פרופסור חבר להנדסה כימית בווירג'יניה טק צ'אנג לו. (צילום: וירג'יניה טק)
פרופסור חבר להנדסה כימית בווירג'יניה טק ( וירג'יניה טק) צ'אנג לו וצוות המחקר שלו של מהנדסים כימיים מצאו כיצד "לשפר באופן משמעותי" את אספקת החומר הגנטי לתא - DNA. מאמר המתאר את עבודתם פורסם בכתב העת הראשי למיקרופלואידיקה מעבדה על צ'יפ, כמו גם ב טֶבַע .
המטרה הסופית של ד"ר לו היא ליישם את השיטה שלהם ליצירת תאים מהונדסים גנטית לטיפול אימונותרפי בסרטן. תאי גזעוהתחדשות רקמות.
אחת השיטות הפיזיקליות הנפוצות ביותר להעברת גנים לתא היא "לא יעילה להפליא מכיוון שרק חלק קטן משטח הממברנה הכולל הוא חדיר", אומר ד"ר לו.
השיטה שאליה פנה לו נקראת אלקטרופורציה, בשם התופעה הידועה מזה עשרות שנים של הגברת חדירות התאים כתוצאה מהפעלת שדה חשמלי עליהם, המוביל להיווצרות נקבוביות זעירות בקרום שלהם.
ד"ר לו מסביר את מנגנון הפעולה של שיטת האלקטרופורציה ששופר על ידו ועל ידי עמיתיו באופן זה: "שיטות אלקטרופורציה קונבנציונליות מספקות DNA רק דרך חלק מוגבל מאוד של פני התא, שנקבע על ידי התופעות הפיזיקליות השולטות באינטראקציות בין שדה חשמלי והתא. השיטה שלנו מאפשרת להגיע למסירה אחידה של DNA על פני כל פני התא, אשר, למיטב ידיעתנו, הוכח לראשונה. התוצאה היא עלייה עצומה בהעברת החומר הגנטי”.
הגישה החדשה משתמשת ב"אפקטים הידרודינמיים המתרחשים רק כאשר זרימת נוזלים נעה דרך תעלות מעוקלות. ידוע שבתנאים כאלה הזרימה יוצרת מערבולות. התאים הנישאים בזרימה כזו מסתובבים, ורוב שטח הפנים שלהם חשוף לשדה החשמלי. לאספקת גנים על ידי זרימה בתעלות מעוקלות יש יתרונות משמעותיים על פני האלקטרופורציה המסורתית בתמיסות סטטיות ובערוצים ישרים.
"הערוץ הספירלי נותן גידול פי שניים בהשוואה לתעלה ישרה ואף יותר בהשוואה לפתרון סטטי", מסביר המדען.
באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, המדענים הצליחו "למפות" את האזורים האלקטרו-פורציים על פני התא ולקבוע את היקף בליעת ה-DNA.
תמונה באדיבות Lab on a Chip
מסירת DNA קונבנציונלית באמצעות מכשירים מסוג קובטות עם תרחיף תאים סטטי מתרחשת רק בפס צר של פני התא. כאשר מבוצעת אלקטרופורציה על תאים צפים בתעלה ספירלית או מעוקלת, התמונות שונות באופן משמעותי, מה שמדגים פיזור אחיד של העברת DNA על פני כל פני התא.
ההמצאה מתייחסת לתחום הביוטכנולוגיה, בפרט לשיטה לאספקה ממוקדת של DNA לתאי גידול ותאי גזע המבטאים את הקולטן CXCR4. ניתן להשתמש בהמצאה הנוכחית לאספקה ממוקדת של מבנים גנטיים לתאי גזע ותאי גידול ממאירים על מנת לתקן פגמים בגנים ולמנוע מחלות. השיטה כוללת הכנת נשאים של מבנים גנטיים על ידי הכללת רצפי אותות בהרכב מולקולות הנשאים, שהוא רצף קושר DNA של שמונה שיירי חומצות אמינו של ליזין - KKKKKKKKK. הצמדת רצף האותות לרצף קושר ה-DNA מתבצעת באמצעות קטע קישור של שתי מולקולות של חומצה ε-aminohexanoic. לאחר מכן נוצרים קומפלקסים של DNA/נשא. לאחר מכן ההעברה מתבצעת במבחנה. ההמצאה המוצעת מאפשרת להגביר את היעילות של העברת הגן המעניין לתאי גידול ותאי גזע. 2 w.p. פלי, 4 חולה.
ההמצאה מתייחסת לרפואת גנים, ריפוי גנטי, ביוטכנולוגיה ותרופות וניתן להשתמש בה לאספקה ממוקדת של מבנים גנטיים לתאי גזע ותאי גידול ממאירים על מנת לתקן פגמים בגנים ולמנוע מחלות. מסירה ספציפית לרקמות של מבני גנים מובטחת באמצעות שימוש ברצפי אותות לקולטן CXCR4, המתבטא בתאים מסוג זה.
מה שמבדיל את הטיפול הגנטי מגישות הרפואה הקונבנציונלית הוא ההתמקדות שלו במאבק בגורם למחלה, ולא בסימפטומים ובהשלכות. כיום מפותחות גישות ריפוי גנטי לטיפול או מניעת מגוון רחב של מחלות אנושיות. גישות אלה עשויות להיות ישימות לטיפול in vivo ו-ex vivo. טיפול In vivo מבוסס על החדרה ישירה של מבנים גנטיים ישירות לרקמות הגוף. הלידה יכולה להתבצע תוך ורידי באמצעות מכשירי אירוסול או הזרקות לרקמות ספציפיות. טיפול גנטי Ex vivo מבוסס על בידוד של סוג מסוים של תאים מהגוף, הכנסת מבנה גן "טיפולי" לתוכם, בחירת תאים שעברו טרנספקציה והשתלה חוזרת לאחר מכן במטופל.
ישנם שלושה כיוונים עיקריים בגישות המפותחות כיום לאספקת מבנים גנטיים:
1) שיבוט כחלק מוקטורים ויראליים;
2) שימוש בשיטות פיזיות של טרנספקציה;
3) שימוש בקומפלקסים של וקטורי ביטוי פלסמידים ומולקולות נשא לא ויראליות.
העברה בתיווך וירוסים היא שיטה יעילה ביותר להעברת DNA לתאי מטרה, שכן כניסתו של וקטור ויראלי שונה דומה לתהליך המתרחש באופן טבעי כאשר הגנום של הנגיף מועבר לתאי המארחים. הנחקרים ביותר הם וקטורים שנוצרו על בסיס וירוסים הקשורים לרטרו, אדנו, אדנו. היתרונות של וירוסים כוללים, קודם כל, שילוב של תכונות וקטור הביטוי והנשא, אפשרות מסירה ספציפית, יכולת להמיר תאים מתחלקים ולא מתחלקים, אפשרות להטמעת DNA בכרומוזום כדי להבטיח ביטוי לטווח ארוך. בשל יתרונות אלו, גישה זו עדיין נמצאת בשימוש נרחב במחקרי מסירת גנים, אם כי יש לה כמה חסרונות. לנגיפים הקשורים לרטרו ואדנו יש גודל מוגבל של קטע ה-DNA המשובט ואת הסיכון למוטגנזה של החדרה כאשר הנגיף מוחדר לגנום המארח. חסרון רציני של וקטורים אדנו-ויראליים הוא תגובה חיסונית בולטת במינונים גבוהים והזרקות חוזרות ונשנות של מבנים אדנו-ויראליים (Walther W., Stein U. Viral vectors for gen transfer: סקירה של השימוש בהם בטיפול במחלות אנושיות // תרופות. - 2000. - נ' 60. - עמ' 249-271, פטנט RF מס' 2252255, C12N 15/37, C12N 15/86, C12N 15/861, C12N 15/867, פורסם ב-2005.05.20).
הזרקת מבני DNA של פלסמיד עירום הייתה אחת הגישות הראשונות בפיתוח אסטרטגיות טיפול של ריפוי גנטי. היעילות הנמוכה של טרנספקציה באמצעות DNA "עירום" נתנה תנופה לפיתוח שיטות חדשות לאספקת מבנים גנטיים. שיטות פיזיקליות שונות להעברת DNA לתאי הגוף נחקרו. הפופולריות מביניהם הן השיטה של טרנספקציה בליסטית ואלקטרופורציה, הנמצאות בשימוש נרחב להעברה של תאי עור ושריר. שיטת ההעברה הבליסטית מבוססת על חדירה לתא של DNA שהופקד על חלקיקי זהב או טונגסטן. טרנספקציה מתרחשת תחת לחץ של זרם של גז או נוזל דחוס. שיטת האלקטרופורציה מבוססת על שינוי מקומי בפוטנציאל החשמלי של קרום התא עקב פעולת זרם חשמלי. דחפים חשמליים מובילים להיווצרות נקבוביות בממברנת התא, ובכך הופכים אותו לחדיר לביומולקולות. כדי להתגבר על היעילות הנמוכה של טרנספקציה של DNA עירום in vivo, נעשה שימוש גם בשיטת ההלם הידרודינמית - הזרקה תוך ורידית או תוך עורקית של וקטור פלסמיד בתמיסת נפח גדול. החסרונות העיקריים של שיטות ההעברה הפיזיות הקיימות הם היעילות הנמוכה והמקומיות של השפעת מסירת ה-DNA. הם מאפשרים לפלסמיד להתגבר על קרום התא ולהימנע מהכללה באנדוזומים, ובכך מונעים פירוק אנזימטי, אך, ככלל, אינם מספקים התמדה ארוכת טווח של המבנים הגנטיים שהוכנסו (Wells D.J. התקדמות וסיכויים של טיפול גנטי: אלקטרופורציה ואחרות שיטות פיזיקליות // Gene Ther. - 2004. - v.11, No. 18. - P.1363-1369; Wang S., Joshi S, Lu S. משלוח DNA לעור בהפצצת חלקיקים // Methods Mol Biol. - 2004. - v.245. - P.185-196; Herweijer H., Wolff J.A. התקדמות וסיכויים: העברת גנים וטיפול ב-DNA עירום // טיפול גנטי. - 2003. - v.10, מס' 6. - P .453-458).
