שינוי גנים של מחלות זיהומיות. טיפול גנטי. בעיות עימן ריפוי גנטי

מבוא

מדי שנה מופיעים יותר ויותר מאמרים בכתבי עת מדעיים על מחקרים קליניים רפואיים, שבהם נעשה, כך או כך, טיפול המבוסס על החדרת גנים שונים - ריפוי גנטי. הכיוון הזה צמח מתוך ענפים מפותחים של ביולוגיה כמו גנטיקה מולקולרית וביוטכנולוגיה.

לעתים קרובות, כאשר שיטות קונבנציונליות (שמרניות) כבר נוסו, הריפוי הגנטי הוא זה שיכול לעזור לחולים לשרוד ואף להחלים לחלוטין. לדוגמה, זה חל על מחלות מונוגניות תורשתיות, כלומר, אלה הנגרמות על ידי פגם בגן בודד, כמו גם רבות אחרות. או, למשל, טיפול גנטי יכול לעזור ולהציל איבר עבור אותם חולים שהצרו את לומן הכלים בגפיים התחתונות וכתוצאה מכך התפתחה איסכמיה מתמשכת של הרקמות הסובבות, כלומר, רקמות אלו חוות מחסור חמור בחומרים מזינים וחמצן, אשר בדרך כלל נישאים בדם דרך הגוף. לעתים קרובות אי אפשר לטפל בחולים כאלה עם מניפולציות כירורגיות ותרופות, אבל אם התאים ייאלצו מקומית לזרוק יותר גורמי חלבון שישפיעו על תהליך היווצרות ונביטה של כלי דם חדשים, אז האיסכמיה תהיה הרבה פחות בולטת והיא תהפוך הרבה יותר קל לחולים לחיות.

טיפול גנטיכיום ניתן להגדיר כטיפול במחלות על ידי החדרת גנים לתאי חולים במטרה לכוון לפגמים בגנים או לתת לתאים פונקציות חדשות. הניסויים הקליניים הראשונים של שיטות ריפוי גנטי בוצעו לאחרונה ב-22 במאי 1989 על מנת לאבחן סרטן. המחלה התורשתית הראשונה שעבורה יושמו שיטות ריפוי גנטי הייתה כשל חיסוני תורשתי.

מדי שנה גדל מספר הניסויים הקליניים המבוצעים בהצלחה לטיפול במחלות שונות באמצעות ריפוי גנטי, ועד ינואר 2014 הגיע ל-2,000.

יחד עם זאת, במחקר המודרני על ריפוי גנטי, יש לקחת בחשבון שההשלכות של מניפולציה של גנים או DNA "דשדש" (רקומביננטי). in vivo(לט. מילולית "חי") לא נחקרו מספיק. במדינות בעלות רמת המחקר המתקדמת ביותר בתחום זה, במיוחד בארצות הברית, פרוטוקולים רפואיים המשתמשים ברצפי DNA של חוש כפופים לבדיקה חובה בוועדות ובוועדות הרלוונטיות. בארה"ב, מדובר בוועדה המייעצת ל-DNA רקומביננטי (RAC) ומנהל המזון והתרופות (FDA) עם אישור חובה לאחר מכן של הפרויקט על ידי מנהל המכונים הלאומיים לבריאות (המכונים הלאומיים לבריאות).

לכן, החלטנו שהטיפול הזה מבוסס על העובדה שאם לחלק מהרקמות בגוף חסרים כמה גורמי חלבון בודדים, אז ניתן לתקן זאת על ידי הכנסת הגנים המקודדים לחלבון המתאימים לרקמות הללו, והכל יהפוך להיות נפלא יותר או פחות. . לא ניתן להזריק את החלבונים עצמם, כי הגוף שלנו יגיב מיד בתגובה חיסונית לא חלשה, ומשך הפעולה לא יספיק. כעת עלינו להחליט על השיטה להעברת הגן לתאים.

טרנספקציה תאים

מלכתחילה, כדאי להציג הגדרות של כמה מונחים.

הובלת גנים מתבצעת על ידי וֶקטוֹרהיא מולקולת DNA המשמשת כ"כלי רכב" להעברה מלאכותית של מידע גנטי לתא. ישנם סוגים רבים של וקטורים: פלסמיד, ויראלי, כמו גם קוסמידים, פאסמידים, כרומוזומים מלאכותיים וכו'. ישנה חשיבות בסיסית שלווקטורים (במיוחד לוקטורי פלסמיד) יש תכונות אופייניות שלהם:

1. מקור השכפול (ori)- רצף הנוקלאוטידים בו מתחילה שכפול DNA. אם לא ניתן לשכפל (לשכפל) DNA וקטור, אזי האפקט הטיפולי הדרוש לא יושג, כי הוא פשוט יבקע במהירות על ידי אנזימי נוקלאז תוך תאיים, ובשל המחסור בתבניות, בסופו של דבר ייווצרו הרבה פחות מולקולות חלבון. יש לציין שנקודות אלו הן ספציפיות לכל מין ביולוגי, כלומר, אם ה-DNA הווקטור אמור להתקבל על ידי רבייה שלו בתרבית חיידקים (ולא רק על ידי סינתזה כימית, שהיא בדרך כלל הרבה יותר יקרה), אז שתי נקודות מקור שכפול יידרשו בנפרד - לבני אדם ולחיידקים;

2. אתרי הגבלה- רצפים קצרים ספציפיים (בדרך כלל פלינדרוםיים), המוכרים על ידי אנזימים מיוחדים (אנדונוקליזות הגבלה) ונחתכים על ידם בצורה מסוימת - עם היווצרות "קצוות דביקים" (איור 1).

איור 1 היווצרות "קצוות דביקים" בהשתתפות מגבלות

אתרים אלו נחוצים על מנת להצליב את ה-DNA הווקטור (שהוא למעשה "ריק") עם הגנים הטיפוליים הרצויים למולקולה אחת. מולקולה כזו המוצלבת משני חלקים או יותר נקראת "רקומביננטית";

3. ברור שהיינו רוצים להשיג מיליוני עותקים של מולקולת ה-DNA הרקומביננטי. שוב, אם בתרבית של תאים חיידקים עסקינן, אז יש לבודד את ה-DNA הזה עוד יותר. הבעיה היא שלא כל החיידקים יבלעו את המולקולה שאנחנו צריכים, חלק לא. על מנת להבחין בין שתי הקבוצות הללו, הן מוכנסות ל-DNA הווקטור סמנים סלקטיביים- אזורי עמידות בפני כימיקלים מסוימים; עכשיו, אם אותם חומרים יוסיפו לסביבה, אז רק אלה שעמידים בפניהם ישרדו, והשאר ימותו.

ניתן לראות את כל שלושת המרכיבים הללו בפלסמיד הראשון המסונתז באופן מלאכותי (איור 2).

איור 2

עצם התהליך של החדרת וקטור פלסמיד לתאים מסוימים נקרא טרנספקציה. פלסמיד הוא מולקולת DNA קצרה למדי ובדרך כלל עגולה שנמצאת בציטופלזמה של תא חיידק. פלסמידים אינם קשורים לכרומוזום החיידקי, הם יכולים להתרבות ללא תלות בו, הם יכולים להשתחרר על ידי החיידק לסביבה או להיפך, להיספג (תהליך הספיגה הוא טרנספורמציה). בעזרת פלסמידים, חיידקים יכולים להחליף מידע גנטי, למשל להעביר עמידות לאנטיביוטיקה מסויימת.

פלסמידים קיימים בחיידקים in vivo. אבל אף אחד לא יכול למנוע מחוקר לעשות סינתזה מלאכותית של פלסמיד שיהיה לו את התכונות שהוא צריך, לתפור לתוכו גן ולהכניס אותו לתא. ניתן להחדיר תוספות שונות לאותו פלסמיד .

שיטות ריפוי גנטי

ישנן שתי גישות עיקריות הנבדלות באופי של תאי המטרה:

1. עובר, שבו DNA זר מוכנס לזיגוטה (ביצית מופרית) או לעובר בשלב מוקדם של התפתחות; במקרה זה, צפוי שהחומר המוכנס יכנס לכל תאי הנמען (ואפילו תאי נבט, ובכך יבטיח העברה לדור הבא). בארצנו זה בעצם אסור;

2. סומטי, שבו החומר הגנטי מוכנס לתאי המין של הנולדים שכבר נולדו והוא אינו מועבר לתאי הנבט.

טיפול גנטי in vivoמבוסס על החדרה ישירה של רצפי DNA משובטים (מכפילים) וארוזים ספציפית לרקמות מסוימות של המטופל. מבטיח במיוחד לטיפול במחלות גנים in vivo הוא הכנסת גנים באמצעות אירוסול או חיסונים בהזרקה. טיפול גנטי אירוסול מפותח, ככלל, לטיפול במחלות ריאה (סיסטיק פיברוזיס, סרטן ריאות).

לפיתוח תוכנית ריפוי גנטי מקדימים שלבים רבים. זהו ניתוח יסודי של הביטוי הספציפי לרקמות של הגן המקביל (כלומר, סינתזה על מטריצת הגן של חלבון כלשהו ברקמה מסוימת), וזיהוי הפגם הביוכימי העיקרי, וחקר המבנה, התפקוד וה הפצה תוך תאית של מוצר החלבון שלו, כמו גם ניתוח ביוכימי של התהליך הפתולוגי. כל הנתונים הללו נלקחים בחשבון בעת עריכת הפרוטוקול הרפואי המתאים.

חשוב שבעת עריכת סכמות לתיקון גנים, יעילות ההעברה, מידת התיקון של הפגם הביוכימי העיקרי בתנאי תרבית תאים ( בַּמַבחֵנָה,"במבחנה"), והכי חשוב, in vivoעל מודלים ביולוגיים של בעלי חיים. רק אז ניתן להתחיל את תוכנית הניסויים הקליניים. .

מסירה ישירה ונושאים תאיים של גנים טיפוליים

ישנן שיטות רבות להחדרת DNA זר לתא איקריוטי: חלקן תלויות בעיבוד פיזי (אלקטרופורציה, מגנטופציה וכו'), אחרות בשימוש בחומרים כימיים או בחלקיקים ביולוגיים (למשל וירוסים) המשמשים כנשאים. כדאי להזכיר מיד שבדרך כלל משולבים שיטות כימיות ופיזיקליות (לדוגמה, אלקטרופורציה + עטיפת DNA בליפוזומים)

שיטות ישירות

1. ניתן לסווג טרנספקציה על בסיס כימי למספר סוגים: שימוש בחומר ציקלודקסטרין, פולימרים, ליפוזומים או ננו-חלקיקים (עם או בלי פונקציונליזציה כימית או ויראלית, כלומר שינוי פני השטח).
א) אחת השיטות הזולות ביותר היא השימוש בסידן פוספט. זה מגביר את היעילות של שילוב DNA בתאים פי 10-100. ה-DNA יוצר קומפלקס חזק עם סידן, המבטיח ספיגה יעילה שלו. החיסרון הוא שרק כ-1 - 10% מה-DNA מגיע לגרעין. שיטה בשימוש בַּמַבחֵנָהלהעביר DNA לתאים אנושיים (איור 3);

איור 3

ב) שימוש במולקולות אורגניות מסועפות מאוד - דנדרימר, לקשירת DNA והעברתו לתא (איור 4);

איור.4

ג) שיטה יעילה מאוד לטרנספקציה של DNA היא הכנסתו דרך ליפוזומים - גופים קטנים, מוקפים בקרום, שיכולים להתמזג עם הממברנה הציטופלזמית התאית (CPM), שהיא שכבה כפולה של שומנים. עבור תאים איקריוטיים, טרנספקציה יעילה יותר עם ליפוזומים קטיוניים מכיוון שהתאים רגישים להם יותר. לתהליך יש שם משלו - lipofection. שיטה זו נחשבת לאחת הבטוחות כיום. ליפוזומים אינם רעילים ואינם אימוניים. עם זאת, היעילות של העברת גנים באמצעות ליפוזומים מוגבלת, שכן ה-DNA המוכנס על ידם לתאים בדרך כלל נלכד מיד על ידי ליזוזומים ונהרס. החדרת DNA לתאים אנושיים בעזרת ליפוזומים היא עמוד התווך של הטיפול כיום. in vivo(איור 5);

איור.5

ד) שיטה נוספת היא שימוש בפולימרים קטיוניים כגון דיאתילאמינואתיל-דקסטרן או פוליאתילןאימין. מולקולות DNA טעונות שלילי נקשרות לפוליקטציות טעונות חיוביות, והקומפלקס הזה חודר לתא על ידי אנדוציטוזיס. DEAE-dextran משנה את התכונות הפיזיקליות של קרום הפלזמה וממריץ את קליטת הקומפלקס הזה על ידי התא. החיסרון העיקרי של השיטה הוא ש-DEAE-dextran רעיל בריכוזים גבוהים. השיטה לא זכתה להפצה בריפוי גנטי;

ה) בעזרת היסטונים וחלבונים גרעיניים אחרים. חלבונים אלה, המכילים הרבה חומצות אמינו טעונות חיובית (Lys, Arg), בתנאים טבעיים עוזרים לארוז באופן קומפקטי שרשרת DNA ארוכה לגרעין תא קטן יחסית.

