התגובה נקבעה:
1) לזהות פוליסכרידים, חלבונים, תמציות של חיידקים וחומרים מפוזרים מאוד אחרים, ריקטסיה ווירוסים, שלא ניתן לראות את הקומפלקסים שלהם עם אגלוטינינים ב-RA קונבנציונלי,
2) לזהות נוגדנים בסרום של חולים לחומרים המפוזרים מאוד ולמיקרואורגניזמים הקטנים ביותר.
תחת אגלוטינציה עקיפה, או פסיבית, מובנת תגובה שבה נוגדנים מקיימים אינטראקציה עם אנטיגנים שנספחו בעבר על חלקיקים אינרטיים (לטקס, תאית, פוליסטירן, תחמוצת בריום וכו' או אריתרוציטים של ראם, I (0) -קבוצות דם אנושיות)
בתגובה של hemagglutination פסיבי (RPHA) כנשא משמש אריתרוציטים. אריתרוציטים טעוני אנטיגן נדבקים זה לזה בנוכחות נוגדנים ספציפיים לאנטיגן זה ומשקעים. אריתרוציטים בעלי רגישות לאנטיגן משמשים ב- RPHA כאבחנה של אריתרוציטים לזיהוי נוגדנים (סרודיאגנוזה). אם אריתרוציטים עמוסים בנוגדנים (אבידון אריתרוציטים נוגדנים), ניתן להשתמש בו כדי לזהות אנטיגנים.
אורז. 3. ערכת RPGA: אריתרוציטים (1), טעונים באנטיגן (3), קשורים בנוגדנים ספציפיים (4).
הַצָגָה. בבארות של טבליות פוליסטירן מכינים סדרה של דילולים סדרתיים של סרום. בבאר הלפני אחרונה תורמים - 0.5 מ"ל של סרום חיובי ידוע וב-0.5 מ"ל אחרונים של מי מלח (בקרות). לאחר מכן, 0.1 מ"ל של אבחון אריתרוציטים מדולל מתווסף לכל הבארות, מנער ומניח בתרמוסטט למשך שעתיים.
ראיית חשבון. במקרה חיובי, אריתרוציטים מתיישבים בתחתית החור בצורה של שכבה אחידה של תאים עם קצה מקופל או משונן (מטריה הפוכה), במקרה שלילי הם מתיישבים בצורה של כפתור או טבעת. .
איור.4. RNGA חשבונאי (RPGA).
התחשבות בתוצאות של ערכת rnga לאיתור בוטולינום טוקסין.
הגורם הגורם לבוטוליזם - Clostridium botulinum מייצר רעלנים של שבעה סרוברים (A, B, C, D, E, F, G), אך הסרוברים A, B, E שכיחים יותר מאחרים. כל הרעלים נבדלים בתכונות אנטיגניות ויכולים להיות מובחן בתגובות לפי סרה ספציפית. לצורך כך ניתן לבצע תגובת המוגלוטינציה פסיבית (עקיפה) עם נסיוב החולה, בו צפויה נוכחות של רעלן, ועם אריתרוציטים עמוסים בנוגדנים של סרה נוגדת-בוטולינום מטיפוסים A,B,E. הסרום משמש כפקד.
אורז. 3. הצהרה ותוצאה של RNGA.
ראיית חשבון. במקרה חיובי, אריתרוציטים מתיישבים בתחתית החור בצורה של שכבה אחידה של תאים עם קצה מקופל או משונן (מטריה הפוכה), במקרה שלילי הם מתיישבים בצורה של כפתור או טבעת. .
מסקנה: בוטולינום טוקסין מסוג E נמצא בסרום של המטופל.
תגובת עיכוב ההמגלוטינציה (hrga).
אורז. 8. תגובת עיכוב ההמגלוטינציה (RTGA) (סכמה).
עקרון התגובה מבוסס על יכולתו של AT לקשור וירוסים שונים ולנטרל אותם, מה שהופך את אריתרוציטים בלתי אפשריים להצטבר. מבחינה ויזואלית, השפעה זו מתבטאת ב"עיכוב" ההמגלוטינציה. RTHA משמש באבחון של זיהומים ויראליים לזיהוי אנטי-המגלוטינינים ספציפיים ולזיהוי וירוסים שונים לפי ההמגלוטינינים שלהם, המציגים את התכונות של Ag.