נשאים שאינם ויראליים הם חלופה להעברה בתיווך וירוס של מבנים גנטיים לתאי יונקים. נשאים שאינם ויראליים מסונתזים בקלות, קלות השינוי שלהם מאפשרת לבצע שינויים במבנה ובהרכב של מולקולות, ובכך לשפר את אמצעי המסירה. בעת שימוש במדיה לא ויראלית, אין הגבלות על גודל וקטור הביטוי הנמסר. בנוסף, הם פחות רעילים, ברוב המקרים אינם גורמים לתגובה חיסונית ספציפית, ובטוחים יותר לשימוש in vivo מאשר וקטורים ויראליים. לכן, ניתן לחזור על הכנסת מבנה גנטי ארוז בנשאים שאינם ויראליים. חקר הנשאים הלא ויראליים מתפתח בכיוון של שיפור תכונות ההעברה של ה-DNA הפלסמיד על ידי יצירת קומפלקסים של DNA עם תרכובות סינתטיות שונות (ליפידים, אוליגו ופוליפפטידים, פולימרים וכו') (לדוגמה, פטנט RF מס' 2336090 , A61K 39/00, A61K 47/00, פורסם 2008.10.20). השיפור של כלי מסירה שאינם ויראליים תלוי במידה רבה בהבנה מפורטת של החסמים לחדירת DNA לתאי הגוף (Schmidt-Wolf G.D., Schmidt-Wolf I.G. Non-Viral and Hybrid Vectors in Human Gen therapy: a update // Trends Mol Med. - 2003. - v.9, No. 2. - P.67-72; Gardlic R, Palffy R, Hodosy J., Turna J., Celec P. Vectors and delivery systems in Gen therapy // Med Sci Monit . - 2005. - v .11, מס' 4. - P.110-121; Wiethoff C.M., Middaugh C.R. Barriers to delivery gene nonviral // J Pharm Sci. - 2003. - v.92, No. 2. - P .203-217).
הוא האמין כי נשא לא ויראלי צריך להיות בעל המאפיינים הבאים:
1) להיות לא רעיל, קומפקטי ולהגן על DNA פלסמיד מפני פירוק אנזימטי, להיות מופרש מהגוף לאחר השימוש;
2) להבטיח את חדירת הפלסמיד לתא על ידי קישור ספציפי לממברנת הפלזמה של התא:
3) יש את היכולת לשחרר DNA מהתא האנדוזומלי;
להבטיח את ניתוק ה-DNA מהקומפלקס להובלה לאחר מכן של הפלסמיד לתוך הגרעין.
למטרות של ריפוי גנטי, השיטה המועדפת ביותר להעברת מבנים גנטיים היא העברה ספציפית לרקמות שלהם לתוך התאים והרקמות של הגוף.
המחסום הראשון לחדירה תוך תאית של קומפלקסים הוא קרום הפלזמה. רוב הקומפלקסים מקיימים אינטראקציה עם פני התא באמצעות כוחות אלקטרוסטטיים. מנגנון אפשרי לקשירה של קומפלקסים לתא הוא האינטראקציה שלהם עם חלבוני פני התא, גליקוזאמינוגליקנים. עם זאת, עם מנגנון זה של חדירה של הקומפלקסים, אין העברה ספציפית לרקמות של מבני גנים. יחד עם זאת, הבעיה של מסירה ספציפית לרקמות של מבנים גנטיים רלוונטית לריפוי גנטי למספר מחלות. עבור אינטראקציה ספציפית עם פני התא, הקומפלקסים כוללים ליגנדים לקולטנים על פני התא. עד כה, אופיינו מספר ליגני פפטיד אינטגרין. אלה כוללים, במיוחד, את מקטע הטריפפטיד RGD (אינטגרינים נמצאים על פני השטח של תאים רבים), טרנספרין (לקולטן שלו יש ביטוי מוגבר בתאים מתרבים), asialorosomucoid (קולטן asialoglycoprotein בעל ביטוי ספציפי בהפטוציטים של הכבד).
לאספקה ספציפית של חומר גנטי לתאי עצב, זנג ועמיתיו הציעו להשתמש בנשא המורכב מאזור אות לקולטן TrkA (80-108 חומצות אמינו מגורם גדילת עצב) ורצף קושר ל-DNA של 10 שיירי חומצות אמינו ליזין . נשא זה, בנוכחות הסוכן האנדוזומוליטי chloroquine, המקל על שחרור קומפלקסים מהתא האנדוזומלי של התא, הצליח להעביר באופן ספציפי את גן הסמן רק לתאים המבטאים את הקולטן TrkA. נשא זה יכול לשמש לטיפול בריפוי גנטי במחלות נוירולוגיות שונות כגון אפילפסיה, פרקינסון ואלצהיימר. עם זאת, הוא אינו מתאים להעברת חומר גנטי לסוגי תאים אחרים (Zeng J, Too HP, Ma Y, Luo E, Wang S פפטיד סינטטי המכיל לולאה 4 של גורם גדילה עצבי להעברת גנים ממוקדת // J Gene Med 2004; 6 : 1247 -1256).
תאי גזע אנושיים נחשבים כסוכנים מבטיחים לריפוי תאים וגנטי למחלות אנושיות שונות. יחד עם זאת, הם בין סוגי התאים הקשים ביותר להעברה. בטיפול בריפוי גנטי בסרטן, יש צורך להבטיח מסירה של גנים ישירות לתאי הגידול.
CXCR4 הוא קולטן לגורם נדידת תאי גזע עבור הכימוקין SDF-1α. CXCR4 מתבטא בתאים המטופואטיים, אנדותל כלי דם ותאי לוויין שרירים. רמה גבוהה של ביטוי של גן זה נצפתה ביותר מ-20 סוגים של גידולים סרטניים (סרטן השד, סרטן הערמונית וכו'), וכן בתאי גזע נודדים. הקולטן CXCR4 מסוגל להיקשר גם לכימוקין הנגיפי vMIP-II (נגיף סרקומה של Kaposi). לפיכך, הכללת רצפי אותות לקישור לקולטן CXCR4 לתוך מולקולות הנשאים היא דרך מבטיחה ליצור מערכות להעברת גנים ממוקדת לתאי גידול ותאי גזע.
כדי להעביר חומר גנטי לתאים המבטאים את הקולטן CXCR4, Le Bon ועמיתיו השתמשו בליגנד סינתטי לקולטן זה, AMD3100, שהיה מחובר לפוליאתילןאימין או ליפידים קטיוניים. קומפלקסים של חומר גנטי עם תרכובות אלו לא הובילו לעלייה משמעותית ביעילות מסירת גנים סמן לתאי CXCR4+ בהשוואה לתרכובות ללא אותות. הנשאים בהם השתמש לה בון לא היו יעילים, מכיוון שמסירה ספציפית בעזרתם אפשרית רק כאשר מוסיפים למדיום ההטרנספקציה חומר המקדם הפנמה של הקולטן CXCR4 (פורבול אסטר). (Le Bon B, Van Craynest N, Daoudi JM, Di Giorgio C, Domb AJ, Vierling P. AMD3100 Conjugates as Components of Targeted Nonviral Delivery Systems: Synthesis and in Vitro Transfection Efficiency of CXCR4-Expressing Cells. // Bioconjugate Chem 20004 Chem 2000 , 15: 413-423).
לפיכך, יש צורך ליצור נשא של מבנים גנטיים שיכול לספק מסירה ספציפית לתאי CXCR4(+) ולא להשפיע על רקמות סמוכות. שיטה כזו מסופקת על ידי ההמצאה הנוכחית.
ההמצאה מבוססת על משימת פיתוח שיטה למסירה ספציפית של מבנים גנטיים לתאים המבטאים את הקולטן CXCR4, שבה, על ידי שימוש בנשאים של מבנים גנטיים המכילים רצפי אותות לקולטן CXCR4, עלייה ביעילות המסירה של הגן "האינטרס" מושג. חשוב לציין כי הסינתזה של הנשאים הנטענים יכולה להתבצע באמצעות כל אחת מהשיטות המוכרות של סינתזת פפטידים בשלב מוצק.