2. שיטות פיזיות:

א) אלקטרופורציה היא שיטה פופולרית מאוד; עלייה מיידית בחדירות הממברנה מושגת בשל העובדה שהתאים נתונים לחשיפה קצרה לשדה חשמלי אינטנסיבי. הוכח כי בתנאים אופטימליים מספר הטרנספורמנטים יכול להגיע ל-80% מהתאים ששרדו. כרגע הוא אינו בשימוש על בני אדם (איור 6).

איור 6

ב) "סחיטה של תאים" - שיטה שהומצאה בשנת 2013. היא מאפשרת להעביר מולקולות לתאים על ידי "סחיטה רכה" של קרום התא. השיטה מבטלת את האפשרות של רעילות או פגיעה שגויה במטרה, שכן היא אינה תלויה בחומרים חיצוניים או בשדות חשמליים;

ג) סונופורציה - שיטה של העברה מלאכותית של DNA זר לתאים על ידי חשיפתם לאולטרסאונד, הגורמת לפתיחת נקבוביות בקרום התא;
ד) טרנספקציה אופטית - שיטה בה יוצרים חור זעיר בממברנה (קוטר של כ-1 מיקרומטר) באמצעות לייזר ממוקד במיוחד;
ה) טרנספקציה הידרודינמית - שיטה להעברת מבנים גנטיים, חלבונים וכו'. על ידי עלייה מבוקרת בלחץ בנימים ובנוזל הביניים, הגורמת לעלייה קצרת טווח בחדירות ממברנות התאים ולהיווצרות נקבוביות זמניות בהן. זה מתבצע על ידי הזרקה מהירה לתוך הרקמה, בעוד הלידה אינה ספציפית. יעילות אספקה עבור שרירי השלד - 22 עד 60% ;

ו) הזרקת מיקרו-DNA - החדרה לגרעין של תאי בעלי חיים באמצעות מיקרוטובולים דקים מזכוכית (d=0.1-0.5 מיקרומטר). החיסרון הוא מורכבות השיטה, ההסתברות להרס של הגרעין או ה-DNA גבוהה; ניתן לשנות מספר מוגבל של תאים. לא משמש לבני אדם.

3. שיטות המבוססות על חלקיקים.

א) גישה ישירה לטרנספקציה היא אקדח הגנים, שבו הדנ"א מחובר לננו-חלקיק עם מוצקים אינרטיים (בדרך כלל זהב, טונגסטן), אשר לאחר מכן "יורה" מכוון אל גרעיני תאי המטרה. שיטה זו מיושמת בַּמַבחֵנָהו in vivoלהחדרת גנים, בפרט, לתאי רקמות השריר, למשל, במחלה כמו ניוון שרירים דושן. גודלם של חלקיקי זהב הוא 1-3 מיקרון (איור 7).

איור.7

ב) Magnetofection - שיטה המשתמשת בכוחות המגנטיות כדי להעביר DNA לתאי מטרה. ראשית, חומצות גרעין (NA) קשורות לננו-חלקיקים מגנטיים, ולאחר מכן, תחת פעולת שדה מגנטי, החלקיקים מונעים לתוך התא. היעילות היא כמעט 100%, חוסר רעילות ברור מצוין. כבר לאחר 10-15 דקות החלקיקים נרשמים בתא - זה הרבה יותר מהיר משיטות אחרות.
ג) Impalefection (impalefection; "impalment", סתיו "שיפוד" + "זיהום") - שיטת מסירה באמצעות ננו-חומרים כגון ננו-צינורות פחמן וננו-סיביים. במקרה זה, התאים ממש מחוררים על ידי מצעים של ננו-סיביים. הקידומת "ננו" משמשת לציון הגדלים הקטנים מאוד שלהם (בתוך מיליארדיות המטר) (איור 8).

איור.8

בנפרד, כדאי להדגיש שיטה כזו כמו טרנספקציה של RNA: לא DNA נמסר לתא, אלא מולקולות RNA - "יורשיהם" בשרשרת הביוסינתזה של חלבון; במקביל, מופעלים חלבונים מיוחדים שחותכים RNA לשברים קצרים - מה שנקרא. RNA מפריע קטן (siRNA). מקטעים אלו נקשרים לחלבונים אחרים ובסופו של דבר זה מוביל לעיכוב של ביטוי הגנים התואמים על ידי התא. כך, אפשר לחסום את פעולתם של אותם גנים בתא שעלולים לגרום יותר נזק מתועלת כרגע. העברת RNA מצאה יישום נרחב, במיוחד, באונקולוגיה.

העקרונות הבסיסיים של מסירת גנים באמצעות וקטורי פלסמיד נחשבים. עכשיו אנחנו יכולים לעבור לשיקול של שיטות ויראליות. וירוסים הם צורות חיים לא תאיות, לרוב מולקולת חומצת גרעין (DNA או RNA) עטופה במעטפת חלבון. אם נחתוך מהחומר הגנטי של הנגיף את כל אותם רצפים שגורמים להופעת מחלות, אז גם את הנגיף כולו ניתן בהצלחה להפוך ל"כלי" עבור הגן שלנו.

תהליך החדרת ה-DNA לתא, בתיווך נגיף, נקרא התמרה.
בפועל, לרוב משתמשים ברטרו-וירוסים, אדנו-וירוסים ווירוסים הקשורים לאדנו (AAV). מלכתחילה, כדאי להבין מה צריך להיות המועמד האידיאלי להתמרה בין וירוסים. הקריטריונים הם שזה חייב להיות:

יַצִיב;
. יכולת, כלומר, להכיל כמות מספקת של DNA;
. אינרטי ביחס למסלולים המטבוליים של התא;
. מדויק - באופן אידיאלי, הוא צריך לשלב את הגנום שלו במיקום ספציפי של הגנום של גרעין המארח וכו'.

בחיים האמיתיים, קשה מאוד לשלב לפחות כמה נקודות, כך שבדרך כלל הבחירה מתרחשת כאשר בוחנים כל מקרה בנפרד (איור 9).

איור.9

מבין שלושת הווירוסים הנפוצים ביותר ברשימה, AAV הוא הבטוח ביותר ובו בזמן המדויק ביותר. החיסרון היחיד כמעט שלהם הוא הקיבולת הקטנה יחסית שלהם (כ-4800 bp), אשר, עם זאת, מסתבר שמספיק לגנים רבים .

בנוסף לשיטות הנ"ל, תרפיה גנטית משמשת לעתים קרובות בשילוב עם טיפול תאי: ראשית, שותלים תרבית של תאים אנושיים מסוימים במדיום תזונתי, ואז הגנים הדרושים מוכנסים לתאים בדרך זו או אחרת, מטפחים עבור זמן מה והושתל שוב באורגניזם המארח. כתוצאה מכך, התאים יכולים לחזור לתכונות הרגילות שלהם. כך, למשל, תאי דם לבנים אנושיים (לויקוציטים) שונו בלוקמיה (איור 10).

איור.10

גורלו של הגן לאחר כניסתו לתא

מכיוון שהכל פחות או יותר ברור עם וקטורים ויראליים בשל יכולתם להעביר בצורה יעילה יותר גנים ליעד הסופי - הגרעין, נתעכב על גורלו של וקטור הפלסמיד.

בשלב זה, השגנו ש-DNA עבר את המחסום הגדול הראשון - הממברנה הציטופלזמית של התא.

בנוסף, בשילוב עם חומרים אחרים, עם או בלי קליפה, הוא צריך להגיע לגרעין התא כך שאנזים מיוחד - RNA פולימראז - מסנתז מולקולת RNA שליח (mRNA) על תבנית DNA (תהליך זה נקרא תַעֲתוּק). רק לאחר מכן, ה-mRNA ייכנס לציטופלזמה, יווצר קומפלקס עם ריבוזומים, ולפי הקוד הגנטי מסונתז פוליפפטיד - למשל גורם גדילה כלי דם (VEGF), שיתחיל לבצע פונקציה טיפולית מסוימת ( במקרה זה, זה יתחיל את תהליך היווצרות הסתעפות כלי דם ברקמה המועדת לאיסכמיה).

בכל הנוגע לביטוי הגנים המוכנסים בסוג התא הרצוי, בעיה זו נפתרת בעזרת אלמנטים מווסתים שעתוק. הרקמה שבה מתרחש הביטוי נקבעת לרוב על ידי שילוב של משפר ("משפר") ספציפי לרקמות עם מקדם ספציפי (רצף נוקלאוטידים שממנו מתחיל סינתזה של RNA פולימראז), אשר ניתן להשררה. . ידוע שניתן לווסת את פעילות הגנים in vivoאותות חיצוניים, ומכיוון שמשפרים יכולים לעבוד עם כל גן, ניתן להחדיר מבודדים לוקטורים המסייעים למשפר לעבוד ללא קשר למיקומו ויכולים להתנהג כמחסומים פונקציונליים בין גנים. כל משפר מכיל קבוצה של אתרי קישור להפעלה או דיכוי של גורמי חלבון. מקדמים יכולים גם לווסת את רמת ביטוי הגנים. לדוגמה, ישנם מקדמי מטלותיון או רגישים לטמפרטורה; מקדמי הורמונים מונעים.

ביטוי של גן תלוי במיקומו בגנום. ברוב המקרים, שיטות ויראליות קיימות מובילות רק להחדרה אקראית של גן לגנום. כדי לבטל תלות כזו, בעת בניית וקטורים, מסופק לגן רצפי נוקלאוטידים ידועים המאפשרים את ביטוי הגן ללא קשר לאתר ההחדרה שלו לגנום.

הדרך הפשוטה ביותר לווסת ביטוי טרנסגן היא לספק לו מקדם אינדיקטור הרגיש לאות פיזיולוגי כגון שחרור גלוקוז או היפוקסיה. מערכות בקרה "אנדוגניות" כאלה עשויות להיות שימושיות במצבים מסוימים, כגון בקרה תלויה בגלוקוז בייצור האינסולין. אמינות ומגוונות יותר הן מערכות בקרה "אקסוגניות", כאשר ביטוי הגנים נשלט מבחינה תרופתית על ידי הכנסת מולקולת תרופה קטנה. נכון להיום, ידועות 4 מערכות בקרה עיקריות - מווסתות על ידי טטרציקלין (Tet), סטרואיד חרקים, אקדיזון או האנלוגים שלו, תרופת האנטי-פרוגסטין maifpristone (RU486) ודימרייזרים כימיים כמו רפמיצין והאנלוגים שלו. כולם כרוכים בגיוס תלוי תרופתי של תחום הפעלת השעתוק למקדם הראשי המוביל את הגן הרצוי, אך שונים במנגנוני הגיוס הזה. .

סיכום

סקירת הנתונים מובילה למסקנה שלמרות המאמצים של מעבדות רבות בעולם, כולן כבר ידועות ונבדקו in vivoו בַּמַבחֵנָהמערכות וקטוריות רחוקות מלהיות מושלמות . אם הבעיה של מסירת DNA זר בַּמַבחֵנָהנפתרה למעשה, והמשלוח שלו לתאי מטרה של רקמות שונות in vivoנפתרו בהצלחה (בעיקר על ידי יצירת מבנים הנושאים חלבונים קולטן, כולל אנטיגנים ספציפיים לרקמות מסוימות), ואז מאפיינים אחרים של מערכות וקטוריות קיימות - יציבות אינטגרציה, ביטוי מווסת, בטיחות - עדיין זקוקים לשיפורים רציניים.

קודם כל, זה נוגע ליציבות האינטגרציה. עד כה, השתלבות בגנום הושגה רק באמצעות וקטורים רטרו-ויראליים או הקשורים לאדנו. ניתן לשפר את היעילות של אינטגרציה יציבה על ידי שיפור מבני גנים כגון מערכות מתווכות קולטן או על ידי יצירת וקטורים אפיזומים יציבים מספיק (כלומר, מבני DNA המסוגלים לשהות לאורך זמן בתוך גרעינים). לאחרונה ניתנה תשומת לב מיוחדת ליצירת וקטורים המבוססים על כרומוזומים מלאכותיים של יונקים. בשל נוכחותם של האלמנטים המבניים הבסיסיים של כרומוזומים רגילים, מיני כרומוזומים כאלה נשמרים בתאים לאורך זמן ומסוגלים לשאת גנים בגודל מלא (גנומי) ואת האלמנטים הרגולטוריים הטבעיים שלהם, הנחוצים לתפקוד נכון של הגן, ברקמה הנכונה ובזמן הנכון.