הקלדת וירוסים מתבצעת בתגובת RTGA עם קבוצה של סמים ספציפיים לסוג. תוצאות התגובה נלקחות בחשבון על ידי היעדר hemagglutination. ניתן להבדיל תת-סוגי וירוס מסוג A עם אנטיגנים H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 ואחרים ב-RTGA עם קבוצה של סרה הומולוגית ספציפית לסוג
אורז. 9. תוצאות RTGA במהלך הקלדת נגיף השפעת
סמלים: - עיכוב ההמגלוטינציה (כפתור); - המאגלוטינציה (מטריה).
מסקנות: חומר הבדיקה מכיל וירוס שפעת מסוג A עם אנטיגן H3N2.
תגובת אגלוטינציה - RA(מ-lat. צבירה- קשר) - תגובה פשוטה שבה נוגדנים קושרים אנטיגנים גופניים (חיידקים, אריתרוציטים או תאים אחרים, חלקיקים בלתי מסיסים עם אנטיגנים נספגים עליהם, כמו גם אגרגטים מקרומולקולריים). זה מתרחש בנוכחות אלקטרוליטים, למשל, כאשר מוסיפים תמיסת נתרן כלוריד איזוטונית.
משתמשים בגרסאות שונות של תגובת הצבירה: מורחבת, משוערת, עקיפה וכו'. תגובת הצבירה מתבטאת ביצירת פתיתים או משקעים
RA משמש עבור:
קביעת נוגדנים בסרום הדם של חולים, למשל, עם ברוצלוזיס (תגובות רייט, הדלסון), קדחת טיפוס וקדחת פארטיפוס (תגובת Vidal) ומחלות זיהומיות אחרות;
קביעת הפתוגן מבודד מהמטופל;
קביעת קבוצות דם באמצעות נוגדנים חד שבטיים כנגד אלוגני אריתרוציטים.
כדי לקבוע את הנוגדנים של המטופל לָשִׂיםתגובת צבירה מורחבת:להוסיף לדילול של סרום הדם של המטופל אבחון(השעיה של חיידקים מומתים) ואחרי מספר שעות של דגירה ב-37 מעלות צלזיוס, צוין דילול הסרום הגבוה ביותר (טיטר סרום), שבו התרחשה אגלוטינציה, כלומר נוצר משקעים.
אופי וקצב האגלוטינציה תלויים בסוג האנטיגן והנוגדנים. דוגמה לכך היא אינטראקציה של אבחונים (אנטיגנים O ו-R) עם נוגדנים ספציפיים. תגובת צבירה עם O-diagnosticum(חיידקים נהרגים על ידי חום, שומרים על יציב תרמי O אנטיגן)מתרחשת בצורה של צבירה עדינה. תגובת האגלוטינציה עם H-diagnosticum (חיידקים שנהרגים על ידי פורמלין, שומרים על האנטיגן H-flagellar הבלתי רגיש לחום) היא בעלת גרגיר גס ומתמשכת מהר יותר.
אם יש צורך לקבוע את הפתוגן מבודד מהמטופל, לשים תגובת צבירה מכוונת,באמצעות נוגדנים אבחנתיים (סרום מאגד), כלומר, מתבצעת סרוטיפינג של הפתוגן. תגובה משוערת מתבצעת על שקופית זכוכית. לטיפה של סרום אגלוטינציה אבחנתי בדילול של 1:10 או 1:20 הוסף תרבית טהורה של הפתוגן שבודד מהמטופל. פקד ממוקם בקרבת מקום: במקום סרום, מורחים טיפה של תמיסת נתרן כלורי. כאשר מופיע משקעים פלוקולנטיים בטיפה עם סרום וחיידקים, הם שמים תגובת צבירה נרחבתבמבחנות עם דילולים הולכים וגדלים של סרום מצטבר, שאליהם מוסיפים 2-3 טיפות של תרחיף הפתוגן. הצבירה נלקחת בחשבון לפי כמות המשקעים ומידת ההבהרה של הנוזל. התגובה נחשבת חיובית אם נצפתה צבירה בדילול קרוב לטיטר של הסרום האבחנתי. במקביל, נלקחות בחשבון בקרות: סרום מדולל בתמיסת נתרן כלוריד איזוטונית צריך להיות שקוף, תרחיף של חיידקים באותה תמיסה צריך להיות עכור באופן אחיד, ללא משקעים.