את פתרון הבעיה הטכנית מספקת העובדה שבשיטת מסירה ממוקדת של DNA לתאי גידול ותאי גזע המבטאים את הקולטן CXCR4, לרבות הכנת נשאים של מבנים גנטיים על ידי הכללה בהרכב מולקולות הנשאים, שהוא רצף קושר DNA של שמונה שיירי חומצות אמינו ליזין - KKKKKKKK, רצפי אותות, יצירת קומפלקסים של DNA/נשא, ביצוע טרנספקציה במבחנה, רצף האותות נבחר מהקבוצה: קטע מ-1 עד 8 חומצות אמינו של רצף של ה-N-terminus של חלבון SDF-1α - KPVSLSYR; קטע מ-1 עד 17 חומצות אמינו של רצף ה-N-terminus של חלבון SDF-1α - KPVSLSYRCPCRFFESH, כאשר 9 ו-11 חומצות אמינו מוחלפות בסרין; או קטע מ-1 עד 10 חומצות אמינו של הרצף ה-N-טרמינלי של הכימוקין הנגיפי vMIP-II - LGASWHRPDK; ההצמדה של רצף האותות לרצף קושר ה-DNA מתבצעת באמצעות אתר קישור של שתי מולקולות של חומצה ε-aminohexanoic.
במקרה זה, רצף האותות עשוי להיות קטע מחומצות אמינו 1 עד 8 של רצף ה-N-terminus של החלבון SDF-1α-KPVSLSYR.
לחלופין, רצף האותות עשוי להיות קטע מחומצות אמינו 1 עד 17 של רצף ה-N-terminal של חלבון SDF-1α - KPVSLSYRCPCRFFESH, כאשר חומצות אמינו 9 ו-11 מוחלפות בסרין.
מקטע מחומצות אמינו 1 עד 10 של רצף ה-N-טרמינלי של הכימוקין הנגיפי vMIP-II - LGASWHRPDK, המסונתז מחומצות אמינו D, יכול לשמש גם כאזור אות.
גליצרול או כלורוקין יכולים לשמש כרכיב המספק את היציאה מאנדוזומים של קומפלקסים המורכבים מנשאים ומחומר גנטי.
ניתן להשתמש ב-DNA פלסמיד כחומר גנטי לנשאים.
התוצאה הטכנית שצוינה בהמצאה הנוכחית מושגת באמצעות שימוש במולקולות אוליגולזין - KKKKKKKK (K8) המצומדות עם רצפי אותות לקולטן CXCR4 מחלבוני SDF-1 או vMIP-II, כלומר הרצף ה-N-טרמינלי של SDF-1 כימוקין (עם 1 עד 8 aa) או הרצף ה-N-טרמינלי של הכימוקין SDF-1 (מ-1 עד 17 aa, עם החלפה של 9 ו-11 aa בסרין) או הרצף ה-N-טרמינלי של הנגיף vMIP-II כימוקין (מ-1 עד 10 aa בקונפורמציה D). הנוכחות של אוליגולזין KKKKKKKK בהרכב הנשא מאפשרת לצמידות ליצור קומפלקסים עם חומצות גרעין, בפרט עם DNA פלסמיד, עקב אינטראקציה אלקטרוסטטית.
התוצאה הטכנית שצוינה מושגת על ידי שלוש גרסאות של המדיה המוצעת.
התוצאה הטכנית שצוינה על פי הגרסה הראשונה מושגת על ידי העובדה שבנשא CDP הקצר המבוסס על אנלוגים סינתטיים של הכימוקין SDF-1, הכולל רכיב קטיוני, שהוא K8 oligolysin, המשמש לעיבוי DNA של פלסמיד, ו- רכיב ליגנד לאינטראקציה עם הקולטן CXCR4, בהתאם להמצאה, מקטע (1-8 aa) של רצף ה-N-terminus של חלבון SDF-1, בעל המבנה KPVSLSYR ובעל פעילות אגוניסטים של הקולטן CXCR4, משמש כרכיב ליגנד, ולרכיב הקטיוני של המצומד יש את המבנה KKKKKKKK והוא מחובר לרכיב הליגנד דרך מרווח - שתי מולקולות ε-aminohexanoic acid (Ahx).
התוצאה הטכנית שצוינה על פי הגרסה השנייה מושגת על ידי העובדה שבנשא (CDP ארוך) מבוסס על אנלוגים סינתטיים של הכימוקין SDF-1, הכולל רכיב קטיוני, שהוא K8 אוליגולזין המשמש לעיבוי DNA פלסמיד, ו רכיב ליגנד לאינטראקציה עם הקולטן CXCR4, בהתאם להמצאה הנתבעת, קטע (1-17 aa; aa9 ו-aa11 מוחלפים בסרין) של רצף ה-N-terminus של החלבון SDF-1, בעל מבנה KPVSLSYRSPSRFFESH ובעל פעילות של אגוניסטים של הקולטן CXCR4, משמש כרכיב ליגנד, ולרכיב הקטיוני של המצומד יש את המבנה KKKKKKKK ומחובר לרכיב הליגנד דרך מרווח - שתי מולקולות של חומצה ε-aminohexanoic.
התוצאה הטכנית שצוינה על פי הגרסה השלישית מושגת על ידי העובדה שבנשא (CDP ויראלי) המבוסס על אנלוגים סינתטיים של החלבון של וירוס Kaposi sarcoma vMIP-II, הכולל רכיב קטיוני, שהוא K8 אוליגולזין, לעיבוי DNA פלסמיד, ורכיב ליגנד לאינטראקציה עם הקולטן CXCR4, בהתאם להמצאה הנטענת, קטע (1-10 Daa - מסונתז מחומצות אמינו D) של רצף ה-N-terminus של vMIP- חלבון II, בעל המבנה LGASWHRPDK ובעל פעילות של אנטגוניסטים של הקולטן CXCR4, משמש כרכיב ליגנד, ולרכיב הקטיוני של המצומד יש את המבנה KKKKKKKKK ומוצמד לרכיב הליגנד דרך מרווח - שתי מולקולות של ε. -חומצה אמינוהקסנואית.
ניתן לסנתז את כל שלושת הווריאציות של הנשא הנטען באמצעות שיטות ידועות של סינתזת פפטידים, למשל, שיטת Solid Phase Boc (Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide // Journal of the American Chemical Society. 1963. V.85 (14), עמ' 2149-2154).
דוגמאות יישום ספציפיות
ההמצאה מומחשת באמצעות איור 1, המציגה את השינוי בעוצמת הקרינה של אתידיום ברומיד עם עלייה ביחסי מטען נשא/DNA בקומפלקסים קצרים של CDP/DNA, CDP/DNA ארוך ו-CDP/DNA ויראליים. ירידה בעוצמת הקרינה מצביעה על עלייה בצפיפות הקומפלקסים שנוצרו. הרמה של עקומות הקרינה מצביעה על כך שהקומפלקסים הגיעו לצפיפות מספקת כדי לכבות את הקרינה האתידיום ברומיד.
איור 2 מציג את התלות של פעילות לוציפראז בתאי HeLa (CXCR4+) לאחר טרנספקציה עם קומפלקסים CDP/DNA קצרים, CDP/DNA ארוכים ו-CDP/DNA ויראליים בנוכחות הסוכן האנדוזומוליטי גליצרול. במקרה זה, נעשה שימוש בקומפלקסים שנוצרו ביחסי הנשא/דנ"א הבאים: 3/1, 6/1, 9/1, 12/1. המולקולה השלמה, DNA, PEI/DNA 1/8 קומפלקסים (שליטה חיובית בניסוי - נשא מסחרי מסועף פוליאתילןאימין 25 kDa - PEI) וקומפלקסים המכילים DNA ופפטיד בקרה (CP) שימשו כבקרות ניסוי. ה-CP שונה מהנשאים בהמצאה הנוכחית בכך שהוא חסר אות מקשר לקולטן CXCR4 והוא מבחינה מבנית אוליגולזין KKKKKKKK. היעילות של מסירת גן סמן על ידי נשאים של CDP קצר, CDP ארוך ו-CDP ויראלי הייתה גבוהה פי 10-100 מזו של CP ביקורת.
איור 3 מראה את התלות של פעילות לוציפראז בתאי A172 (CXCR4+) לאחר טרנספקציה עם קומפלקסים CDP/DNA קצרים, CDP/DNA ארוכים ו-CDP/DNA ויראליים בנוכחות הסוכן האנדוזומוליטי גליצרול. כאן השתמשנו בקומפלקסים שנוצרו ביחסי הטעינה של הנשא/DNA הבאים: 9/1, 12/1. מולקולת DNA שלמה, קומפלקסים PEI/DNA 1/8 וקומפלקסים המכילים DNA ופפטיד CP שימשו כבקרות ניסוי. היעילות של מסירת גן סמן על ידי נשאים של CDP קצר, CDP ארוך ו-CDP ויראלי הייתה גבוהה פי 10 מזו של CP ביקורת.
התוצאות באיור 2 ובאיור 3 תומכות בספציפיות של הנשאים בהמצאה הנוכחית עבור הקולטן CXCR4.