טיפול גנטי ותאים פותח בפנינו אפשרויות מזהירות לשיקום תאים ורקמות שאבדו ותכנון הנדסה גנטית של איברים, מה שללא ספק ירחיב משמעותית את ארסנל השיטות למחקר ביו-רפואי ויצור הזדמנויות חדשות לשימור והארכת חיי אדם.

כתבה לתחרות "ביו/מול/טקסט": « מישה נולד ב-12 בפברואר כילד בריא. אבל בגיל 1.5 חודשים התחלתי לשים לב שבכל הצילומים התינוק נוקט באותה תנוחה, כאילו רגליו היו ללא תנועה. תוך מספר שבועות אובחנו, קיבלנו אהדה והמליץ לנו להתחיל לתכנן ילד שני ובריא.". עקב שילוב קטלני של גנים, מישה, כמו ילדים אחרים עם מחלה זו, נאלץ להילחם על כל תנועה לאורך חייו הקצרים. להילחם נואשות, בכל הכוח, אבל בסופו של דבר להפסיד. ניוון שרירי עמוד השדרה (SMA) היא אחת החריגות הגנטיות שמולם האנושות עדיין חסרת אונים. עם זאת, ההתקדמות בריפוי גנטי שעולם הרפואה צופה בה כעת עשויה להפוך הן SMA והן פתולוגיות תורשתיות קשות אחרות לניתנות לטיפול. יתר על כן, הם עדיין ניתנים לריפוי ברחם.

נותנת החסות הכללית של התחרות היא חברת Diaem: הספקית הגדולה ביותר של ציוד, ריאגנטים וחומרים מתכלים למחקר וייצור ביולוגיים.

נותן החסות לפרס בחירת הקהל היה המרכז הרפואי הגנטי.

נותן החסות של "ספר" לתחרות - "אלפינה עיון"

הטבע עושה טעויות, האדם מתקן

הרעיון של ריפוי גנטי הוא אלגנטי ויפה, כמו כל גאונות. הוא מורכב מהעברת חומר גנטי בריא לתא בעזרת מערכות וקטוריות על מנת להחליף איתו את הגנים ה"שגויים" הקשורים למחלות שונות (איור 1).

"ביומולקולה" כבר כתבה בפירוט על אילו הזדמנויות פותחות ריפוי גנטי בטיפול בסרטן ובנומליות תורשתיות, בפרט, רטיניטיס פיגמנטוזה.

ואם בשנות ה-80 של המאה הקודמת, כשדיברו על ריפוי גנטי בקול רם למדי, התיאוריה שלה נראתה לרבים כהמשך של התסריט של הקלטת "בחזרה לעתיד", היום היא הפכה למציאות שנפתחת. סיכויים חדשים, באמת חסרי גבולות.

עם זאת, ברור שלריפוי גנטי יש מספר מגבלות, במיוחד כשמדובר במחלות תורשתיות. קודם כל, התהליך הפתולוגי במקרים כאלה יכול להתחיל אפילו ברחם. עד שהמחלה מאובחנת סופית - ולעיתים זה קורה שנים לאחר לידת הילד - יכולה להתפתח נזק בלתי הפיך לתאים ולאיברים, שמצמצם משמעותית את האפשרויות הטיפוליות או אפילו מבטל אותן.

הסיכוי לפתור בעיה זו הופיע הודות לאבחון טרום לידתי מודרני, המאפשר לזהות פגמים כרומוזומליים כבר בשלבים המוקדמים של ההריון. לאחר קבלת כל חומר עוברי באמצעות טכניקות פולשניות, ניתן לאבחן במהירות ובאמינות מחלות גנטיות. ובמקרים של המוגלובינופתיה, הצורך במניפולציות פולשניות נעלם לחלוטין: על מנת לזהותן, די בבדיקת DNA עוברי המתקבל מתאי דם אימהיים.

טכניקות אבחון טרום לידתי מודרניות בשילוב עם התקדמות בריפוי גנטי מספקות הזדמנות ייחודית לתקן את ה"טעות" של הטבע ולהתערב בתהליך הפתולוגי עוד לפני נזק בלתי הפיך לתאים. מתן טיפול למחלות שונות של הילד ברחם, או לפחות להכיל את התקדמות המחלה, ככל הנראה, יכול טיפול גנטי עוברי, או טיפול גנטי עוברי.

הרעיון של ריפוי גנטי עוברי רחוק מלהיות חדש: שנים ספורות לאחר הניסיון הראשון של ריפוי גנטי במבוגרים, בשנת 1994, החלו החוקרים לדון ברצינות בשימוש בטכניקה חדשנית ברחם. כיום, כשהטיפול במחלות גנטיות ברחם כמעט הפך מפוטנציאל פנטסטי למציאות, פורסמו מאמרים רבים, שבהם נחקרו בפירוט את הטיפול הגנטי בעובר ויתרונותיו בהשוואה לטיפול גנטי במבוגרים.

לפני הלידה נגדלאחר לידה

בציפייה לשאלות לגבי כדאיות תיקון תוך רחמי של אנומליה גנטית, הבה נתעכב מיד על היתרונות של טיפול גנטי עוברי בהשוואה לטיפול גנטי לאחר לידה.

הזדמנויות רבות להשפיע על איברים ומערכות

ידוע כי במחלות גנטיות רבות (לדוגמה, אפידרמוליזיס בולוזה או סיסטיק פיברוזיס), יכול להיות די קשה להשפיע על הקשרים העיקריים של התהליך הפתולוגי כמעט מיד לאחר הלידה. תיקון של גנים מוטנטיים בעובר מתפתח מאפשר גידול מהיר באוכלוסיית תאי הגזע, מתן מאגר גדול של תאים שעברו טרנספקציה וכתוצאה מכך אפקט טיפולי בולט.

ייצור פשוט של וקטור קליני הנושא חומר גנטי

המינון של הווקטור הנגיפי שבאמצעותו מועבר החומר הגנטי תלוי במשקל הגוף. בשל גודלו הקטן של העובר, ניתן להגיע להפצה ביולוגית גבוהה הרבה יותר של הווקטור באותו מינון כמו במהלך של טיפול גנטי למבוגרים. זה חוסך גם זמן וגם כסף. נתונים השוואתיים פשוטים עוזרים לדמיין עד כמה החיסכון משמעותי: למשל, עובר בשבועות 14–16 להריון (התקופה האופטימלית לזירוז וקטור) שוקל כ-100 גרם, בעוד שמשקל הגוף הממוצע של מבוגר הוא כ-60 ק"ג.

הגברת יעילות הטיפול עקב תגובה חיסונית נחותה

מספר מחקרים הוכיחו שחסינות הומורלית לאדנו-וירוסים ונגיפים הקשורים לאדנו (AAV) (איור 2) של סרוטיפים מסוימים המשמשים בדרך כלל כווקטורים עלולה להוביל לכשל בביטוי הטרנסגן. זה עשוי להפוך לאחד החסמים הקריטיים להשתלה מוצלחת.

כ-50% מהמבוגרים עם תגובה חיסונית נרכשת לוקטורים ויראליים אלו נמצאים בסיכון. אך גם בהיעדר רגישות, החדרת הווקטור למבוגרים מובילה לעיתים קרובות להתפתחות תגובה חיסונית המפחיתה את משך ורמת הביטוי הטרנסגני. אז, לאחר הזרקה תוך שרירית של וקטור אדנוויראלי עם גן חלבון דיסטרופיןעכברים בוגרים עם ניוון שרירים דושן מפתחים נוגדנים לדיסטרופין, אשר קשור לירידה משמעותית ביעילות הביטוי. יחד עם זאת, העובר ברחם אינו בשל מבחינה אימונולוגית, מה שמאפשר להעביר את הווקטור הנגיפי ואת המוצר הטרנסגני ללא המגבלה שמטילה התגובה החיסונית.

היתרונות הברורים של טיפול עוברי בהשוואה לתיקון לאחר לידה מבטיחים את יעילותו ויעילותו הגבוהה יותר, במיוחד במחלות קשות ומסכנות חיים. גם במקרים בהם לא ניתן להגיע לריפוי מלא, טיפול גנטי עוברי יכול להשפיע על הקשרים הפתולוגיים של המחלה, להקל על מהלך ולשפר את הפרוגנוזה. ולפיכך, היא זו שיכולה להפוך לאלטרנטיבה הטיפולית היחידה להפסקת הריון עבור אלפי משפחות. יתרה מכך, מספר המחלות שניתן לשלוט בהן על ידי הכנסת טיפול גנטי עוברי לפרקטיקה הקלינית הוא באמת עצום.

סיכויים והזדמנויות

מאמינים שטיפול גנטי עוברי יכול לשלוט בפתולוגיות מסוכנות רבות. רק חלק קטן מהם מוצג בטבלה 1.

טבלה 1. מחלות שניתן לשלוט בהן באמצעות טיפול גנטי עוברי .

מַחֲלָה	תרופה לטיפול גנטי	תאי מטרה ו/או איבר	גיל ביטוי המחלה	שְׁכִיחוּת	אורך חיים, משך חיים
סיסטיק פיברוזיס	CFTR (רגולטור טרנסממברני)	תאי אפיתל של דרכי הנשימה והמעיים	השליש השלישי להריון	1:4000	בן 35 בערך
ניוון שרירים דושן	דיסטרופין	מיוציטים	2 שנים	1:4500	25 שנים
ניוון שרירי עמוד השדרה	חלבון SMN	מוטונאורונים	6 חודשים (סוג I)	1:10 000	2 שנים
דַמֶמֶת	גורם קרישה VIII או IX	הפטוציטים	1 שנה	1:6000
בטא תלסמיה	גלובין	מבשרי RBC	עד שנה	1:2700	עד גיל 20
מחלת גושה	גלוקוצרברוסידאז	הפטוציטים	9.5 שנים	1:59 000	פחות משנתיים
פגמים במחזור אוריאה	Ornithine transcarbamylase	הפטוציטים	2 ימים	1:30 000	2 ימים
אפידרמוליזיס בולוזה	קולגן מסוג VII	קרטינוציטים	הוּלֶדֶת	1:40 000	עם טיפול נכון, תוחלת חיים תקינה
אנצפלופתיה איסכמית היפוקסית	גורמים נוירוטרופיים	נוירונים בקליפת המוח	הוּלֶדֶת	1:1000	עם טיפול נכון, תוחלת חיים תקינה
פיגור גדילה תוך רחמי חמור	גורמי גדילה שליה	טרופובלסט	עוּבָּר	1:500	מספר ימים

בנוסף, חלק מהפתולוגיות שניתן לצפות לשליטה בטיפול בעובר כוללות:

הפרעות בכשל חיסוני- תסמונת לימפוציטים עירומים, היפופלזיה בסחוס, תסמונת Chediak-Higashi, מחלה גרנולומטית כרונית, תסמונת קוסטמן, חוסר היצמדות לויקוציטים, תסמונת אומן, תסמונת Wiskott-Aldrich.
המוגלובינופתיה- מחלת Rh, פורפיריה אריתרופואטית מולדת.
מחלות הקשורות למחסור בפעילות האנזים, - מחלת גושה, מחלת קראבה, לויקודיסטרופיה מטאכרומטית, מוקופוליסכרידוזות, מחלת וולמן, מחלת נימן-פיק.
אַחֵר- דיסקראטוזיס מולדת, לימפהיסטיוציסטוזיס המפגוצית משפחתית, אוסטאופטרוזה אינפנטילית, תסמונת שוכמן-דיאמונד וכו'.

רשימת המחלות שיכולות להיות "על הכתף" של ריפוי גנטי עוברי היא מדהימה: ככל הנראה, טכניקה זו תאפשר התערבות בתהליכים פתולוגיים הנגרמים על ידי מחלות מונוגניות שבעבר לא היו בשליטתו של אדם. מספרם, לפי ארגון הבריאות העולמי, מגיע לעשרת אלפים. עם זאת, חשוב לקחת בחשבון את קיומן של מספר מגבלות, וקודם כל, את הסיכונים לאם ולעובר הקשורים בריפוי גנטי תוך רחמי.