חיידקים קשורים שונים יכולים להיות צבועים על ידי אותו נסיוב אגלוטיני אבחנתי, מה שמקשה על זיהוים. לכן, תהנו סרה צבירה נספג,שמהם הוסרו נוגדנים צולבים על ידי ספיחה על ידי החיידקים הקשורים אליהם. בסמים כאלה נשארים נוגדנים ספציפיים רק לחיידק זה. הכנת סראים אבחנתיים אבחנתיים מונורצפטורים בדרך זו הוצעה על ידי A. Castellani (1902).
התגובה של hemagglutination עקיפה (פאסיבית).(RNHA, RPHA) מבוסס על שימוש באריתרוציטים עם אנטיגנים או נוגדנים הנספגים על פני השטח, שהאינטראקציה שלהם עם הנוגדנים או האנטיגנים התואמים של סרום הדם של הכדור גורמת לאריתרוציטים להיצמד זה לזה וליפול לתחתית של המבחנה או התא בצורת משקע מסולסל (איור 13.2). עם תגובה שלילית, אריתרוציטים מתיישבים בצורה של "כפתור". בדרך כלל, נוגדנים מתגלים ב-RNHA באמצעות אבחון אריתרוציטים אנטיגני, שהוא אריתרוציטים עם ספיגה עלהם אנטיגנים. לעיתים אנו משתמשים באבחון אריתרוציטים נוגדנים, עליהם נספגים נוגדנים. לדוגמה, ניתן לזהות בוטולינום טוקסין על ידי הוספת נוגדן אריתרוציטים בוטולינום דיאגנוסטיקום (תגובה זו נקראת תגובה הפוכה להמגלוטינציה עקיפה- RONGA). RNHA משמש לאבחון מחלות זיהומיות, קביעת הורמון גונדוטרופי בשתן כאשר נוצר הריון, כדי לזהות רגישות יתר לתרופות, הורמונים ובמקרים אחרים.
תגובת COOMBS
(בדיקת Coombs) - שיטה לקביעת נוגדני Rh על פני כדוריות הדם האדומות, הגורמים לשקיעת גלובולינים בסרום הדם. בדיקה זו משמשת לאבחון אנמיה המוליטית אצל תינוקות עם אי התאמה ל-Rh שיש להם הרס של תאי דם אדומים.
תגובת קרישה. תאי פתוגן נקבעים באמצעות סטפילוקוקוס, מטופלים מראש בסרום אבחון חיסוני. חלבון המכיל סטפילוקוקוס אבל,בעלי זיקה למקטע Fc של אימונוגלובולינים, סופחים באופן לא ספציפי נוגדנים אנטי-מיקרוביאליים, אשר לאחר מכן מקיימים אינטראקציה עם מרכזים פעילים עם החיידקים המתאימים מבודדים מהמטופלים. כתוצאה מהקרישה נוצרים פתיתים המורכבים מסטפילוקוקים, נוגדנים סרום אבחנתיים והחיידק הנקבע.
תגובה לעיכוב ההמגלוטינציה(RTGA) מבוסס על חסימה, דיכוי אנטיגנים של וירוסים על ידי נוגדנים של סרום חיסוני, כתוצאה מכך וירוסים מאבדים את יכולתם לצבור תאי דם אדומים (איור 13.3). RTHA משמש לאבחון מחלות ויראליות רבות, שגורמיהן (שפעת, חצבת, אדמת, דלקת מוח בקרציות וכו') עלולים לצבור את אריתרוציטים של בעלי חיים שונים.
- קבוצת רופאים הגיעה להודו דרך ארגון הבריאות העולמי כדי לזהות חולי פוליו ולסייע בחיסון הכללי נגד פוליו. באחד הכפרים שנסקרו הובא לרופאים ילד בן 6 ממשפחה גדולה, שחלה לפני 5 ימים. הטמפרטורה עלתה לפתע, הראש כאב מאוד, היו הקאות חוזרות ונשנות, כאבים בזרועות וברגליים. בבדיקה: חום גבוה, חולשה קשה, תסמיני קרום המוח, ירידה בטונוס השרירים ברגל ימין, רפלקסים גידים מוחלשים בחדות, כף הרגל תלויה למטה. במהלך ניקור תעלת השדרה, נוזל מוחי זרמו החוצה בלחץ מוגבר, מספר הלימפוציטים גדל והחיידקים לא בודדו. בוצעה אבחנה ראשונית של "צורה משתקת של פוליומיאליטיס". איך יכול להיות שהילד נדבק? כיצד מתבצעת מניעה אקטיבית ספציפית של פוליומיאליטיס? האם יש סיכון להדביק ילדים אחרים במשפחה זו, מה צריך לעשות?