איור 4 מציג את התלות של פעילות לוציפראז בתאי CHO (CXCR4-) לאחר טרנספקציה עם קומפלקסים CDP/DNA קצרים, CDP/DNA ארוכים ו-CDP/DNA ויראליים בנוכחות הסוכן האנדוזומוליטי גליצרול. נעשה שימוש בקומפלקסים שנוצרו ביחסי הנשא/דנ"א הבאים: 9/1, 12/1. מולקולת DNA שלמה, קומפלקסים PEI/DNA 1/8 וקומפלקסים המכילים DNA ופפטיד CP שימשו כבקרות ניסוי. היעילות של מסירת גן סמן על ידי CDP קצר, CDP ארוך ונשאי CDP נגיפיים הייתה כמעט זהה לשימוש ב-CP הביקורת.
נשאים עם אות אינם מסוגלים לספק רמה גבוהה משמעותית של מסירה של חומר גנטי בתאים ללא ביטוי קולטן בהשוואה לבקרה.
ניתן להסביר את יישום ההמצאה כדלקמן. מטרת ההמצאה הנוכחית היא לספק מסירה ממוקדת של מבנים גנטיים לתאים המבטאים את הקולטן CXCR4 באמצעות נשאים של חומר גנטי המכילים רצפי אותות עבור קולטן זה.
בשלב הראשון מתבצעת היווצרות קומפלקסים של אחת מההתגלמויות של הנשא עם מבנה גנטי המכיל את הגן "עניין". הקומפלקסים הנוצרים משמשים להעברת החומר הגנטי לתאי המטרה המתאימים. ניתוח יעילות חדירת תאים מוערך על ידי שיטות אנזימטיות או אימונוהיסטוכימיות.
היווצרות קומפלקסים מתבצעת בתמיסה איזוטונית. עדיף חיץ HBM ללא מלח (מניטול מאגר Hepes). גודל המתחמים המתקבלים הוא 170-230 ננומטר.
כמבנים גנטיים באחת מההתגלמויות באמצעות DNA פלסמיד.
דנ"א פלסמיד מכיל סמן (luc, lacZ) או גן טיפולי (בהתאם למחלה), בשליטה של המקדמים והמשפרים המתאימים (CMV, SV40 וכו') ואלמנטים נוספים הנחוצים, למשל, לשכפול במארח. תא או אינטגרציה בגנום. בטיפול בריפוי גנטי בסרטן, ניתן להשתמש בגנים של HLA-B7, IL-2, IL-4, TNF, IFN, P53, thymidine kinase ואחרים.
בהתגלמות אחרת, אוליגונוקלאוטידים המורכבים מ-DNA קטן או RNA משלימים לרצף ספציפי ב-mRNA או המבשר שלו משמשים כמבנה גנטי כדי לדכא את הסינתזה של מוצר חלבון או להשליך אקסון הנושא מוטציה מה-mRNA. הקומפלקסים הנוצרים משמשים להעברת חומר גנטי לתאים המבטאים את הקולטן CXCR4. חדירה של קומפלקס הנשאים של ההמצאה הנוכחית מתרחשת בעיקר על ידי הובלה מתווכת קולטן על ידי קישור לתחומים החוץ-תאיים של הקולטן CXCR4 ולאחר מכן הפנמה של הקולטן.
מינון הנשאים והחומר הגנטי נקבע בנפרד ותלוי בסוג התאים, כמות הקולטן CXCR4 על פני השטח שלהם ומורכבות ההעברה של תאים אלו.
כדי להגביר את היעילות של נשאים אלה, טרנספקציה של תאים מבוצעת רצוי באמצעות חומר אנדוזומוליטי. אלה כוללים גליצרול, כלורוקין ועוד חומרים אלו מתווספים למצע ההעברה מיד לפני הוספת הקומפלקסים לתאים. הם נשארים לא קשורים למתחמים, ולכן אינם משפיעים על המבנה שלהם.
פפטידים, תרכובות פולימריות אחרות, ליפוזומים המסוגלים לדחוס חומצות גרעין יכולים לשמש כחלק קושר ה-DNA של הנשא. בנוסף, הם יכולים להיות בעלי תכונות אנדוזומוליטיות (אין צורך להשתמש בחומר אנדוזומוליטי נוסף) ובמידת הצורך (לדוגמה, להעברת גנים טיפוליים או סמנים), להעביר חומר גנטי לגרעין.
בעת בחירת תנאי טרנספקציה, הם מתוכננים לספק את יעילות המסירה הגבוהה ביותר. עדיף לדגור קומפלקסים עם תאים למשך 4 שעות. עם זאת, אתה יכול לשנות את הזמן הזה מ-3 עד 6 שעות. לאחר חלוף זמן הדגירה, מחליפים את המדיום ומשאירים את התאים למשך 24-48 שעות (תלוי בסוג התא ובחומר הגנטי) לביטוי של המבנים המוכנסים עם הגן המעניין או לביטוי ההשפעה הטיפולית של אוליגונוקלאוטידים.
ניתוח יעילות המסירה מתבצע על ידי שיטות אנזימטיות או אימונוהיסטוכימיות, בהתאם לסוג מבנה הגן שהוכנס.
דוגמה 1 היווצרות קומפלקסים של DNA/נשא וחקר תהליך המורכבות.
הפלסמיד pCLUC4 המכיל את הגן לוציפראז של גחליליות בשליטה של מקדם הציטומגלווירוס שימש כחומר הגנטי לאספקה ממוקדת של גנים לתאים. נעשה שימוש באחת מההתגלמויות של המנשא.
פתרונות של 1 מיקרוגרם של DNA ב-40 μl של חיץ HBM 1X (5% w/v mannitol, 5 mM Hepes, pH 7.5) ופתרונות נשא התואמים ליחסי מטען DNA/נשא שונים הוכנו בנפח שווה של חיץ. תמיסת הנשא נוספה בהדרגה לצינור Eppendorf עם תמיסת ה-DNA וערבבה במרץ במשך 20 שניות. התערובת שהתקבלה הושארה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי להשלים את היווצרות הקומפלקסים.
תוצאות המורכבות מנותחות בשיטת עקירת אתידיום ברומיד. הקרינה של אתידיום ברומיד נמדדת באמצעות קורא רב-מודים סריקה ספקטרלית Varioscan Flash (Thermo, פינלנד). עקירה של אתידיום ברומיד נצפתה ב-590 ננומטר (עירור ב-544 ננומטר) לאחר הוספת נשא ל-DNA (20 מיקרוגרם/מ"ל) שהודגרה מראש עם חומר אינטרקלציה אתידיום ברומיד (400 ננוגרם/מ"ל). העקירה חושבה באמצעות הנוסחה (F-Ff)/(Fb-Ff), כאשר Ff ו-Fb הם עוצמות הקרינה של אתידיום ברומיד בהעדר ובנוכחות של DNA, בהתאמה. התוצאות מוצגות באיור.
דוגמה 2 ביצוע טרנספקציה חוץ גופית.
תאי HeLa, A172 ו-CHO צופו בצלחות תרבית 48-בארות (Nunc) 24 שעות לפני ההעברה ב-50,000 תאים לבאר המכילים 500 μl של תערובת תרבית סטנדרטית המורכבת ממדיום תרבית DMEM (GIBCO), 10% סרום בקר עוברי. (GIBCO), 2 מ"מ גלוטמין, בתוספת פניצילין (50 U/ml), סטרפטומיצין (50 מיקרוגרם/מ"ל) ו-1 מ"מ נתרן פירובט. ההשעיה של הקומפלקסים הוכנה לפי השיטה המתוארת בדוגמה 1 בקצב של 2 מיקרוגרם של DNA לכל באר של צלחת התרבית. 10 דקות לפני הוספת ההשעיה של קומפלקסים של DNA/נשא, תאים נשטפו מספר פעמים עם DMEM ונוספו 500 μl של מדיום המכיל 15% גליצרול ו-1.5% אתנול לכל באר. ההעברה בוצעה על ידי הוספת תרחיף של קומפלקסים של DNA/נשא למדיום. לאחר יצירת הקומפלקסים, הלוחות עם התאים הונחו בתרמוסטט עם טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 למשך 4 שעות. לאחר זמן הדגירה, התאים נשטפו עם מדיום DMEM ונוספו 500 μl מתערובת התרבית הסטנדרטית לכל באר. צלחת התרבית הודגרה בתרמוסטט בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 למשך 48 שעות, ולאחר מכן זוהה ביטוי הגן של הסמן.
דוגמה 3 זיהוי של ביטוי גן לוציפראז לאחר טרנספקציה במבחנה.