פחדים וסיכונים

הסיכונים הספציפיים של העברת גנים לפני לידה שונים באופן מהותי מהסיכונים של טיפול גנטי לאחר לידה. אלה כוללים תגובות שליליות לטווח קצר והשפעות ארוכות טווח לאחר לידה. הרלוונטיות שלהם מחמירה בגלל העובדה שבאופן היפותטי, לביטוי גנים עובריים יכולה להיות השפעה בלתי צפויה על התפתחות טרום לידתי ואחרי לידה.

קודם כל, הליך ההעברה עצמו קשור ישירות לעלייה בסבירות להפלה, chorioamnionitis ולידה מוקדמת. מחקרים תיעדו תגובות דלקתיות לווקטור, בפרט חדירת כבד ונמק כבד בטיפול גנטי עוברי כבשים.

ניתן לנטרל את הצלחתו של טיפול גנטי עוברי על ידי התגובה החיסונית של העובר, וזו טומנת בחובה סיכונים מסוימים לתוצאה הסופית. תגובות הומורליות ותאיות להחדרת חלבון וקטור או מהונדס דרך מערכות המתמר של תאים יכולות לחסל את תוצרי ההעברה או ליישר את הביטוי הטרנסגני. במקביל, מחקרים הוכיחו את התלות של עוצמת התגובה החיסונית בגיל ההריון. לא נרשמו תגובות חיסוניות משמעותיות להחדרת הווקטור ה-lentiviral בשלבים המוקדמים והבינוניים של ההריון, בעוד שעם כניסתו של וקטור האדנו-וירוס בשלבים המאוחרים יותר, נצפתה תגובה הומורלית חזקה כנגד אנטיגן הקפסיד.

אחת הבעיות החשובות ביותר של טיפול גנטי עוברי היא הסיכון הפוטנציאלי הנובע כאשר רצפי DNA של תורם מועברים לעובר. מכיוון ששילוב וקטור בתאי נבט עשוי להיות אקראי, תיאורטית עשויה להיות לכך השלכות קטסטרופליות על העובר. למעשה, ילד שמקבל חומר גנטי של תורם ברחם נולד מוטנט. המרכיב האתי של ריפוי גנטי מטריד את דעתם של מדענים ותיאולוגים. מאז לידת הכבשה המפורסמת ביותר בתולדות המדע, הכבשה האחרונה מזהירה מפני הסכנות שמביאה התערבות בתוכנית האל לאנושות.

היבט חשוב נוסף הוא האפשרות למוטגנזה בתאי העובר, המובילה לפגם בגן תפקודי כלשהו, שבסופו של דבר עלול לגרום למחלה גנטית נרכשת חדשה או לגידול ממאיר. הסבירות שלו נראית אמיתית עוד יותר בהתחשב בנתונים ממחקר בעכברים, שבמהלכו הביטוי של גנים בעכברים עובריים נתן תנופה להתפתחות של גידול בכבד.

בהקשר זה, ייתכן שתוצאות שני מחקרים המדגימים התפתחות של תופעות לוואי חמורות לאחר טיפול גנטי מוצלח לכשל חיסוני משולב הקשור ל-X אינן מקריות: במקרה הראשון, נרשמה ביטוי של מחלה לימפופרוליפרטיבית חד שבטי, ובמקרה השני. , ריבוי תאי T אלפא / בטא. בשני המקרים, הוקטור הרטרוויראלי השתלב בסמיכות לגן LMO2בתאי T מתרבים.

תיאורטית טיפול גנטי ex vivoיכול להיות בטוח יותר מאשר in vivoוקטור הקדמת עובר. אם כי זה לא שולל את האפשרות של מוטגנזה בתאים שהועברו רטרו-ויראלית בַּמַבחֵנָה, ניתן לקבוע ולבקר בקלות רבה יותר את החדרת המוטגן. עם זאת, לא ניתן לשלול לחלוטין סיבוכים אלה.

לבסוף, טיפול גנטי עוברי מגביר את הרגישות של תאי עובר להתמרה. התמרה רטרו-ויראלית ברמה נמוכה לאבות תאי נבט נצפתה בגונדות זכריות ונקבות בעקבות מתן תוך-צפקי של הווקטור לעוברי כבשים וקופים, בהתאמה. ניתוח של גורמים המובילים להתמרה לא מכוונת הראה שהרגישות של רקמת העובר לכך תלויה בגיל ההיריון, עם שיעורים גבוהים יותר של התמרה בתחילת ההריון.

מנקודת מבט של סיכונים פוטנציאליים, ברור שטיפול גנטי עוברי יכול להוות טיפול סביר רק למחלות גנטיות קשות, שאין אופציות אחרות לתיקונן. וביניהם, כמובן, מחלת גושה, הוכחה אפשרות של טיפול גנטי תוך רחמי במחקר שפורסם לאחרונה.

הראשון הלך: מחלת גושה

ביולי 2018 המגזין רפואת טבעפרסם את תוצאות מחקר בעכברים בראשות סיימון וואדינגטון ( סיימון וודינגטון) ממכון לונדון לבריאות האישה. תוצאות העבודה הוכיחו את היעילות של טיפול גנטי עוברי בטיפול במחלות ניווניות עצביות ובפרט במחלת גושה. זוהי הצורה הנפוצה ביותר בקרב פרמנטופתיות תורשתיות נדירות, המבוססת על מחסור בפעילות האנזים הליזוזומלי. גלוקוז cerebrosidase(איור 3), הנגרמת על ידי מוטציות בגן גלוקוצילסרמידאז. בהתאם לאופי המוטציות, יכולה להתפתח צורה נוירופתית חמורה של המחלה המתבטאת מינקות, או צורה עם הופעה הדרגתית יותר ותסמינים פחות חמורים. בעוד שהצורות הקלות יותר של מחלת גושה מגיבות היטב לטיפול תחליפי, הצורה החמורה עדיין קטלנית. סימנים לצורה חשוכת מרפא של מחלת גושה מופיעים בחודשי החיים הראשונים וכוללים תת לחץ דם שרירי מתקדם, התפתחות פסיכומוטורית מאוחרת ונסוגה וסימנים נוירולוגיים אחרים.

במחקרם, Waddington וחב' הדגימו כי מתן תוך גולגולתי של וקטור ויראלי 9 (AAV9) הקשור באדנו לעוברים של עכברים ביום ה-16 להריון הביא לביטוי מוגבר של גלוקוז סרברוסידאז, אשר עצר ניוון עצבי. יחד עם זאת, פעילות האנזים במוח הייתה דומה לזו בעכברים בריאים. למרות העובדה שעדיין אובחנו אצל מכרסמים חולים תהליך דלקתי במוח, הם התפתחו בצורה משמעותית יותר מאשר עכברים מקבוצת הביקורת, שנאלצו להרדים אותם שבועיים לאחר הטיפול בשל חומרת המחלה.

עכברים שטופלו בטיפול גנטי עוברי חיו לפחות 18 שבועות, היו פוריים וניידים. מעניין לציין שהחדרה של הווקטור לאחר הלידה גם הקלה על מהלך המחלה, אך הייתה פחות יעילה מביטוי טרום לידתי.

מכיוון ש-AAV9 הצליח להיכנס למוח מזרם הדם, הצוות של וואדינגטון ערך ניסוי נוסף שבו הזריקו מינון גבוה משמעותית של הווקטור לא למוח, אלא ישירות לדם של עכברים עובריים. במידה רבה לא ניתן היה להבחין בין העכברים לבין עכברים בריאים לאחר ביטוי, אך מכיוון שאורך חייהם היה רק 55 ימים בתנאי ניסוי, המדענים לא הצליחו להסיק מסקנות לגבי היעילות ארוכת הטווח של טיפול גנטי תוך ורידי.

הניסוי של וואדינגטון היה המורכב ביותר עד כה, במהלכו בוצע טיפול גנטי עוברי בבעלי חיים. כיום הצוות עובד עם התאגיד אפולו תרפיוטיקה, שהפגישה בין שלוש אוניברסיטאות בריטיות ושלוש חברות תרופות גדולות. וואדינגטון ועמיתיו חותרים אחר מטרה חדשה: הפעם הם מתמודדים עם האתגר של השגת נתונים פרה-קליניים ופוטנציאל בדיקת טיפולים בבני אדם. ובעוד הספקנים חושבים על ההיקף של טיפול גנטי עוברי בבני אדם, שניתן לצמצם במידה ניכרת על ידי אי הכללת מחלת גושה בבדיקות טרום לידתיות, הצוות של וואדינגטון מוכן לעתיד. עתיד שבו ילדים עם מחלת גושה, דושן, SMA ועוד רבים אחרים נדירים, אבל היום, אבוי, מחלות חשוכות מרפא יכולות להחלים.

סִפְרוּת

12 שיטות בתמונות: הנדסה גנטית. חלק ב': כלים וטכניקות;

ג'ין ת'ר

Soyoung C. Gilchrist, Martin P. Ontell, Stefan Kochanek, Paula R. Clemens. (2002). תגובה חיסונית לדיסטרופין באורך מלא המועבר לשריר Dmd על ידי וקטור אדנוויראלי בעל קיבולת גבוהה. טיפול מולקולרי. 6 , 359-368;
הת'ר א. הרטמן, אייברי סי רוסידיס, וויליאם ה. פרנטאו. (2018). ברחם תרפיה גנטית ועריכת גנום. נציג תאי גזע של Curr. 4 , 52-60;
אנה ל. דיוויד, דונלד פיבלס. (2008). . שיטות עבודה ומחקר קליני מיילדות וגינקולוגיה. 22 , 203-218;
סיכום מחזיתות הריפוי הגנטי. אסטרטגיה חדשה לנטרול המופיליה;
צ'רלס קוטל. (2008). למה לטרוח?: האם טיפול גנטי ברחם שווה את המאמץ? . טיפול מולקולרי. 16 , 219-220;
מייק תמיס, סיימון נ. וואדינגטון, מנפרד שמידט, כריסטוף פון קאלה, יואהה וואנג ועוד. אל. (2005). אונקוגנזה לאחר מתן וקטור לטיפול גנטי לנטי-ויראלי ללא פרימט לעכברים עובריים ויילודים. טיפול מולקולרי. 12 , 763-771;
האגודה האירופית לתרפיה גנטית (ESGT) הודעה לעיתונות, ברנד גנסבאכר. (2003). דיווח על אירוע לוואי חמור שני בניסוי קליני של ריפוי גנטי למחסור חיסוני משולב חמור (X-SCID) הקשור ל-X. J. Gene Med.. 5 , 261-262;
Giulia Massaro, Citra N. Z. Mattar, Andrew M. S. Wong, Ernestas Sirka, Suzanne M. K. Buckley, et. אל. (2018). טיפול גנטי עוברי למחלה נוירודגנרטיבית של תינוקות. נאט מד. 24 , 1317-1323.

טיפול גנטי

ברנוב ו.ס. ריפוי גנטי - רפואה של המאה ה-XXI // Soros Educational Journal. - 1999. - מס' 3. - ש' 63-68. (אוניברסיטת סנט פטרסבורג)

<http:// אפונין-59- ביו. אֲנָשִׁים. he>

<http:// אפונין-59- סליקס. אֲנָשִׁים. he>

מבוא

ההישגים המכריעים של הביולוגיה המולקולרית והגנטיקה בחקר המבנה העדין של גנים אוקריוטיים, מיפוים על כרומוזומים של יונקים ומעל לכל, ההצלחה המרשימה של פרויקט הגנום האנושי בזיהוי ושיבוט של גנים שהמוטציות שלהם מובילות ל מחלות תורשתיות רבות, ולבסוף, הצמיחה הסוערת בתחום הביוטכנולוגיה וההנדסה הגנטית היו התנאים המוקדמים ההכרחיים לניסיונות הראשונים לטפל במחלות מונוגניות מניסויים בבעלי חיים ומבניות תיאורטיות כבר ב-1989.

מהו ריפוי גנטי? האם זה אומר טיפול בגן כתרופה, או רק טיפול באמצעות תיקון הגן שעבר מוטציה? שאלות אלו ועוד רבות אחרות עולות בהכרח כאשר בוחנים כיוון כה מבטיח, ואולי מסוכן לאנושות, של רפואה במאה ה-21 הקרובה כריפוי גנטי.