תשובה:הילד עלול להידבק בנתיב צואה-פה דרך מזון, מים, וגם בטיפות מוטסות. המדד העיקרי למניעת פוליומיאליטיס הוא חיסון בחיסון תרבית חיה של 3 סרוטיפים של זני Sabin, ברוסיה משתמשים בו. חיסון פוליולמתן דרך הפה המיוצר על ידי המכון לפוליומיאליטיס ודלקת מוח נגיפית. מ.פ. צ'ומקוב. החיסון הוא תכשיר תלת ערכי של זני Sabin מוחלשים של פוליו-וירוס מסוגים 1, 2, 3, המתקבלים בתרבית ראשונית של תאי כליה של קוף ירוק אפריקאי. . חיסונים שגרתיים נגד פוליומיאליטיס כפופים לילדים בגילאי 3 חודשים עד 6 שנים. חיסונים עם חיסון פוליו פומי מבוצעים על ידי 2 או 4 טיפות של החיסון דרך הפה שלוש פעמים בגיל 3, 4, 5 ו-6 חודשים עם חיסון מחדש פי שלושה בגיל 18, 20 חודשים ו-14 שנים. יש לאשפז את הילד החולה בבית חולים, וכל שאר הילדים במשפחה זו חייבים להתחסן בחיסון פוליו חי.
- הרכב ושימוש של חיסון נגד שפעת נוזל תלת-ערכי פולימר-תת-יחידה (גריפפול)
זהו חיסון מולקולרי. הרכב: AG שטחי של נגיף השפעת משלושה תת-סוגים (A / H1N1, A / H3N2, B). יישום: למניעת שפעת
כרטיס בחינה מס' 23
התגובה של המגלוטינציה עקיפה (RIHA)
השימוש בתכשירי אבחון נספחים מבוסס על עיקרון ההכרה האימונולוגית של מבני פני השטח המיושמים כל הזמן בטבע. מנקודת מבט זו, אין הבדלים מהותיים בין השימוש למשל בתא מיקרוביאלי או בנשא מלאכותי עמוס באנטיגן (נוגדנים). נשאים שונים משמשים כבסיס לתכשירים שנספגו - תאים מיקרוביאליים, אריתרוציטים, לטקס, בנטונין, כולסטרול, Sephadex, Dermatol, פחם פעיל, נבגי פטריות וכו'.
לאחר עבודתו של A.T. Kravchenko (1945), אריתרוציטים נטולי כדאיות ומקובעים עם ריאגנטים כימיים שונים הפכו לשימוש הנפוץ ביותר כנשא של אנטיגן או נוגדנים. על פי העיקרון של שימוש באריתרוציטים (גם מקומיים וגם קבועים) כנשא של האנטיגן, התגובה של hemagglutination עקיפה (פאסיבית) הפכה נפוצה.
ההצעה להשתמש בתגובת ההמגלוטינציה העקיפה (IHA) למטרות אבחון עלתה על בסיס ידע שפותח בעבר על פעילות הספיחה הגבוהה של אריתרוציטים. בהשוואה לנשאים רבים אחרים של אנטיגנים ונוגדנים, לאריתרוציטים יש יתרונות מסוימים בתגובה להמגלוטינציה עקיפה. ראשית, בתמיסות מלח איזוטוניות הן יוצרות לכידות יציבה למדי ואינן מתייצבות תוך זמן קצר. שנית, תאי הדם האדומים של אותו מין בעלי חיים זהים בגודלם. ולבסוף, אריתרוציטים בקלות יחסית ישירות או כתוצאה מעיבוד מיוחד מצמידים רכיבים פעילים שונים מבחינה סרולוגית.
יצירת אבחוני אריתרוציטים מאריתרוציטים מיוצבים מאפשרת להתגבר על הקשיים המתעוררים בעת שימוש באדמית מקומית.
במחקר של אריתרוציטים שטופלו במקבעים שונים, הוקמו כמה מהמאפיינים הנפוצים שלהם:
במורפולוגיה, הם למעשה אינם שונים מאלה טריים;
לא עובר המוליזה בתמיסות היפוטוניות, במים ולאחר הקפאה-הפשרה;
ניתן לייבוש בהקפאה;
מבני פני השטח שלהם שומרים על היכולת לעבור שינוי כימי (למשל, טאנין, תרכובות דיאזו) ולהגיב עם אנטיגנים ונוגדנים.