המדיום הוסר מצלחות התרבית, התאים נשטפו ב-1x PBS (pH 7.2). 80 μl חיץ תמוגה (25 M Gly-Gly, 15 mM MgSO 4, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF; pH 7.8) נוספו לכל באר. 50 μl של lysate הועברו לצלחות פוליסטירן עם קירות אטומים למדידת פעילות לוציפראז. המדידה בוצעה באמצעות קורא ריבוי מצבי סריקה ספקטרלי Varioscan Flash (Thermo, פינלנד). המדידה בוצעה באמצעות תמיסה של תערובת הבזק לוציפראז (20 מ"מ טריצין, 1.07 מ"מ (MgCO 3) 4 מ"ג (OH) 2 × 5 H 2 O, 2.67 מ"מ MgSO 4, 0 1 מ"מ EDTA, 33.3 מ"מ DTT, 530 מיקרומטר, ATP , 270 מיקרומטר אצטיל קואנזים A, 470 מיקרומטר לוציפרין). כל מדידה בוצעה במשך 10 שניות. קריאות מכשירים התקבלו ביחידות אור יחסיות (RLU). תוצאות הניסוי הוערכו ביחידות אור יחסיות לכל 1 מ"ג של חלבון כולל מתמציות תאים בבאר של צלחת התרבית. כמות החלבון הכוללת בכל באר נמדדה באמצעות ערכת בדיקת חלבון (Bio-Rad), מול עקומה סטנדרטית לאלבומין בסרום בקר. התוצאות מוצגות באיורים 2, 3, 4.
דרכים להחדרת גנים ישירות לתא
החדרה ישירה של גן לתא מתבצעת במספר דרכים:
טרנספקציה
הזרקת מיקרו
אלקטרופורציה
שיטת מיני תא
אריזה בליפוזומים
אקדח אלקטרונים
בְּ טרנספקציה DNA נספג על גבי גבישי סידן פוספט (Graham van der Eb, 1973). נוצרים חלקיקים של משקעי סידן. הם נקלטים על ידי התא על ידי phagocytosis.
כדי להגביר את יעילות הטרנספורמציה, מתווסף ל-DNA הספציפי DNA נשא לא ספציפי המכיל את הגן שעבורו תיעשה הבחירה. בדרך כלל, DNA נלקח מתימוס עגל או מזרע סלמון למטרה זו. חלק מה-DNA נקשר לממברנה ואינו חודר לתאים. DNA מתקבל על ידי 15 עד 90% מהתאים. מספר ימים לאחר המתן, חלק קטן מהתאים מסוגלים לבטא גנים זרים, אך אז רמת הביטוי יורדת ו-10 -3 - 10 -5 תאים עוברים טרנספורמציה יציבה פחות או יותר.
DEAE-dextran, פולימר הסופח DNA, משמש גם להעברה. אפקט כניסת התא וזמן הביטוי גבוהים, אך תדירות הטרנספורמציה היציבה נמוכה יותר מאשר בעת שימוש במשקע סידן. תדירות הטרנספקציה מוגברת על ידי הלם גליצרול (4 דקות ב-15% גליצרול במאגר HEPES).
ניתן להחדיר כל גן לתאים אם הוא קושר מראש עם סמן משובט שניתן לבחירה. עם זאת, מחקרים נוספים הראו שאין צורך בקשירה מחוץ לתא. תאים הקולטים את הגן הסלקטיבי, יחד איתו, סופגים גם DNA אחר הקיים במשקע הסידן. לפיכך, באמצעות השיטה טרנספורמציות משותפים, ניתן להחדיר כמעט כל מקטע DNA משובט לתאים אוקריוטיים מתורבתים אם DNA זה, יחד עם סמן הניתן לבחירה, נכלל בהרכב התערובת ליצירת משקע סידן.
כרומוזומים או שברי כרומוזומים יכולים לשמש לטרנספקציה. תאי תורם נחסמים בשלב המיטוזה. כרומוזומים מיטוטיים משתחררים בהשפעת הלם אוסמוטי והומוגניזציה. הם מטוהרים על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית. כרומוזומים מופקדים על פני התאים עם סידן כלורי, ולאחר מספר שעות הם מטופלים עם מגיב המסוגל לנקב ממברנות (למשל גליצרול).
תכשירים מטוהרים גס של כרומוזומים משמשים לעיבוד תאים המקבלים, שכן הכרומוזומים נהרסים הכי פחות במקרה זה. מספר הכרומוזומים לעיבוד תא אחד מוגבל. עדיף להשתמש לא יותר מ-20 כרומוזומים לכל תא מקבל 1, שכן בריכוז גבוה של כרומוזומים בתרחיף הם מתקבצים. התא המקבל מכיל שברי כרומוזומים של תורם הניתנים לשילוב בגנום ויכולים להשתכפל באופן עצמאי. מחיקות נצפות לעתים קרובות בשברים שהוצגו.
לא כל התאים מסוגלים לשנות DNA גנומי בתדירות גבוהה. פיברובלסטים אנושיים משלבים ביעילות DNA פלסמיד וכמעט ללא DNA גנומי.
הזרקת מיקרו DNAלתוך תאי יונקים התאפשרו עם הופעתו של מכשיר לייצור מיקרופיפטות בקוטר של 0.1-0.5 מיקרון ומיקרומניפולטור (איור 45). לפיכך, פלסמידים המכילים קטע מנגיף ההרפס עם הגן thymidine kinase (TK) והפלסמיד pBR322 הוזרקו לתאי TK - והוכח שהגן TK - חדר לגרעינים והשתכפל בהם באופן תקין. שיטת המיקרו-הזרקה להחדרת DNA פותחה בתחילת שנות ה-70 על ידי אנדרסון ודיאקומאקוס. באופן עקרוני, עם ציוד טוב ניתן להזריק 500-1000 תאים תוך שעה, ובניסויים הטובים ביותר נצפה שילוב וביטוי יציב של הגנים המוזרקים ב-50% מהתאים. היתרון של השיטה המתוארת הוא גם בכך שהיא מאפשרת הכנסת כל DNA לתאים כלשהם, ולא נדרש לחץ סלקטיבי כדי לשמר את הגן המוכנס לתאים.
אורז. 45. הכנסת DNA על ידי הזרקת מיקרו
אלקטרופורציהמבוסס על העובדה שפולסי מתח גבוה מגדילים באופן הפיך את החדירות של הביו-ממברנות. תאים ושברי DNA מתווספים למדיום לצורך אלקטרופורציה, אשר יש להכניס לתאים (איור 46). פולסים של מתח גבוה (מתח 200 - 350 וולט, משך פעימה 54 שניות) מועברים דרך המדיום, מה שמוביל להיווצרות נקבוביות (פירוק חשמלי) בממברנה הציטופלזמית, שאורך החיים והגודל שלהן מספיקים עבור מקרומולקולות כגון DNA. להיכנס לתא מהסביבה החיצונית עקב פעולת כוחות אוסמוטיים. במקביל, נפח התא גדל.
חוזק השדה החשמלי ומשך פעולתו, ריכוז ה-DNA המתמר ותאי המקבלים עבור כל מערכת תאים נבחרים בניסוי על מנת להשיג אחוז גבוה של קליטת DNA על ידי תאים שורדים. הוכח כי בתנאי אלקטרופורציה אופטימליים, מספר הטרנספורמנטים יכול להגיע ל-80% מהתאים ששרדו.
אלקטרופורציה היא שיטה פיזית ולא ביוכימית, ונראה שזו הסיבה לשימוש הנרחב בה. מחקרים רבים הוכיחו שניתן להשתמש בהצלחה באלקטרופורציה להחדרת מולקולות DNA לסוגי תאים שונים כגון תאי בעלי חיים מתורבתים, פרוטוזואה, שמרים, חיידקים ופרוטופלסטים צמחיים. ההשפעה האלקטרופורטיבית של פריקת מתח גבוה על קרום שומנים דו-שכבתי תלויה ככל הנראה ברדיוס העקמומיות שלו. לכן, תאי חיידקים קטנים סופגים ביעילות DNA בחוזק שדה גבוה בהרבה (10 קילו וולט/ס"מ ויותר) מתאי בעלי חיים וצמחים גדולים שסופגים DNA ביעילות בעוצמת שדה של 1-2 קילו וולט/ס"מ.
אלקטרופורציה היא השיטה הפשוטה, היעילה והניתנת לשחזור להחדרת מולקולות DNA לתאים. עם זאת, עד לאחרונה, שיטה זו הייתה בשימוש במספר מצומצם של מעבדות בשל היעדר מכשירים סדרתיים - אלקטרופורטורים. הופעתם ושיפורם של מכשירים כאלה בשנים הקרובות יובילו לשימוש נרחב בגישה זו בהנדסה גנטית של סוגי תאים שונים.
אורז. 46. שיטת אלקטרופורציה
"מיני תאים"מתקבל על ידי חסימת תאי תורם מיטוטיים עם קולקמיד. עם טיפול ממושך בתאים עם קולקמיד, נוצרת קרום גרעיני חדש סביב כל כרומוזום. טיפול בציטוצ'לסין B וצנטריפוגה מביאים להיווצרות מיני-תאים, שהם מיקרו-גרעינים הכלולים בממברנה הציטופלזמית.
המיני-תאים המתקבלים רגישים מאוד לסוגים שונים של השפעות, ולכן תנאים מתונים מיוחדים נבחרים לאיחוי. השיטה קשה, קפריזית, היעילות נמוכה - 10 -6 - 10 -7.
אריזה בליפוזומיםמשמש להגנה על חומר גנטי אקסוגני מהפעולה ההרסנית של ריסטרטאזים.
