsteemi ja komplementi. Esimene süsteem on bakterioloogiline (peamine), koosneb antigeenist ja antikehast (üks on teada, teine mitte). Teine süsteem on hemolüütiline (indikaator). See sisaldab lamba erütrotsüüte (antigeen) ja neile vastavat hemolüütilist seerumit (antikeha). RSK pannakse kahes etapis: esmalt kombineeritakse antigeen testitava vereseerumiga, milles otsitakse antikeha ja seejärel lisatakse komplement. Kui antigeen ja antikeha ühtivad, moodustub immuunkompleks, mis seob komplementi. Antikehade puudumisel seerumis immuunkompleks ei moodustu ja komplement jääb vabaks. Kuna kompleksi poolt komplemendi adsorptsiooni protsess on visuaalselt nähtamatu, lisatakse selle protsessi paljastamiseks heemisüsteem. Reaktsiooni võetakse arvesse järgmiselt. Kui esimeses (tagasüsteemis) on komplement seotud, siis hemesüsteemi lisamisel erütrotsüütide hemolüüsi ei toimu - reaktsioon on positiivne. Kui komplement ei seondunud esimeses süsteemis antikehade puudumise tõttu, siis see seondub heemsüsteemiga, mille tulemuseks on erütrotsüütide hemolüüs – reaktsioon on negatiivne.
CSC antigeenid valmistatakse tapetud ja hävitatud mikroobidest, sagedamini ekstraheerimise teel.
RSK-d kasutatakse laialdaselt brutselloosi, malleuse, riketsioosi, suu- ja sõrataudi ja paljude teiste diagnoosimiseks.
Pikaajaline komplemendi sidumise reaktsioon (RDSC). See on tavapärase RSC variant, kuid erineb selle poolest, et reaktsiooni esimene faas kestab 16–18 tundi külmas (4°С). Sellistes tingimustes seonduvad krüofiilsed (külmad) antikehad täiendavalt esimeses süsteemis olevas antigeen-antikeha-komplemendi kompleksis, mis suurendab reaktsiooni tundlikkust. Seda võimalust kasutatakse brutselloosi, kampülobakterioosi jne diagnoosimiseks.
Komplemendi sidumise reaktsiooni (RSK) kirjeldasid esmakordselt Bordet ja Zhang (1901). Erinevalt RA-st ja RP-st ilmneb CSC-s antigeeni seos antikehaga ainult kolmanda komponendi - komplemendi - juuresolekul.
kompleksne moodustumise reaktsioon, antigeen - antite Lo – täiend – nähtamatu. Reaktsioonikomponentide täpsustatud interaktsiooni tuvastamiseks kasutatakse täiendavat indikaatorisüsteemi, mis oma manifestatsiooni nähtavuse tõttu peegeldab kaudselt interaktsiooni tulemust esimeses süsteemis. Sellel viisil; CSC-s on kaasatud kaks süsteemi: 1) bakteriolüütiline (diagnostiline) ja 2) hemolüütiline (abiindikaator), mis võimaldab kindlaks teha, kas esimeses süsteemis on toimunud komplemendi sidumine. Varem kasutati antigeenina bakterite suspensiooni ja positiivsetel juhtudel toimus nende lüüs (bakteriolüüs), mistõttu esimest süsteemi nimetati bakteriolüütiliseks. Järelikult põhines CSC kahel nähtusel, bakteriolüüsil ja hemolüüsil.
RSC viiakse läbi kahes etapis. Esiteks valmistatakse ette bakteriolüütiline süsteem - katseklaasides segatakse 0,5 ml uuritud inaktiveeritud seerumit antigeeniga, lisatakse komplementi rangelt määratletud koguses (tiiter). Antigeeni - antikeha (seerumi) - komplemendi (bakteriolüütilise süsteemi) segu asetatakse 20-40 minutiks veevanni (või termostaati) temperatuuril 37-38 ° C. Järgmisena jätkake reaktsiooni teise etapiga - lisage teise hemolüütilise süsteemi komponendid kõikidesse katseklaasidesse ja pange need uuesti 15-20 minutiks veevanni. Seejärel võtke arvesse esialgset tulemust (on või ei ole hemolüüsi), jätke järgmise päevani toatemperatuurile ja tehke CSC lõplik arv. Hemolüüsi puudumine (positiivne diagnostiline tulemus) viitab sellele, et uuritav seerum sisaldab võetud antigeenile spetsiifilisi antikehi, esimeses süsteemis on tekkinud antigeen-antikeha kompleks, komplement on seondunud. Lisatakse teise süsteemi komponendid - hemolüsiin ja erütrotsüüdid, mis üksteise suhtes on ühtlasi antigeen (erütrotsüüdid) ja antikeha (hemolüsiin) ning interakteeruvad komplemendi juuresolekul. Kui uuritavas seerumis puuduvad võetud antigeenile spetsiifilised antikehad, antigeen-antikeha kompleks ei moodustu ja komplement esimeses bakteriolüütilises süsteemis ei adsorbeeru, jääb see katseklaasis vabaks, siis kui teine (hemolüütiline) süsteem lisatakse, komplement interakteerub antigeen-antikeha kompleksiga (hemolüsiin - erütrotsüüdid) ja toimub hemolüüs (erütrotsüütide lüüs). Diagnostika tulemus on negatiivne. Seega on RSK-s kaasatud 5 komponenti: antigeen, antikeha (testitud seerum), komplement, hemolüsiin ja oina erütrotsüütide suspensioon. Kõigi komponentide lahjendamiseks kasutatakse elektrolüüdikeskkonda - NaCl soolalahust.
RSK rajamiseks diagnostikalaboris on vaja: laborisse uuringuteks saadud loomade seerumiproovid; kaks teadaolevalt positiivset seerumit (standardne, hüperimmuunne, andes positiivse tulemuse – kontroll) ja kaks tervete loomade normaalset seerumit – samuti kontrolli jaoks (kõik seerumid lahjenduses 1:10 inaktiveeritakse, et hävitada nende enda komplement kuumutamise teel veevann temperatuuril 56–58 ° Alates 30 minutist); tiitri järgi lahjendatud antigeen (näidatud biotehasega pakendil); komplement (merisea seerum), mis on lahjendatud vastavalt kehtestatud tiitrile (tiitrimise ajal); hemolüsiin töötiitris; lamba erütrotsüütide suspensioon lahjenduses 1:40, füsioloogiline soolalahus, erineva võimsusega gradueeritud pipetid, katseklaasid, alused, veevann, kummipirnid.