תקציר היסטורי קצר

ניתן להגדיר ריפוי גנטי בשלב הנוכחי כטיפול במחלות תורשתיות, מולטי-פקטוריאליות ולא תורשתיות (זיהומיות) על ידי החדרת גנים לתאים של חולים במטרה לכוון שינויים מכוונים בפגמים בגנים או לתת לתאים תפקודים חדשים. הניסויים הקליניים הראשונים של שיטות ריפוי גנטי בוצעו ב-22 במאי 1989 במטרה לסמן גנטי של לימפוציטים חודרים לגידול במקרה של מלנומה מתקדמת. המחלה התורשתית המונוגנית הראשונה שעבורה יושמו שיטות ריפוי גנטי הייתה כשל חיסוני תורשתי שנגרם על ידי מוטציה בגן אדנוזין דמינאז. (מוֹדָעָה). ב-14 בספטמבר 1990, בבת'סדה (ארה"ב), הושתלה ילדה בת ארבע שסבלה ממחלה נדירה זו (1:100,000) בלימפוציטים משלה, שעברו טרנספורמציה מחוץ לגוף. (לְשֶׁעָבַר vivo) גנום מוֹדָעָה (גֵן מוֹדָעָה + גֵן peo +וקטור רטרו-ויראלי). ההשפעה הטיפולית נצפתה במשך מספר חודשים, ולאחר מכן ההליך חזר על עצמו במרווח של 3...5 חודשים. במהלך שלוש שנות הטיפול, בוצעו בסך הכל 23 עירויים תוך ורידיים. מוֹדָעָה- לימפוציטים T שעברו טרנספורמציה ללא השפעות שליליות נראות לעין. כתוצאה מהטיפול, מצבה של המטופלת השתפר עד כדי כך שהיא יכלה לנהל חיים נורמליים ולא לחשוש מזיהומים בשוגג. הטיפול בחולה השני במחלה זו התברר כמוצלח באותה מידה. נכון לעכשיו, ניסויים קליניים של ריפוי גנטי למחלה זו נערכים באיטליה, צרפת, בריטניה ויפן.

בשנת 1997, מספר הפרוטוקולים שאושרו לניסויים קליניים היה כבר 175, יותר מ-2000 חולים לקחו חלק ביישום שלהם. רוב הפרויקטים הללו (כ-80%) נוגעים לטיפול במחלות אונקולוגיות, וכן בזיהום ב-HIV (איידס). יחד עם זאת, במחקר מודרני על ריפוי גנטי, יש לקחת בחשבון שההשלכות של מניפולציה של גנים או DNA רקומביננטי ב vivoלא למדו מספיק.

במדינות בעלות רמת המחקר המתקדמת ביותר בתחום זה, במיוחד בארצות הברית, פרוטוקולים רפואיים המשתמשים ברצפי DNA של חוש כפופים לבדיקה חובה בוועדות ובוועדות הרלוונטיות. בארה"ב, אלו הן הוועדה המייעצת ל-DNA רקומביננטי (RAC) ומנהל המזון והתרופות (FDA), עם אישור פרויקט חובה לאחר מכן על ידי מנהל המכונים הלאומיים לבריאות (המכונים הלאומיים לבריאות). באירופה, פרוטוקולים כאלה נערכים ומאושרים בהתאם להמלצות של קבוצת העבודה האירופית להעברת גנים וטיפול בבני אדם.

שיטות להעברה גנטית בתרפיה גנטית

התנאי המכריע לטיפול גנטי מוצלח הוא הבטחת מסירה יעילה, כלומר טרנספקציה (במובן הרחב) או התמרה (בעת שימוש בוקטורים ויראליים) של גן זר לתוך תאי מטרה, הבטחת תפקודו לטווח ארוך בתאים אלו ויצירת תנאים לפעולה מלאה של הגן (ביטויו). ההעברה יכולה להתבצע באמצעות DNA טהור ("עירום" - עירום), מסומם (מוטבע) בפלסמיד המתאים, או DNA מורכב (DNA פלסמיד המחובר למלחים, חלבונים (טרנספרין), פולימרים אורגניים (DEAE-dextran, polylysine, ליפוזומים או חלקיקי זהב), או DNA בהרכב של חלקיקים ויראליים, שנשללה בעבר מהיכולת לשכפל.

השיטות העיקריות להעברת גנים זרים לתאים מחולקות לכימיקלים, פיזיקליים וביולוגיים. יעילות ההעברה ויכולת האינטגרציה של DNA זר מתמר בשיטות שונות של טרנספקציה לתאי מטרה של DNA אינה זהה. רק וקטורים ויראליים או מבנים גנטיים המכילים רצפים ויראליים מסוגלים להתמרה פעילה, ובמקרים מסוימים, ביטוי ארוך טווח של גנים זרים. מתוך יותר מ-175 פרוטוקולי ניסויים קליניים של ריפוי גנטי שכבר אושרו, יותר מ-120 כרוכים בהמרה ויראלית, וכ-100 מהם מסתמכים על וקטורים רטרו-ויראליים.

סקירת הנתונים מובילה למסקנה שלמרות המאמצים של מעבדות רבות בעולם, כולן כבר ידועות ונבדקו ב vivoו ב מבחנהמערכות וקטוריות רחוקות מלהיות מושלמות. אם הבעיה של מסירת DNA זר ב מבחנהנפתרה למעשה, והמשלוח שלו לתאי מטרה של רקמות שונות ב vivoנפתר בהצלחה (בעיקר על ידי יצירת מבנים הנושאים חלבונים קולטן, כולל אנטיגנים ספציפיים לרקמות מסוימות), ואז מאפיינים אחרים של מערכות וקטוריות קיימות - יציבות אינטגרציה, ביטוי מווסת, בטיחות - עדיין זקוקים לשיפורים רציניים.

קודם כל, זה נוגע ליציבות האינטגרציה. עד כה, השתלבות בגנום הושגה רק באמצעות וקטורים רטרו-ויראליים או הקשורים לאדנו. ניתן להגביר את היעילות של אינטגרציה יציבה על ידי שיפור מבני גנים כגון מערכות מתווכות קולטן, או על ידי יצירת וקטורים אפיזומאליים יציבים מספיק (כלומר, מבני DNA המסוגלים להתמיד לאורך זמן בתוך גרעינים).

העברת גנים בתיווך קולטן היא כדלקמן. רצף ה-DNA של הגן הרצוי מחובר לחומר ספציפי (למשל גליקופרוטאין) שיש לו זיקה גבוהה לקולטן ממברנה ספציפי של התא שעבר טרנספורמציה (למשל, הפטוציט). הקומפלקס המתקבל משולב עם אדנוווירוס, המבטיח את חדירת מבנה הגן לגרעין התא. וקטור משולב כזה מספק מסירה ממוקדת יעילה של הגן לתאים ספציפיים.

לאחרונה ניתנה תשומת לב מיוחדת ליצירת וקטורים המבוססים על כרומוזומים מלאכותיים של יונקים (Mammalian Artificial Chromosomes). בשל נוכחותם של האלמנטים המבניים הבסיסיים של כרומוזומים רגילים, מיני כרומוזומים כאלה נשמרים בתאים לאורך זמן ומסוגלים לשאת גנים בגודל מלא (גנומי) ואת האלמנטים הרגולטוריים הטבעיים שלהם, הנחוצים לתפקוד נכון של הגן, ברקמה הנכונה ובזמן הנכון.

עקרונות של תרפיה גנטית

בהתאם לשיטה להחדרת DNA אקסוגני לגנום של המטופל, ניתן לבצע טיפול גנטי בתרבית תאים (ex vivo),או ישירות בגוף (ב vivo). תרפיה או תרפיה גנטית סלולרית ex vivoכולל בידוד וטיפוח של סוגי תאים ספציפיים של המטופל ב מבחנה, החדרת גנים זרים לתוכם (למשל, הגברת התגובה החיסונית של הגוף), בחירת שיבוטים של תאים שעברו טרנספוגציה והזרקה מחדש שלהם (החדרה) לאותו חולה. גישה זו משמשת כיום ברוב תוכניות הריפוי הגנטי המאושרות לניסויים קליניים.

טיפול גנטי ב vivoמבוסס על החדרה ישירה של רצפי DNA משובטים וארוזים ספציפית לרקמות הספציפיות של המטופל. מבטיח במיוחד לטיפול במחלות גנים in vivoמוצגת הכנסת גנים באמצעות תרסיס או חיסונים בהזרקה. טיפול גנטי אירוסול פותח, ככלל, לטיפול במחלות ריאות (סיסטיק פיברוזיס, סרטן ריאות).

לפיתוח תוכנית ריפוי גנטי מקדימים ניתוח יסודי של ביטוי ספציפי לרקמות של הגן המתאים, זיהוי הפגם הביוכימי העיקרי, לימוד המבנה, התפקוד וההפצה התוך תאית של תוצר החלבון שלו, וכן ניתוח ביוכימי של התהליך הפתולוגי. כל הנתונים הללו נלקחים בחשבון בעת עריכת הפרוטוקול הרפואי המתאים. אישור ההליך לתיקון גנים של מחלה תורשתית מתבצע על תרביות תאים ראשוניות של החולה, בהן גן זה פעיל באופן תפקודי בדרך כלל. באמצעות מודלים תאיים אלה, מוערכת היעילות של מערכת העברת ה-DNA האקסוגנית שנבחרה, הביטוי של המבנה הגנטי שהוכנס נקבע, האינטראקציה שלו עם גנום התא מנותחת ושיטות תיקון מעובדות ברמה הביוכימית.

באמצעות תרביות תאים, ניתן לפתח מערכת לאספקה ממוקדת של DNA רקומביננטי, אך ניתן לבדוק את מהימנותה של מערכת זו רק ברמת האורגניזם כולו. לכן, תשומת לב כזו בתוכניות ריפוי גנטי ניתנת לניסויים. ב vivo על מודלים טבעיים או מלאכותיים של המחלות התורשתיות המתאימות בבעלי חיים. תיקון מוצלח של פגמים גנטיים בבעלי חיים כאלה והיעדר תופעות לוואי בלתי רצויות של ריפוי גנטי הם התנאים המוקדמים החשובים ביותר לאישור ניסויים קליניים.

לפיכך, הסכימה הסטנדרטית לתיקון גנים של פגם תורשתי כוללת סדרה של שלבים עוקבים. זה מתחיל ביצירת מבנה גנטי מתפקד במלואו (ניתן לביטוי) המכיל את הסנס (קידוד החלבון) והחלקים הרגולטוריים של הגן. בשלב הבא נפתרת הבעיה של וקטור המספק מסירה יעילה ובמידת האפשר ממוקדת של הגן לתאי המטרה. לאחר מכן, מתבצעת transfection (העברה של המבנה המתקבל) לתאי מטרה, יעילות ההעברה, מידת התיקון של הפגם הביוכימי העיקרי בתנאי תרבית תאים מוערכים. (ב מבחנה) והכי חשוב, ב vivoעל מודלים ביולוגיים של בעלי חיים. רק אז ניתן להתחיל את תוכנית הניסויים הקליניים.

גנותרפיה של מחלות תורשתיות מונוגניות

הצלחת הניסויים הקליניים הראשונים היוותה גירוי רב עוצמה להאצת הפיתוח של שיטות ריפוי גנטי חדשות ביחס למחלות תורשתיות אחרות. להלן רשימה של מחלות שגישת ריפוי גנטי אפשרית ביסודה לגביהן, שתיקון גנים צפוי להתבצע בעתיד הנראה לעין, וכן מחלות שלגביהן כבר קיימים פרוטוקולים מאושרים רשמית ושנמצאות בשלבים שונים. של ניסויים קליניים.