ליפוזומים הם קונכיות כדוריות המורכבות מפוספוליפידים. הם מתקבלים על ידי ניעור חד של תערובת של תמיסה מימית ושומנים, או על ידי ביצוע קולי של תחליבים מימיים של פוספוליפידים. ליפוזומים המורכבים מפוספאטידילסרין וכולסטרול מתאימים ביותר להחדרת DNA לתאי בעלי חיים וצמחים. מערכות הובלה בעזרת ליפוזום הן רעילות נמוכה לתאים.
שיטת בליסטיקה ביולוגית (ביוליסטיקה)היא אחת השיטות היעילות ביותר להפיכת צמחים כיום, במיוחד חד-צוטיות.
מהות השיטה טמונה בעובדה שהחלקיקים הקטנים ביותר של טונגסטן, בקוטר של 0.6-1.2 מיקרון, מרוססים ב-DNA של וקטור המכיל את מבנה הגן הדרוש לטרנספורמציה. חלקיקי טונגסטן הנושאים DNA מופקדים על מצע צלופן וממוקמים בתוך האקדח הביולוגי. את הקאלוס או תרחיף התא מורחים על צלחת פטרי עם מדיום אגר ומניחים מתחת לאקדח הביוליסטי במרחק של 10-15 ס"מ. הלחץ באקדח מופחת ל-0.1 אטמוספירה ע"י משאבת ואקום. ברגע שחרור הלחץ, חלקיקי טונגסטן נפלטים מהאקדח הביוליסטי במהירות רבה ובקריעת קירות תאים, נכנסים לציטופלזמה ולגרעין התאים.
בדרך כלל, תאים הממוקמים ישירות במרכז מתים בגלל הכמות העצומה והלחץ של חלקיקי טונגסטן, בעוד התאים שעברו טרנספורמציה מוצלחת ביותר ממוקמים באזור 0.6-1 ס"מ מהמרכז. לאחר מכן, התאים מועברים בזהירות למדיום להמשך טיפוח והתחדשות.
צמחים חד-פסיגיים כמו תירס, אורז, חיטה ושעורה עברו טרנספורמציה באמצעות האקדח הביולוגי. במקרה זה התקבלו צמחי טרנספורמנט יציבים. בנוסף להצלחה בהשגת חד-צמיתים מהונדסים, טרנספורמציה ביולוגית משמשת להעברה ישירה של DNA לאבקה עוברית וייצור מהיר נוסף של צמחים דיפלואידים מהונדסים, שהם שלב חשוב בעבודת הרבייה. כיום, צמחי טבק עברו טרנספורמציה בשיטה זו, ולאחר התחדשותם של צמחים הפלואידים התקבלו טרנספורמנטים יציבים.
8860 0
כיום ידועות כ-40 שיטות שונות להעברת DNA רקומביננטי לתאים, הפותרות את בעיית חציית קרום הפלזמה בדרכים שונות. עד כה, אין סיווג אחיד של שיטות להעברת DNA רקומביננטי לתאים. כל מחבר הביקורות מסווג בדרכו שלו, אולי בגלל שעבור שיטות רבות שנמצאו אמפירית, המנגנון להתגברות על הממברנה עדיין לא ברור, למשל, לטרנספורמציה. יש גם אי ודאות בטרמינולוגיה, וזה לא מפתיע עבור תחום חדש המתפתח במהירות של מדע ופרקטיקה.
לכל אחת מהשיטות להעברת DNA זר לתאים יש מאפיינים משלה, יתרונות וחסרונות במונחים של הישרדות תאים, יעילות ניהול, צדדיות ואפשרויות יישום טכניות. בחירת השיטה תלויה בסוג התאים המארח ובסוג הווקטור המשמש, כמו גם בהעדפות האישיות וביכולותיו של הנסיין. כמה מהשיטות הידועות ביותר להעברת DNA לתאי מטרה נדונות בפירוט להלן.
טרנספורמציה במובן הכללי ביותר שלה היא תהליך החדרת DNA חופשי לתא. במובן צר יותר, המונח משמש בעיקר ביחס לחיידקים, המציין את תהליך הספיגה של DNA רקומביננטי על ידי תאים מוכשרים, המושרה על ידי מעבר פאזה בטמפרטורה של קרום התא. E. coli הוא האורגניזם הנפוץ ביותר כאשר עובדים עם DNA רקומביננטי, וכדי להבטיח החדרת DNA פלסמיד לתאים, התאים נשמרים עם תמיסה קרה כקרח של CaCl2 ו-DNA, ולאחר מכן נתונים להלם חום ב-42 מעלות צלזיוס. למשך ~1 דקה
ככל הנראה, כתוצאה מטיפול כזה, מתרחש הרס מקומי של דופן התא. יעילות טרנספורמציה, המוגדרת כמספר הטרנספורמנטים לכל 1 מיקרוגרם של DNA נוסף,
בעוד שזה בערך 10000 - 10000000 . היעילות של שיטה זו נמוכה, פחות מ-0.1% מהתאים עוברים טרנספורמציה, אך חסרון זה מפוצה על ידי שימוש בסכימות בחירה המאפשרות לך לזהות במהירות את השיבוטים הרצויים.
תאים המסוגלים לספוג DNA זר נקראים מוכשרים. חלקם של תאים אלו באוכלוסיה הוא בדרך כלל קטן מאוד, אך ניתן להגדיל אותו באמצעות מצע תזונתי מיוחד, תנאי גידול ומשרמי יכולת כימית (נבחר, ככלל, באופן אמפירי). שלב בשימוש תכוף בהכנת תאים מוכשרים הוא ייצור של ספרופלסטים - תאים באופן חלקי או מלא (פרוטופלסטים) נטולי דופן תא קשיח חיצונית.
לדוגמה, זו הדרך היחידה להפוך ביעילות חיידקים גרם חיוביים רבים מהסוגים Bacillus, Listeria, Streptommyces וכו'. כמה טכניקות טרנספורמציה של שמרים כוללות גם את השלבים של הסרה אנזימטית של דופן תאי השמרים באמצעות גלוקוזידאזות. עבור אורגניזמים עמידים לגורמים כימיים של יכולת או חסרי יכולת טבעית, נעשה שימוש במערכות העברת DNA אחרות.
נְטִיָה. ישנם פלסמידים חיידקיים (פלסמידים מצומדים) בעלי יכולת ליצור מגעים בין-תאיים דרכם הם עוברים מתא אחד למשנהו. יצירת קשרים בין תאי התורם והמקבל מובטחת על ידי התכונות המצומדות של פלסמידים, והעברת ה-DNA עצמו מסופקת על ידי תכונות ניוד. במקרה זה, הפלסמיד המצומד יכול לשאת את וקטור הפלסמיד הרגיל הממוקם באותו תא.
לפיכך, ניתן להפוך תאים נמענים שקשה להפוך אותם באמצעים אחרים. לדוגמה, הוכחה העברת הגיוס של וקטור המעבורת לטווח המארח הרחב pAT187 מ-E. coli לחיידקים גרם חיוביים שונים (הסוגים Bacillus, Enterococcus, Staphylococcus וכו'), אם כי ביעילות פחותה בהרבה מאשר עבור העברה בין חיידקים שונים. זנים של E. coli.
יתרה מכך, לאחרונה הוכחה האפשרות של העברה מצומדת של DNA מתאי חיידקים לתאי בעלי חיים מתורבתים. במהלך הצמידה, מועבר רק גדיל אחד של הפלסמיד התורם, עליו מסונתז הגדיל השני. זה גורם לכך שהפלסמיד המועבר בצמידות לא מותקף על ידי אנזימי הגבלת המארח. היעילות של שיטה זו עבור חיידקים דומה לזו של טרנספורמציה.
זיהום ויראלי. להחדרת וקטורים המבוססים על וירוסים, נעשה שימוש נרחב בנתיב הזיהום הטבעי של התא המארח, התלוי בסוג הנגיף.
שיטות ניקוב. אחת השיטות הפופולריות להחדרת חומצות גרעין לתאי מטרה היא אלקטרופורציה - יצירה זמנית של נקבוביות בממברנה דו-שכבתית של שומנים בחשיפה קצרה לשדה חשמלי. זוהי שיטה פיזיקלית אוניברסלית של טרנספורמציה, שהטכניקה שלה פותחה כמעט לכל סוגי התאים.
כאשר עובדים עם E. coli, תרחיף התא המוכן (~50 μl) וה-DNA ממוקמים בין האלקטרודות ומופעל דופק זרם יחיד באורך של ~4.5 אלפיות השנייה במתח של 1.8 קילו וולט, המרחק בין האלקטרודות הוא 1 מ"מ. לאחר טיפול כזה, יעילות הטרנספורמציה עולה ל-109-1011 עבור פלסמידים קטנים (~3-6 kb) ועד 106 עבור גדולים (~135 kb). תנאים דומים משמשים להחדרת וקטור BAC לתוך E. coli.
ההשפעה האלקטרופורטיבית של פריקת מתח גבוה על קרום שומנים דו-שכבתי תלויה ככל הנראה ברדיוס העקמומיות שלו. לכן, תאי חיידקים קטנים סופגים DNA ביעילות בחוזק שדה גבוה בהרבה (12-18 קילו וולט/ס"מ) מאשר תאי בעלי חיים וצמחים גדולים הקולטים DNA ביעילות בחוזק שדה של 1-2 קילו וולט/ס"מ. אלקטרופורציה היא השיטה הפשוטה, היעילה והניתנת לשחזור להחדרת מולקולות DNA לתאים, אשר, עם זאת, דורשת מכשיר אלקטרופורטור מיוחד.
שיטות ניקוב נוספות להעברת DNA לתא: טיפול בתאים באולטרסאונד, גרידה של תאים ממצע בנוכחות חומר אקסוגני, צנטריפוגה של תאים בתווך עם DNA בשילוב אלקטרופורציה, ניקוב אוסמוטי של קרום הפלזמה, בדיקה של תא. באמצעות מיקרו-קרן לייזר, שימוש ברעלן סטרפטוליזין-O היוצר נקבוביות.
טרנספקציה. בתחילה, פירוש המונח הזה היה החדרת DNA ויראלי לתאים, כעת המשמעות שלו התרחבה למשמעות החדרה של כל DNA זר לתאים אוקריוטיים. המונח "טרנספורמציה", המציין את תהליך החדרת ה-DNA לתא עבור פרוקריוטים ושמרים, התברר כבלתי נוח לשימוש, שכן ביחס לתאי בעלי חיים, טרנספורמציה היא הפיכת תאים נורמליים לתאים סרטניים. במובן הצר, טרנספקציה מובנת בדרך כלל כהחדרת DNA לתאים איקריוטים באמצעות ריאגנטים כימיים שונים.
אחת השיטות הראשונות שפותחו להעברה יעילה הייתה דגירת DNA עם DEAE-dextran. היעילות שהתקבלה הייתה דומה לטרנספורמציה של חיידקים והגיעה ל-106 טרנספקנטים לכל מיקרוגרם של DNA.
מנגנון הפעולה של DEAE-dextran לא הוקם במלואו, אך ידוע שהוא נקשר ל-DNA ולקרום התא, מעורר פינוציטוזיס (איור 2.8), למרות שהוא עצמו אינו נקלט בתאים. החסרונות של השיטה כוללים את הרעילות של DEAE-dextran לחלק מסוגי התאים, תלות היעילות באיכות התכשיר ותדירות נמוכה מאוד של קבלת טרנספקנטים יציבים.
אורז. 2.8. תכנית החדרת DNA כחלק ממתחמים שונים לתא על ידי אנדוציטוזיס: פגוציטוזיס ופינוציטוזיס (א). ייצוג סכמטי של חלקיק מפוליקטיון לא שומני בדנדרופורם עם DNA קשור, שהמטען השלילי שלו מפוצה על ידי פולימר קטיוני (ב)
יעילות ההעברה גדלה פי 10-100 על ידי דגירה של תאים עם DNA מושקע בסידן פוספט. חלקיקים צפופים של משקע הסידן של ה-DNA נספגים בתא על ידי פגוציטוזה (איור 2.8), אך רק חלק קטן מהמולקולות החודרות מגיע לגרעין ומשולב ב-DNA הכרומוזומלי. שיטת סידן פוספט יעילה וזולה יותר, אך גורמת לשבירה של מולקולות DNA, מה שממיר מולקולות מעגליות לצורה ליניארית, לעיתים לא זיהומית במקרה של טרנספקציה של וירוסים. בנוסף, התנאים להעברת סידן פוספט צריכים להיבחר בנפרד עבור כל תא מטרה.
במהלך החיפוש אחר ריאגנטים אחרים לטרנספקציה, נמצא שמולקולות פולימר הנושאות מטען קטיוני עודף יכולות להגביר באופן משמעותי את יעילות ההעברה. קטיונים פולימריים יוצרים קומפלקסים יציבים עם מטענים מנוטרלים עם חומצות גרעין, שיכולות להעביר DNA ו-RNA לתוך התא ביעילות גבוהה, תוך הגנה מפני פעולת אנדונוקלאזים בדרך לגרעין (איור 2.9).
אורז. 2. 9. סכימה של הובלת DNA לגרעין התא כחלק מקומפלקס פוליקיון-DNA הקשור לליגנד ספציפי על ידי אנדוציטוזיס מתווכת ליגנד
קטיונים פולימריים סינתטיים שאינם שומנים במבנה ליניארי או מסועף (צורה דנדרטית) יכולים לעבות DNA ו-RNA לחלקיקים קטנים יחסית, אשר לאחר מכן נקשרים לממברנת התא וחודרים לתא על ידי אנדוציטוזיס לא ספציפי. כיום, לצורך טרנספקציה מקבוצת הפוליקטציות הלא-ליפידיות, בעיקר פוליאתילןאימין, פוליאמידואמינים ודנדרמרים המבוססים עליהם, נעשה שימוש בחלבונים קטיוניים כגון פוליזין, פרוטמין והיסטונים, וכן מוצרים מסחריים שונים, כגון PAMAM.
מהפכה הייתה ההחדרה הלכה למעשה של הליפיד הקטיוני הנמוך-רעיל הראשון DOTMA (1,2-dioleyl-3-N,N,N-trimethylaminopropane) שסונתז על ידי Feigner (Feigner, 1987) וחב'. יעילות הטרנספקציה עם הליפיד הקטיוני (איור 2.10) הייתה גדולה פי 100 בערך מכל כימיקל אחר, עם חלק גדול של תאים מהונדסים יציבים.
אורז. איור 2. 10. מבנה הקומפלקס עם DNA (א) ומבנה כללי של פולימר השומנים הקטיוני (ב). פולימרים ליפידים קטיוניים (לינארים ומסועפים), הדומים במבנה ובמאפיינים לפוספוליפידים של קרום התא, יוצרים קומפלקסים עם DNA בצורה של ליפוזומים קטיוניים רב-שכבתיים (א) עם ערבוב פשוט של ריאגנטים. קומפלקסים כאלה נכנסים לתא על ידי אנדוציטוזיס או איחוי עם קרום התא דרך החלק השומני.
במקביל, הוכנס לפועל מונח חדש "lipofection", המדגיש את היעילות הגבוהה של טרנספורמציה גנטית של תאים, ומקרב קומפלקסים שומנים-קטיוניים לחלקיקים ויראליים מדבקים.
בהתבסס על הצלחה זו, פותחו וריאציות רבות של תרכובות אלו (Lipofectin, Lipofectamine, Cellfectin וכו').
במקביל, פותחו כלי אספקה המבוססים על ליפוזומים של פוספוליפידים ממולאים ב-DNA או RNA.
כדורים קטנים של ממברנות מלאכותיות יכולות להתמזג עם ממברנות פלזמה של תאים או להיקלט על ידי אנדוציטוזיס, ולשחרר את התוכן לתוך התא. היעילות הנמוכה של טרנספקציה ליפוזומלית גדלה על ידי החדרת פוספוליפידים למבנה של ליפוזומים, למשל, קרדיוליפין ופוספטידיל-אתנולמין, אשר יחד עם ממברנות דו-שכבתיות, יוצרים גם מבנים מיסלריים הפוכים, הידועים כשלבים מעוקבים ומשושים, המסוגלים להניע ממברנה. היתוך.
השיטה הליפוזומלית היא קפריזית למדי ודורשת בחירה קפדנית של כל התנאים להעברה יעילה של תאים ספציפיים. בנוסף, הליך האנקפסולציה, בדרך כלל קולי, פוגע לעתים קרובות במולקולות DNA גדולות.
שלב חדש בפיתוח ריאגנטים לטרנספקציה היה פיתוח אספקה יעילה וממוקדת יותר של חומצות גרעין לתאי מטרה ספציפיים על ידי החדרת ליגנדים שונים למבנה של ריאגנטים וליפוזומים סינתטיים לטרנספקציה לקשירה לחלבוני קולטני הממברנה. הנוכחות של קבוצות יעד כאלה (ליגנדים) המוכרות על ידי קולטנים תאיים מאפשרת להשתמש במנגנונים של אנדוציטוזיס בתיווך ליגנד (ראה איור 2.9).
ככאלה משתמשים בליגנדים, חלבונים ופפטידים המוכרים על ידי קולטנים; אוליגוסכרידים, שכן על פני השטח של תאי בעלי חיים רבים יש לקטינים - חלבוני קולטן הקושרים אותם באופן ספציפי; פוליסכרידים. תהליכי האינטראקציה עם תאים של קומפלקסים ממוקדים כאלה של ריאגנטים להעברה של DNA(RNA) דומים לחדירה של חלקיקים ויראליים לתא.
כיום, חברות ביוטכנולוגיה מציעות מגוון רחב של ריאגנטים שונים לטרנספקציה - מהפשוטים והזולים ביותר ועד לפיתוחים האחרונים, המתמחים בסוגי תאים ומשימות שונות. גם היצירה של ריאגנטים חדשים להעברה יעילים עוד יותר נמשכת באינטנסיביות.