שולחן 1- מחלות תורשתיות, שתיקון הג'נו-תיקון שלהן נמצא בשלב של ניסויים קליניים (CT), פיתוח ניסוי (ER) והוא אפשרי ביסודו (PV)

מַחֲלָה	גן פגום	תאי מטרה	שלב
כשל חיסוני	אדנוזין דמינאז	לימפוציטים
כשל חיסוני	פורין נוקלאוזיד פוספורילאז	לימפוציטים
היפרכולסטרולמיה משפחתית	קולטן LDL	הפטוציטים
המופיליה ב	פקטור IX	פיברובלסטים
המופיליה א	פקטור VIII	מיובלסטים, פיברובלסטים
מחלת גושה (ספינגוליפידוזיס)	p-Glucocerebrosidase	מקרופאגים, תאי גזע
מחלת צייד	Iduronate sulfatase	מקרופאגים, תאי גזע
תסמונת הרלר	ל-אידורונידאז	מקרופאגים, תאי גזע
נַפַּחַת	α -1 - אנטיטריפסין	לימפוציטים
סיסטיק פיברוזיס	ווסת SG-טרנסממברנה	אפיתל הסימפונות
פנילקטונוריה	פנילאלנין הידרוקסילאז	הפטוציטים
היפרמונמיה	Ornithine transcarbamylase	הפטוציטים
ציטרולינמיה	סינתזה של ארגינוסוצ'ינט	הפטוציטים
ניוון שרירים דושן	הַפרָעַת הַתְזוּנָה	מיובלסטים, מיופיברילים
תלסמיה	β-גלובין	אריתרובלסטים
אנמיה חרמשית	β-גלובין	אריתרובלסטים
תסמונת מצוקה נשימתית	חלבון פעיל שטח B	אפיתל הסימפונות
גרנולומטוזיס כרוני	NADPH אוקסידאז	גרנולוציטים
מחלת אלצהיימר	חלבון מבשר β-עמילואיד (AAP)	תאי עצבים
מחלת פרקינסון	טירוזין הידרוקסילאז	מיובלסטים, פיברובלסטים, תאי עצב
לקודיסטרופיה מטאכרומטית	ארילסולפטאז א	תאי גזע בדם, תאי עצב
תסמונת לש-ניהאן	Hypoxanthine phosphoribosyltransferase	תאי עצבים

גנותרפיה למחלות לא תורשתיות

במקביל להתפתחות המחקר בתחום תיקון הגנים של פגמים תורשתיים, הצליח גם החיפוש אחר שיטות שימוש טיפולי ברצפי DNA חושי לטיפול במחלות לא תורשתיות ובעיקר גידולים ממאירים וזיהומים ויראליים. חשוב שדווקא בתחומי הפתולוגיה הללו מתבצע חיפוש אחר דרכים לתיקון גנים באופן אינטנסיבי במיוחד, ומספר פרוטוקולי הניסויים הקליניים שכבר מאושרים גדול פי כמה ממספרם של אלה לטיפול במחלות מונוגניות.

הגישות המתודולוגיות העיקריות לטיפול גנטי של גידולים שונים שפותחו וכבר נמצאים בשימוש נרחב מפורטות להלן. רבות מהגישות הללו ישימות גם למחלות זיהומיות חמורות ביותר, כגון זיהום HIV (איידס).

התוצאות של הניסויים הקליניים הראשונים של גישות אלו היו מעודדות ביותר, במיוחד בטיפול במחלות ניווניות ואונקולוגיות של מערכת העצבים.

שולחן 2 -גישות עיקריות בתיקון גנים של מחלות אונקולוגיות

	הציג גנים
הגברת הפעילות החיסונית של הגידול	גנים לאנטיגנים זרים, ציטוקינים
שינוי גנטי של תאי מערכת החיסון	גנים של ציטוקינים, קוסטימולטורים
החדרת גנים של "רגישות" או גנים של "התאבדות".	גנים HSV thymidine kinase, ציטוזין דמינאז
חסימת ביטוי אונקוגני	Antisense Ki-ras mRNA, גנים של נוגדנים תוך תאיים
החדרת גנים מדכאי גידול
הגנה על תאים נורמליים מפני כימותרפיה	גנים עמידות לתרופות מסוג 1
אינדוקציה של סינתזה של חומרים אנטי גידולים על ידי תאים נורמליים	גנים של אינטרלוקין-2, אינטרפרון
ייצור חיסונים רקומביננטיים נגד סרטן	חיסונים מסוג BCG המבטאים אנטיגן גידול
הגנת רדיו מקומית של רקמות תקינות בעזרת נוגדי חמצון	גנים טרנספראז, גלוטתיון סינתטאז

כמה סוגיות אתיות וחברתיות

טיפול גנטי

הופעתן של טכנולוגיות חדשות ביסודו המאפשרות לבצע מניפולציה אקטיבית של גנים ושבריהם ולהבטיח מסירה ממוקדת של בלוקים חדשים של מידע גנטי לאזורים מוגדרים בגנום הפכה לאירוע חשוב בביולוגיה וברפואה.

אפילו עכשיו, ברמת הידע הנוכחית על הגנום האנושי, שינויים כאלה הם אפשריים תיאורטית כדי לשפר כמה פרמטרים פיזיים (לדוגמה, גובה), נפשיים ואינטלקטואליים. לפיכך, מדע האדם המודרני, בשלב התפתחותו החדש, חזר לרעיון של שיפור הגזע האנושי, שפעם הונח על ידי הגנטיקאי האנגלי המצטיין פ. גלטון ופותח על ידי תלמידיו וחסידיו בבריטניה (K. Pearson , L. Penrose, J. Haldane) , ברוסיה (N.K. Koltsov, F.P. Filipchenko), בארה"ב (G. Möller). מהלך ההיסטוריה הנוסף, כידוע, הכפיש לחלוטין את עצם הרעיון של שיפור המין האנושי. עם זאת, האומניפוטנציה הקרובה של האדם על הגנום שלו מאלצת אותנו לחזור לנושא זה שוב ושוב, מה שהופך אותו לנושא לדיונים ערים מתמידים בעיתונות הרחבה והמדעית. אין ספק שהחששות הראשוניים הקשורים להנדסה גנטית אנושית היו בלתי מוצדקים. השימוש בריפוי גנטי לטיפול במחלות רבות כבר הוכר. המגבלה היחידה והחובה, שנשארת תקפה גם בתנאים מודרניים, היא שכל אמצעי הריפוי הגנטי צריכים להיות מכוונים רק לחולה ספציפי ונוגע אך ורק לתאים הסומטיים שלו.

רמת הידע הנוכחית אינה מאפשרת תיקון של פגמים בגנים ברמת תאי נבט ותאי עוברים אנושיים טרום השרשה מוקדמים עקב הסכנה האמיתית של סתימת מאגר הגנים במבני גנים מלאכותיים לא רצויים או החדרת מוטציות עם השלכות בלתי צפויות. לעתיד האנושות. במקביל, בספרות המדעית נשמעות יותר ויותר בהתמדה קריאות לחידוש הדיון בדבר כדאיות תיקון גנים של תאי נבט ותאי נבט אנושיים.

אלה הם חלק מהנושאים שצריך להתייחס אליהם בדיון הרחב יותר על ריפוי גנטי המוצע על ידי גנטיקאים.

1. האם ריפוי גנטי יוכל בעתיד לספק תיקון גנטי מלא כזה שלא יהווה איום על הצאצאים?

2. עד כמה התועלת והנחיצות של הליך ריפוי גנטי עבור זוג נשוי אחד יעלו על הסיכון של התערבות כזו עבור האנושות כולה?

3. עד כמה נהלים אלו יהיו מוצדקים על רקע אכלוס יתר הקרוב של כדור הארץ?

4. כיצד יתחברו אמצעי הנדסה גנטית על בני אדם לבעיות ההומאוסטזיס של החברה והביוספירה?

לפיכך, המהפכה הגנטית, שהאפתיאוזה שלה הייתה ריפוי גנטי, מציעה לא רק דרכים אמיתיות לטיפול במחלות תורשתיות קשות ולא תורשתיות, אלא גם, בהתפתחותה המהירה, מציבה בעיות חדשות לחברה, שפתרונן נדרש בדחיפות. בעתיד הקרוב.

14943 0

קביעת הלוקליזציה והרצף של הגן שהמוטציות שלו גורמות למחלות ספציפיות, כמו גם המוטציה עצמה והשיטות המודרניות לבדיקתה, מאפשרים לאבחן את המחלה בתקופה הניאו-אף לפני הלידה של התפתחות האורגניזם. הדבר מאפשר למתן את הביטוי של פגם גנטי בעזרת טיפול תרופתי, דיאטה, עירוי דם וכו'.

עם זאת, גישה זו אינה מובילה לתיקון הפגם עצמו, וככלל לא ניתן לרפא מחלות תורשתיות. המצב מסתבך עוד יותר בשל העובדה שלמוטציה של גן אחד יכולות להיות מגוון השלכות על הגוף. אם מוטציה גנטית גורמת לשינויים בפעילות האנזים שהוא מקודד, אזי הדבר עלול להוביל להצטברות של מצע רעיל או להיפך, למחסור בתרכובת הנחוצה לתפקוד תקין של התא.

דוגמה ידועה למחלה כזו היא פנילקטונוריה. היא נגרמת על ידי מוטציה בגן לאנזים הכבד phenylalanine dehydroxylase, אשר מזרז את ההמרה של פנילאלנין לטירוזין. כתוצאה מכך עולה רמת הפנילאלנין האנדוגני בדם, מה שגורם להיווצרות לא תקינה של מעטפת המיאלין סביב האקסונים של תאי העצב של מערכת העצבים המרכזית וכתוצאה מכך לפיגור שכלי חמור.

אם המוטציה משפיעה על גן החלבון המבני, אז זה יכול להוביל להפרעות חמורות ברמת התאים, הרקמות או האיברים. דוגמה למחלה כזו היא סיסטיק פיברוזיס.

מחיקה בגן המקודד לחלבון הנקרא טרנספורטר סיסטיק פיברוזיס מובילה לסינתזה של חלבון פגום (היעדר פנילאלנין 508) ולפגיעה בהובלה של יוני כלוריד דרך ממברנות התא. אחת ההשפעות המזיקות ביותר של זה היא שהריר שמצפת ומגן על הריאות הופך לעבה בצורה חריגה. זה מקשה על הגישה לתאי הריאות ותורם להצטברות של מיקרואורגניזמים מזיקים. התאים המצפים את דרכי הנשימה של הריאות מתים ומוחלפים ברקמת צלקת סיבית (ומכאן שם המחלה). כתוצאה מכך, החולה מת מכשל נשימתי.

מחלות תורשתיות נבדלות בביטויים קליניים מורכבים, והטיפול המסורתי בהן הוא בעיקר סימפטומטי: דיאטה נטולת אלנין נקבעת לטיפול בפנילקטונוריה, חלבונים פגומים מוחלפים במתן תוך ורידי תפקודי ומושתלים מח עצם או איברים אחרים כדי לפצות על כך. פונקציות שאבדו. כל האמצעים הללו, ככלל, אינם יעילים, יקרים, ארוכי טווח, ורק חולים בודדים חיים עד זקנה. לכן, הפיתוח של סוגי טיפול חדשים ביסודו חשובים מאוד.

טיפול גנטי

ריפוי גנטי הוא הנדסה גנטית של תאים סומטיים אנושיים כדי לתקן את הפגם הגנטי הגורם למחלה. תיקון של מחלה ספציפית מתבצע על ידי החדרת גנים מבוטאים נורמליים לתאים סומטיים פגומים. עד שנות ה-80, עם התפתחותן של שיטות לחילוץ גנים בודדים ויצירת וקטורי ביטוי אוקריוטיים, עם הפיכת ניסויי העברת גנים בעכברים לשגרה, הפכו הסיכויים לעריכת גנים ממשיים.

בשנת 1990, בארה"ב, עשה ד"ר וו. פרנץ' אנדרסון את הניסיון הראשון בריפוי גנטי לטיפול בכשל חיסוני משולב חמור (SCID) בילדה בת שלוש, אשנטי דה סילבה. מחלה זו נגרמת על ידי מוטציה בגן המקודד לאדנוזאנדילאז (ADA). מחסור באנזים זה תורם להצטברות של אדנוזין ודאוקסיאדנוזין בדם, שהשפעתם הרעילה מביאה למוות של לימפוציטים B ו-T בדם היקפי וכתוצאה מכך למחסור חיסוני.

ילדים עם מחלה כזו חייבים להיות מוגנים מכל זיהומים (לשמור בתאים סטריליים מיוחדים), שכן כל מחלה עלולה להיות קטלנית. ארבע שנים לאחר תחילת הטיפול, הילדה הראתה ביטוי של ADA בתפקוד תקין והקלה בתסמיני SCID, מה שאפשר לה לעזוב את החדר הסטרילי ולחיות חיים נורמליים.

לפיכך, הוכחה האפשרות הבסיסית של טיפול גנטי מוצלח בתאים סומטיים. מאז שנות ה-90. ריפוי גנטי נבדק למספר מחלות גנטיות, כולל מחלות קשות כמו המופיליה, איידס, סוגים שונים של ניאופלזמות ממאירות, סיסטיק פיברוזיס ועוד. נכון לעכשיו ניתן לרפא כ-10 מחלות אנושיות באמצעות טרנסגנזה.

המגוון של מחלות גנטיות קבע מראש את התפתחותן של גישות רבות לריפוי גנטי. במקרה זה נפתרות 2 בעיות עיקריות: אמצעי להעברת גן טיפולי; שיטה למתן מסירה ממוקדת לתאים המיועדים לתיקון. עד כה, ניתן לחלק את כל הגישות לטיפול גנטי של תאים סומטיים לשתי קטגוריות: טיפול ex vivo ו-in vivo (איור 3.15).