הזרקת מיקרו - ממברנת התא מנוקבת במיקרו-מחט ותמיסה המכילה DNA מוזרקת לציטופלזמה של התא או ישירות לגרעין אם הגרעין גדול מספיק (לדוגמה, גרעין ביצית). הזרקת מיקרו של DNA לתאי יונקים התאפשרה עם הופעתו של מכשיר לייצור מיקרופיפטות בקוטר של 0.1-0.5 מיקרון ומיקרומניפולטור. השיטה יעילה מאוד, שיעור התאים עם אינטגרציה וביטוי יציב של גנים מוזרקים יכול להגיע ל-50%. היתרון של השיטה המתוארת הוא גם בכך שהיא מאפשרת הכנסת כל DNA לתאים כלשהם ולא נדרש לחץ סלקטיבי כדי לשמר את הגן שהוכנס לתאים.
טרנספקציה בליסטית, ביו-בליסטיקה או ביוליסטיקה (הפצצת מיקרו-חלקיקים), מבוססת על הפצצת תאים עם מיקרוספרות בגודל של כ-1-2 מיקרון, המצופים ב-DNA. נעשה שימוש במיקרו-חלקיקים של זהב, טונגסטן (לעיתים פיטוטוקסי), סיליקון וננוספרות סינתטיות שונות. מיקרו-חלקיקים מצופים ב-DNA עוברים דרך שכבות התאים ומעבירים את המבנה הגנטי ישירות לאברונים ולגרעינים של התאים. נוצר למטרה זו, "אקדח הגנים" (ג'ין אקדח), או "אקדח הגנים", אשר פותח על ידי ג'יי סנפורד בשנת 1987 כדי להחדיר DNA לדגנים, דומה בעיצובו לנשק פנאומטי (איור 2.11). .
אורז. 2.11. החדרת DNA רקומביננטי לעלי צמחים באמצעות אקדח גנים לשימוש חוזר ביו-ראד (א) והסכמה הכללית שלו (ב). פעימת ההליום פולטת מיקרו-חלקיקים מצופים ב-DNA או RNA מהקפסולה של הדגימה. מיקרו-חלקיקים הנושאים DNA מואצים וממוקדים לחדירה מקסימלית לתאים, נעים לאורך תעלת האצה ולאורך קנה האקדח, בעוד ביציאה רחבה זרימת ההליום מתפצלת לצדדים. מרווח המסנן שומר על המרחק האופטימלי לפגוע במטרה עם הסרת הליום מקסימלית כדי למזער השפעות מזיקות על פני התא.
עומק החדירה של מיקרו-חלקיקים, ככלל, קטן - עד 1 מ"מ, עם זאת, בתנאים מיוחדים של הפגזה, מיקרו-חלקיקים יכולים לחדור לרקמה לעומק של 4-5 מ"מ ולהעביר גנים, למשל, לסיבי שריר מפוספסים. טרנספקציה בליסטית יעילה מאוד גם כאשר דפנות תאים עבות (שמרים, צמחים) מהוות מכשול לשיטות מסירה רבות אחרות, והיא מיושמת על רקמות, איברים ואפילו אורגניזמים שלמים. כיום הוא נמצא בשימוש נרחב בריפוי גנטי להשגת בעלי חיים וצמחים מהונדסים.
מגוון כזה של אמצעים ושיטות טרנספקציה נובע ממשימות שונות, מגוון רחב של תאי מטרה וסוגים של חומצות גרעין המועברות לתאים, כמו גם הצורך של החברה להשיג יותר ויותר אמצעים יעילים להעברת מידע גנטי לתאים. , רקמות ואורגניזמים שלמים. תשומת לב מיוחדת מוקדשת לפיתוח של ריאגנטים ושיטות לטרנספקציה בקשר עם הסיכויים המדהימים של טיפול גנטי אנושי, הדורש כלי העברת גנים ממוקדים, יעילים ובטוחים ביותר.
החדרה יציבה וחולפת של DNA זר לתא. לאחר החדרת DNA רקומביננטי לתא איקריוטי, רק חלק קטן ממנו מגיע לגרעין, שכן הממברנה הגרעינית מהווה מחסום אדיר בפני DNA זר. בגרעין, DNA רקומביננטי יכול להשתלב בכרומוזום או להתקיים במשך זמן מה במצב חוץ כרומוזומלי.
בהתאם לכך, מבחינים בין טרנספקציה יציבה, כאשר DNA רקומביננטי משתלב בכרומוזומים של תאים המקבלים והופך לחלק בלתי נפרד מהם, וכן טרנספקציה זמנית או חולפת, שבה קיימות מולקולות DNA רקומביננטיות ומתועתקות בגרעינים בחוץ כרומוזומלית. מדינה לזמן קצר. תורשה יציבה של DNA זר שהוכנס היא התנאי העיקרי להשגת אורגניזמים מהונדסים למטרות כלכליות.
לכן, מוקדשת תשומת לב מיוחדת לפיתוח שיטות להחדרת DNA לתאים, המובילות לייצור חלק גדול יותר של טרנספורמנטים יציבים. בנוסף, אחוז גדול של טרנספורמנטים יציבים מאפשר גם לנטוש גנים סלקטיביים וסמנים שהם נטל ביצירת אורגניזמים מהונדסים.
על. Voinov, T.G. וולובה
מחקרים רבים מראים ששימוש בווירוסים שונים הוא פתרון יעיל מאוד, מה שמאפשר לעבור את ההגנות החיסוניות של הגוףולאחר מכן להדביק את התאים, באמצעותם להפיץ את הנגיף. לצורך ביצוע הליך זה בחרו מהנדסים גנטיים את הנגיפים המתאימים ביותר מקבוצת הרטרו-וירוסים והאדנו-וירוסים. רטרו-וירוסים מביאים מידע גנטי בצורה של חומצה ריבונוקלאית (RNA), מולקולה דמוית DNA המסייעת בעיבוד המידע הגנטי המאוחסן ב-DNA. ברגע שניתן לחדור לעומק מה שנקרא תא המטרה, מתקבל עותק של מולקולת ה-DNA ממולקולת ה-RNA. תהליך זה נקרא תעתיק הפוך.ברגע שמולקולת DNA חדשה מחוברת לתא, כל העותקים החדשים של התא יכילו את הגן שעבר שינוי.
נגיפי אדנו נושאים מידע גנטי באופן מיידי בצורה של DNA, המועבר לתא שאינו מתחלק. למרות ש נגיפים אלו מעבירים DNA ישירות לגרעין תא המטרהה-DNA אינו מתאים לגנום של התא. לפיכך, הגן המותאם והמידע הגנטי אינם מועברים לתאי בת. היתרון של טיפול גנטי המתבצע עם אדנוווירוסים הוא שניתן להחדיר גנים לתאי מערכת העצבים ולתוך הממברנה הרירית של דרכי הנשימה, שוב, באמצעות וקטור. בנוסף, קיימת שיטה שלישית של ריפוי גנטי, המתבצעת באמצעות מה שנקרא נגיפים הקשורים לאדנו. וירוסים אלו מכילים כמות קטנה יחסית של מידע גנטי, וקשה הרבה יותר להעלים מאשר רטרו-וירוסים ואדנו-וירוסים. עם זאת, היתרון של וירוסים הקשורים לאדנו הוא שהם אינם גורמים לתגובה של מערכת החיסון האנושית.
שיטה גנאלוגית של אנתרופוגנטיקה
הבסיס של שיטה זו הוא הידור וניתוח של אילן יוחסין. שיטה זו נמצאת בשימוש נרחב מימי קדם ועד ימינו בגידול סוסים, בבחירת קווים יקרי ערך של בקר וחזירים, בהשגת כלבים גזעיים, וכן בגידול גזעים חדשים של חיות פרווה.
כשיטה לחקר הגנטיקה האנושית, השיטה הגנאלוגית החלה לשמש רק מתחילת המאה ה-20, כאשר התברר כי ניתוח אילן יוחסין בהם ניתן להחליף העברת תכונה (מחלה) כלשהי מדור לדור. בשיטה ההיברידולוגית, שלמעשה אינה ישימה על בני אדם.
כשעורכים אילן יוחסין, המקור הוא אדם - פרובנד, שאילן היוחסין שלו נחקר. בדרך כלל מדובר בחולה, או בנשא של תכונה מסוימת, שיש לחקור את תורשתו. בעת עריכת טבלאות גנאלוגיות, נעשה שימוש בסמלים שהציע G. Yust בשנת 1931 (איור 6.24). דורות מסומנים בספרות רומיות, פרטים בדור מסוים מסומנים בספרות ערביות.
בעזרת השיטה הגנאלוגית ניתן לקבוע את ההתניה התורשתית של התכונה הנחקרת וכן את סוג ההורשה שלה (אוטוזומלי דומיננטי, אוטוזומלי רצסיבי, דומיננטי X-linked או רצסיבי, Y-linked). כאשר מנתחים אילן יוחסין עבור מספר תכונות, ניתן לחשוף את האופי המקושר של תורשתם, המשמש בעת עריכת מפות כרומוזומים. שיטה זו מאפשרת ללמוד את עוצמת תהליך המוטציה, להעריך את הביטוי והחדירה של האלל. זה נמצא בשימוש נרחב בייעוץ גנטי רפואי כדי לחזות צאצאים. עם זאת, יש לציין כי ניתוח גנאלוגי הופך להיות הרבה יותר מסובך כאשר למשפחות יש מעט ילדים.