אורז. 3.15. תכנית של טיפול גנטי ex vivo (א) ו-in vivo (א)

טיפול גנטי Ex vivo כולל תיקון גנטי של תאים פגומים מחוץ לגוף, ולאחר מכן החזרת תאים הפועלים כרגיל לגוף.

טיפול גנטי In vivo כולל מסירה של גן טיפולי ישירות לתוך התאים של רקמת חולה ספציפית. הבה נשקול גישות אלה ביתר פירוט.

טיפול גנטי Ex vivo כולל את השלבים הבאים:
1) השגת תאים פגומים של המטופל וטיפוחם;
2) העברה של הגן הרצוי לתאים מבודדים על ידי טרנספקציה של מבנה גן טיפולי;
3) בחירה וצמיחה של תאים מתוקנים גנטית;
4) השתלה או עירוי של תאים אלו למטופל.

השימוש בתאים של החולה עצמו מבטיח שברגע שהם מוחזרים, החולה לא מפתח תגובה חיסונית. הליך העברת מבנה הגנים חייב להיות יעיל והגן התקין חייב להישמר ביציבות ולהתבטא ברציפות.

האמצעים להעברת גנים שנוצרו על ידי הטבע עצמו הם וירוסים. על מנת להשיג וקטורים יעילים להעברת גנים, משתמשים בעיקר בשתי קבוצות של וירוסים - אדנו-וירוסים ורטרו-וירוסים (איור 3.16). בטיפול גנטי, משתמשים בגרסאות של וירוסים מנוטרלים גנטית.

אורז. 3.16. וירוסים המשמשים ליצירת וקטורים טיפוליים

שקול את המכשיר והשימוש במבנים המבוססים על וירוסי רטרו. נזכיר שהגנום הרטרו-וירוס מיוצג על ידי שתי מולקולות RNA חד-גדיליות זהות, שכל אחת מהן מורכבת משישה אזורים: שתי חזרות ארוכות (LTR) בקצוות 5' ו-3', הרצף הלא-מקודד *P+ הדרוש לאריזה ה-RNA לתוך חלקיק ויראלי, ושלושה אזורים המקודדים את החלבון המבני של הקפסיד הפנימי (gag), transcriptase הפוכה (pol) וחלבון המעטפת (env) (איור 3.17, א).

אורז. 3.17. מפה גנטית של רטרו-וירוס טיפוסי (א) ומפה וקטורית רטרו-ויראלית (א)

נזכיר כי מחזור החיים של רטרו-וירוס כולל את השלבים הבאים:
1. זיהום של תאי מטרה.
2. סינתזה של עותק DNA של הגנום תוך שימוש ב-reverse transcriptase משלו.
3. הובלה של DNA ויראלי לתוך הגרעין.
4. שילוב של DNA ויראלי בכרומוזום של התא המארח.
5. שעתוק של mRNA מ-DNA ויראלי בשליטה של פרומוטור חזק הממוקם באזור 5'-LTR.
6. תרגום של חלבוני Gag, Pol ו-Env.
7. יצירת קפסיד ויראלי ואריזה של שתי שרשראות RNA ומולקולות טרנסקריפטאז הפוך.
8. שחרור נגיפים מהתא.

עם קבלת וקטור רטרו-ויראלי, ה-DNA באורך מלא של הרטרו-וירוס מוחדר לפלסמיד, מרבית הגן gag והגנים pol ו-env מוסרים, ובמקומם גן T "הטיפולי" ובמידת הצורך , מוכנסים הגן Rg סלקטיבי לסמן עם מקדם משלו (איור 3.17, ב). שעתוק הגן T יהיה מבוקר ע"י אותו פרומוטור חזק הממוקם באזור 5'-LTR. בהתבסס על סכימה זו נוצרו וקטורים רטרו-ויראליים שונים וגודל החדרת ה-DNA המרבי של כ-8 kb.

המבנה המתקבל כך יכול לשמש בעצמו לצורך טרנספורמציה, אך יעילותו והשילוב שלאחר מכן בגנום התא המארח נמוכים ביותר. לכן פותחה שיטה לאריזת ה-RNA באורך מלא של וקטור רטרו-ויראלי לחלקיקים ויראליים שלמים, החודרים לתא בתדירות גבוהה ומובטחים להשתלב בגנום המארח. לשם כך, נוצר קו תאים "אריזה". בשני חלקים שונים של הכרומוזומים של תאים אלה, נתפרים גנים רטרו-ויראליים gag ו-pol-env, נטולי יכולת האריזה בשל היעדר רצף + (84*+) (איור 3.18).

אורז. 3.18. תכנית להשגת וקטור ויראלי ארוז

כלומר, שני השברים הללו מתומללים, אך נוצרים קפסידים ריקים נטולי RNA. כאשר RNA וקטור ויראלי עובר טרנספקציה לתאים כאלה, הוא משולב ב-DNA כרומוזומלי ומשועתק ליצירת RNA רטרו-וירוס באורך מלא, ובתנאים כאלה, רק RNA וקטור נארז בקפסידים (רק הוא מכיל רצף +). החלקיקים הנגיפים השלמים המתקבלים משמשים כדי להעביר ביעילות את הווקטור הרטרוויראלי לתאי המטרה.

רטרו-וירוסים מדביקים רק תאים המתחלקים במהירות. לצורך העברת גנים, הם מטופלים בחלקיקי וקטור רטרו-ויראלי ארוזים מטוהרים או בתרבית משותפת עם קו תאים שמייצר אותם, ולאחר מכן נבחרים להפריד בין תאי מטרה ותאי אריזה.

התאים המומרדים נבדקים בקפידה לגבי רמת הסינתזה של תוצר הגן הטיפולי, היעדר רטרו-וירוסים בעלי יכולת שכפול, היעדר שינויים ביכולת התאים לגדול או לתפקד.

המתאימים ביותר לטיפול גנטי הם תאי מח עצם. זאת בשל הימצאותם של תאי גזע עובריים טוטיפוטנטיים, שיכולים להתרבות ולהתמיין לסוגים שונים של תאים - לימפוציטים מסוג B ו-T, מקרופאגים, אריתרוציטים, טסיות דם ואוסטאוקלסטים. תאים אלו הם המשמשים לטיפול במספר מחלות תורשתיות, ביניהן המחסור החיסוני המשולב החמור שהוזכר כבר, מחלת גושה, אנמיה חרמשית, תלסמיה, אוסטאופורוזיס וכו'.

בנוסף לתאי גזע של מח עצם טוטיפוטנטיים, שקשה לבודד ולהתרבות, משתמשים בתאי גזע מדם טבורי (השימוש המועדף לריפוי גנטי ביילוד), וכן בתאי כבד - הפטוציטים - לטיפול בהיפרכולסטרולמיה.

בטיפול גנטי in vivo, חשוב במיוחד להבטיח את מסירת הגן הטיפולי לתאים פגומים. משלוח ממוקד כזה יכול להינתן על ידי וקטורים מותאמים המבוססים על וירוסים המסוגלים להדביק סוגים ספציפיים של תאים. שקול את הגישה שפותחה לטיפול בסיסטיק פיברוזיס שכבר הוזכרה לעיל. מכיוון שהריאות הן חלל פתוח, קל יחסית להעביר אליהן גנים טיפוליים. וריאנט משובט של הגן הבריא הוכנס לאדנווירוס מומת (איור 3.19). הספציפיות של סוג זה של וירוס היא שהוא מדביק את רירית הריאות, וגורם להצטננות.

אורז. 3.19. תכנית להשגת וקטור המבוסס על אדנוווירוס

הנגיף שנבנה כך נבדק על ידי ריסוסו לאף ולריאות של חיות ניסוי ולאחר מכן לחולים אנושיים. במקרים מסוימים, נצפתה החדרה וביטוי של גן בריא, ונצפה שיקום של תחבורה תקינה של יוני כלוריד. ייתכן שגישה זו (מתן גן תקין באמצעות תרסיסים לאף) תהיה בשימוש נרחב בעתיד הקרוב לטיפול בסימפטומים של סיסטיק פיברוזיס בריאות.

בנוסף לרטרו ואדנו-וירוסים, סוגים אחרים של וירוסים, כמו נגיף ההרפס סימפלקס, משמשים גם הם בניסויים בריפוי גנטי. תכונה של נגיף ה-DNA הדו-גדילי הזה (152 קילובייט) הוא יכולתו להדביק נוירונים ספציפית. ישנן מחלות גנטיות רבות הפוגעות במערכת העצבים המרכזית וההיקפית - גידולים, הפרעות מטבוליות, מחלות ניווניות (מחלת אלצהיימר, פרקינסון).

וירוס הרפס סימפלקס מסוג I (HSV) הוא וקטור מתאים מאוד לטיפול במחלות כאלה. הקפסיד של נגיף זה מתמזג עם קרום הנוירון וה-DNA שלו מועבר לגרעין. הוצעו מספר שיטות להעברת גן טיפולי באמצעות וקטורי HSV ובוצעו בדיקות מוצלחות בחיות ניסוי.

לוקטורים ויראליים יש כמה חסרונות: עלות גבוהה, יכולת שיבוט מוגבלת ותגובה דלקתית אפשרית. לכן, בשנת 1999, כתוצאה מתגובה חיסונית חזקה במיוחד להחדרת וקטור אדנוויראלי, מת מתנדב בן 18 שהשתתף בניסויי התרופות. בשנת 2002, שני ילדים בצרפת פיתחו מצב דמוי לוקמיה במהלך טיפול בכשל חיסוני (על ידי החדרת גנים טיפוליים לתאי גזע באמצעות רטרו-וירוסים).

לכן, מערכות מסירת גנים לא-ויראליות מפותחות. הדרך הפשוטה והבלתי יעילה ביותר היא הזרקת DNA פלסמיד לרקמות. הגישה השנייה היא הפצצת רקמות במיקרו-חלקיקי זהב (1-3 מיקרומטר) המצומדים ב-DNA. במקרה זה, גנים טיפוליים מתבטאים ברקמות המטרה ותוצרים שלהם - חלבונים טיפוליים - נכנסים למחזור הדם. החיסרון העיקרי של גישה זו הוא השבתה מוקדמת או הרס של חלבונים אלו על ידי רכיבי דם.

ניתן להעביר DNA על ידי אריזתו במעטפת שומנים מלאכותית. החלקיקים הכדוריים-ליפוזומים המתקבלים בדרך זו חודרים בקלות את קרום התא. נוצרו ליפוזומים בעלי מגוון תכונות, אך עד כה היעילות של מסירה כזו נמוכה, מכיוון שרוב ה-DNA נתון לפירוק ליזוזומלי. כמו כן, כדי לספק מבנה גנטי, מצומדים DNA מסונתזים עם מולקולות שונות שיכולות להבטיח את בטיחותו, מסירה ממוקדת וחדירת תאים.

בשנים האחרונות נערכו ניסויים אינטנסיביים ליצירת כרומוזום 47 מלאכותי, שיאפשר הכללת כמות גדולה של חומר גנטי עם סט שלם של אלמנטים רגולטוריים עבור גן טיפולי אחד או יותר. זה יאפשר להשתמש בגרסה גנומית של הגן הטיפולי ובכך להבטיח את יציבותו וביטוי יעיל לטווח ארוך שלו. הניסויים שבוצעו הראו שיצירת כרומוזום אנושי מלאכותי המכיל גנים טיפוליים היא ריאלית למדי, אך עדיין לא ברור כיצד להחדיר מולקולה כה ענקית לגרעין של תא מטרה.

הבעיות העיקריות העומדות בפני ריפוי גנטי, בנוסף לסיכון לתגובה חיסונית חמורה, הן קשיי האחסון והתפקוד לטווח ארוך של ה-DNA הטיפולי בגופו של המטופל, ריבוי גניות של מחלות רבות, מה שהופך אותן למטרה קשה לגן. טיפול, והסיכון בשימוש בווירוסים כווקטורים.

על. Voinov, T.G. וולובה

ניוון שרירים דושן היא אחת המחלות הגנטיות הנדירות, אך עדיין נפוצות יחסית. המחלה מאובחנת בגיל שלוש עד חמש, לרוב אצל בנים, מתבטאת בהתחלה רק בתנועות קשות, עד גיל עשר, אדם הסובל ממיודיסטרופיה כזו כבר לא יכול ללכת, עד גיל 20-22 שלו. החיים מסתיימים. היא נגרמת על ידי מוטציה בגן הדיסטרופין, שנמצא על כרומוזום X. הוא מקודד לחלבון המחבר את קרום תאי השריר לסיבים מתכווצים. מבחינה תפקודית, זהו מעין קפיץ המבטיח כיווץ חלק ושלמות של קרום התא. מוטציות בגן מובילות לניוון של רקמת שריר השלד, הסרעפת והלב. הטיפול במחלה הוא פליאטיבי באופיו ויכול להקל רק במעט על הסבל. עם זאת, עם התפתחות ההנדסה הגנטית, יש אור בקצה המנהרה.

על מלחמה ושלום

ריפוי גנטי הוא העברת מבנים המבוססים על חומצות גרעין לתאים לטיפול במחלות גנטיות. בעזרת טיפול כזה ניתן לתקן בעיה גנטית ברמת ה-DNA וה-RNA על ידי שינוי תהליך הביטוי של החלבון הרצוי. לדוגמה, DNA עם רצף מתוקן יכול להימסר לתא, שממנו מסונתז חלבון פונקציונלי. או להיפך, אפשריות מחיקות של רצפים גנטיים מסוימים, מה שיעזור גם להפחית את ההשפעות המזיקות של המוטציה. בתיאוריה זה פשוט, אבל בפועל, הריפוי הגנטי מבוסס על הטכנולוגיות המורכבות ביותר לעבודה עם עצמים מיקרוסקופיים ומייצג מערך ידע מתקדם בתחום הביולוגיה המולקולרית.

הזרקת DNA לתוך פרונוקל הזיגוטה היא אחת הטכנולוגיות המוקדמות והמסורתיות ביותר ליצירת טרנסגנים. ההזרקה מתבצעת באופן ידני באמצעות מחטים דקות במיוחד במיקרוסקופ עם הגדלה של פי 400.

"גן הדיסטרופין, שהמוטציות שלו מובילות לניוון שרירים דושן, הוא עצום", אומר ואדים ז'רנובקוב, מנהל הפיתוח בחברת הביוטכנולוגיה Marlin Biotech, מועמד למדעי הביולוגיה. - הוא כולל 2.5 מיליון זוגות בסיסים, שניתן להשוות למספר האותיות ברומן מלחמה ושלום. ועכשיו דמיינו שקרענו כמה דפים חשובים מהאפוס. אם בעמודים אלו מתוארים אירועים משמעותיים, אז הבנת הספר כבר תהיה קשה. אבל עם הגן, הכל יותר מסובך. לא קשה למצוא עותק נוסף של מלחמה ושלום, ואז ניתן היה לקרוא את הדפים החסרים. אבל הגן דיסטרופין ממוקם על כרומוזום X, ולגברים יש רק אחד. לפיכך, רק עותק אחד של הגן מאוחסן בכרומוזומי המין של בנים בלידה. אין מקום אחר לקחת את זה.

לבסוף, בסינתזת חלבון מ-RNA, חשוב לשמר את מסגרת הקריאה. מסגרת הקריאה קובעת איזו קבוצה של שלושה נוקלאוטידים נקראת כקודון, התואם לחומצת אמינו אחת בחלבון. אם יש מחיקה בגן של קטע DNA שאינו כפולה של שלושה נוקלאוטידים, מתרחש שינוי במסגרת הקריאה - הקידוד משתנה. אפשר להשוות זאת למצב שבו, לאחר קרעים בכל הספר הנותר, כל האותיות יוחלפו באותיות הבאות בסדר אלפביתי. קבל אברקדברה. זה אותו דבר שקורה לחלבון שלא מסונתז בצורה נכונה".

מדבקה ביומולקולרית

אחת השיטות היעילות של ריפוי גנטי לשחזור סינתזת חלבון תקינה היא דילוג על אקסון באמצעות רצפי נוקלאוטידים קצרים. מרלין ביוטק כבר פיתחה טכנולוגיה לעבודה עם גן הדיסטרופין בשיטה זו. כידוע, בתהליך התעתוק (סינתזת RNA), נוצר לראשונה מה שנקרא RNA קדם-מטריקס, הכולל גם אזורים מקודדי חלבון (אקסונים) וגם אזורים לא מקודדים (אינטרונים). לאחר מכן, מתחיל תהליך השחבור, במהלכו נפרדים אינטרונים ואקסונים ונוצר RNA "בוגר" המורכב רק מאקסונים. ברגע זה, ניתן לחסום כמה אקסונים, "להדביק" בעזרת מולקולות מיוחדות. כתוצאה מכך, ל-RNA בוגר לא יהיו אותם אזורי קידוד שהיינו מעדיפים להיפטר מהם, וכך תשוחזר מסגרת הקריאה, החלבון יסונתז.

"חיפשנו באגים בטכנולוגיה הזו במבחנה", אומר ואדים ז'רנובקוב, כלומר על תרביות תאים שגדלו מתאי חולים עם מיודיסטרופיה של דושן. אבל תאים בודדים אינם אורגניזם. בפלישה לתהליכי התא, עלינו לצפות בהשלכות בשידור חי, אך לא ניתן לערב אנשים בבדיקות מסיבות שונות - מאתיות ועד ארגוניות. לכן, היה צורך להשיג מודל של ניוון שרירים דושן עם מוטציות מסוימות על בסיס חיית מעבדה".

איך לדקור את המיקרוקוסמוס

בעלי חיים מהונדסים הם בעלי חיים המתקבלים במעבדה, אשר בגנום שלהם מתבצעים שינויים בכוונה, במודע. עוד בשנות ה-70, התברר שיצירת טרנסגנים היא השיטה החשובה ביותר לחקר תפקודי הגנים והחלבונים. אחת השיטות המוקדמות ביותר להשגת אורגניזם מהונדס לחלוטין הייתה הזרקת ה-DNA לתוך הפרו-נוקלאוס ("מבשר גרעין") של הזיגוטים של ביציות מופרות. זה הגיוני, שכן הכי קל לשנות את הגנום של בעל חיים ממש בתחילת התפתחותו.

הדיאגרמה מציגה את תהליך CRISPR/Cas9, הכולל RNA תת-גנומי (sgRNA), האזור שלו פועל כ-RNA מנחה, ואת החלבון Cas9 nuclease, שחותך את שני גדילי ה-DNA הגנומי באתר המצוין על ידי ה-RNA המדריך.

הזרקה לגרעין הזיגוטה היא הליך מאוד לא טריוויאלי, כי אנחנו מדברים על מיקרוסקאלים. קוטר ביצת העכבר 100 מיקרומטר והפרונוקלאוס 20 מיקרומטר. הפעולה מתבצעת במיקרוסקופ עם הגדלה של פי 400, אך ההזרקה היא העבודה הידנית ביותר. כמובן, לא משתמשים במזרק מסורתי ל"הזרקה", אלא במחט זכוכית מיוחדת עם תעלה חלולה בפנים, שבה נאסף חומר הגן. ניתן להחזיק קצה אחד ביד, ואילו השני דק במיוחד וחד - כמעט בלתי נראה לעין בלתי מזוינת. כמובן, מבנה שביר כזה עשוי זכוכית בורוסיליקט לא ניתן לאחסן לאורך זמן, ולכן לרשות המעבדה יש סט של ריקים, אשר נמשכים במכונה מיוחדת מיד לפני העבודה. נעשה שימוש במערכת מיוחדת של הדמיית ניגודיות תאים ללא צביעה - התערבות בפרונקולוס היא טראומטית בפני עצמה ומהווה גורם סיכון להישרדות התא. צבע יהיה עוד גורם כזה. למרבה המזל, הביצים עמידות למדי, אך מספר הזיגוטים המולידים בעלי חיים מהונדסים הוא רק אחוזים בודדים מסך הביצים שהוזרקו להם DNA.

השלב הבא הוא כירורגי. מתבצעת ניתוח להשתלת זיגוטים המוזרקים במיקרו לתוך המשפך של הביצית של העכבר המקבל, אשר יהפוך לאם פונדקאית עבור טרנסגנים עתידיים. לאחר מכן, חיית המעבדה עוברת באופן טבעי מחזור הריון, ונולדים צאצאים. בדרך כלל יש בהמלטה כ-20% עכברים מהונדסים, מה שמעיד גם על חוסר השלמות של השיטה, כי יש בה מרכיב גדול של מקריות. כאשר הוא מוזרק, החוקר אינו יכול לשלוט בדיוק כיצד שברי ה-DNA המוכנסים ישולבו בגנום של האורגניזם העתידי. יש סבירות גבוהה לשילובים כאלה שיובילו למוות של בעל החיים בשלב העובר. עם זאת, השיטה עובדת ומתאימה למדי למספר מטרות מדעיות.

פיתוח טכנולוגיות טרנסגניות מאפשר לייצר חלבונים מהחי המבוקשים על ידי תעשיית התרופות. חלבונים אלו מופקים מחלב של עזים ופרות מהונדסים. קיימות גם טכנולוגיות להשגת חלבונים ספציפיים מביצי תרנגולת.

מספרי DNA

אבל יש דרך יעילה יותר המבוססת על עריכת גנום ממוקדת באמצעות טכנולוגיית CRISPR/Cas9. "היום, הביולוגיה המולקולרית דומה במקצת לעידן של משלחות ימיות ארוכות במפרש", אומר ואדים ז'רנובקוב. - כמעט כל שנה במדע הזה יש תגליות משמעותיות שיכולות לשנות את חיינו. לדוגמה, לפני מספר שנים, מיקרוביולוגים גילו חסינות לזיהומים ויראליים במין חיידקים שנחקר זמן רב לכאורה. כתוצאה ממחקרים נוספים, התברר ש-DNA חיידקי מכיל לוקוסים מיוחדים (CRISPR), מהם מסונתזים שברי RNA שיכולים להיקשר באופן משלים לחומצות גרעין של יסודות זרים, למשל, DNA או RNA של וירוסים. חלבון Cas9, שהוא אנזים נוקלאז, נקשר ל-RNA כזה. RNA משמש כמדריך ל-Cas9, מסמן קטע ספציפי של DNA שבו הגרעין מבצע חתך. לפני כשלוש עד חמש שנים הופיעו המאמרים המדעיים הראשונים שפיתחו את טכנולוגיית CRISPR/Cas9 לעריכת גנום".

עכברים מהונדסים מאפשרים ליצור מודלים חיים של מחלות גנטיות אנושיות קשות. אנשים צריכים להיות אסירי תודה ליצורים הזעירים האלה.

בהשוואה לשיטת בניית ההחדרה האקראית, השיטה החדשה מאפשרת לבחור אלמנטים של מערכת CRISPR/Cas9 באופן שיכוון במדויק מדריכי RNA לאזורים הרצויים של הגנום ולהשיג מחיקה או החדרה ממוקדת של ה-DNA הרצוי. סדר פעולות. שגיאות אפשריות גם בשיטה זו (מנחה RNA מתחבר לפעמים לאתר הלא נכון שאליו הוא מכוון), אך בשימוש ב-CRISPR/Cas9, היעילות של יצירת טרנסגנים היא כבר כ-80%. "לשיטה זו יש סיכויים רחבים, לא רק ליצירת טרנסגנים, אלא גם בתחומים אחרים, בפרט בריפוי גנטי", אומר ואדים ז'רנובקוב. "עם זאת, הטכנולוגיה נמצאת רק בתחילת דרכה, ודי קשה לדמיין שבעתיד הקרוב אנשים יוכלו לתקן את קוד הגנים של אנשים באמצעות CRISPR/Cas9. כל עוד יש אפשרות לטעות, ישנה גם סכנה שאדם יאבד חלק חשוב מקודד מהגנום".

רפואת חלב

חברת Marlin Biotech הרוסית הצליחה ליצור עכבר טרנסגני שבו המוטציה שמובילה לניוון שרירים דושן משוכפלת לחלוטין, והשלב הבא יהיה בדיקת טכנולוגיות ריפוי גנטי. עם זאת, יצירת מודלים של מחלות גנטיות אנושיות המבוססות על חיות מעבדה אינה היישום היחיד האפשרי של טרנסגנים. כך, ברוסיה ובמעבדות מערביות מתנהלת עבודה בתחום הביוטכנולוגיה, המאפשרת להשיג חלבונים רפואיים ממקור מהחי החשובים לתעשיית התרופות. פרות או עיזים יכולות לשמש כמפיקות, שבהן ניתן לשנות את המנגנון הסלולרי לייצור חלבונים הכלולים בחלב. אפשר להפיק חלבון תרופתי מחלב, שמתקבל לא בשיטה כימית, אלא במנגנון טבעי, שיעלה את יעילות התרופה. כיום פותחו טכנולוגיות להשגת חלבונים רפואיים כמו לקטופרין אנושי, פרורוקינאז, ליזוזים, אטרין, אנטיתרומבין ואחרים.