הקריטריון העיקרי לאיכותם של אריתרוציטים קבועים הוא האפשרות להשתמש בהם להשגת תכשירים רגישים בהעדר אגלוטינציה לא ספציפית בנוזלים מייצבים.
הכנת פני השטח של אריתרוציטים על מנת להגביר את יכולת הספיגה של אנטיגנים חשובה בתכנון תכשירי אבחון. נפוץ במיוחד הטיפול באריתרוציטים עם טאנין.
בהשפעתו, התכונות האנטיגניות של אריתרוציטים (חדירות, קצב שקיעה) משתנות, עמידותם להשפעות ההמוליטיות של חומצות שומן מסוימות עולה. עם זאת, העיקר מושג - אריתרוציטים מזויפים הם בעלי יכולת ספיגה גבוהה בהרבה של חלבונים, שנמצאת כיום בשימוש נרחב בייצור אנטיגנים ונוגדנים באיכות גבוהה.
יחד עם הטניזציה של אריתרוציטים, לייצור אבחון אריתרוציטים והכנת נשא אנטיגן, משתמשים בריאגנטים כימיים כגון ברומלין, טריאופסין ואשלגן פריודאט, אשר גם משנים את קרומי האריתרוציטים.
לאחר הכנת פני השטח של אריתרוציטים, התהליך החשוב ביותר מתרחש - תהליך ההמוסנסיטיזציה - השלב הסופי בייצור אבחוני אריתרוציטים.
לחיזוק הקשר בין הנשא לאנטיגן נעשה שימוש בחומרים מצמידים שונים - ביסדיאזובנזידין, דיפלואורודיניטרובנזין, ציאניד כלוריד, קדמיום כלורי וחומצה אצטית, ברום כלוריד, פורמלדהיד, גלוטאראלדהיד, ציאנוגן ברומיד, רינול, אמדול וכו'.
השימוש בחומרים מצמידים עוזר להעלים את החסרונות שיש לאדתרוציטים משוננים המשמשים לרגישות ללא חומרים מצמידים.
החומרים המצומדים הנפוצים ביותר הם כרום כלוריד, גלוטאראלדהיד, דיאזול שחור C ואמידול. תהליך הרגישות עם כרום כלוריד מתרחש מהר מאוד - מ 4 עד 10 דקות, מה שמושך את תשומת לב החוקרים. במקרה זה, נעשה שימוש בריכוזי כרום כלוריד מ-0.05 עד 2%, ה-pH אינו נמוך מ-5.0 בטמפרטורה של תערובת התגובה של 20-250 C. בתהליך הרגישות עם כרום כלוריד, קבוצות קרבוקסיל של חלבוני ממברנה אריתרוציטים מופעלים. כתוצאה מכך נוצר קשר קוולנטי בין קרום האריתרוציטים לסנסיטין.
לתגובה של hemagglutination עקיפה יש סגוליות גבוהה, שכן הצבירה של אריתרוציטים מתרחשת כתוצאה מהאינטראקציה של האנטיגן עם נוגדנים הנספגים על אריתרוציטים. המאפיין הייחודי שלו הוא רגישות גבוהה: מתגלה בו 0.02-0.05 מיקרוגרם של חלבון נוגדן. במונחים של רגישות, הוא עולה באופן משמעותי על התגובות של אימונודיפוזיה, אימונופלואורסצנטי, אימונודיפוזיה רדיאלית, קיבוע משלים וניטרול. RNGA פחות רגיש מהשיטות של רדיואימונואלקטרופורזה, קביעת כמות החלבון של נוגדנים רדיואקטיביים בחומר האימונוסורבנט, אנזים immunoassay.
היתרונות של RNGA כוללים יכולת שחזור גבוהה מספיק, קלות יישום וצורך בכמויות מינימליות של מרכיבים, במיוחד בעת שימוש בשיטת המיקרו.
בשנים האחרונות, RNHA מצאה יישום נרחב באבחון של rhinotracheitis זיהומיות, שלשולים, זיהום אדנוווירוס, זיהום ברוטה וקורונה, parainfluenza-3 וזיהום סינציציאלי בדרכי הנשימה.
אנו נותנים דוגמה לייצור ושימוש באבחון אריתרוציטים לזיהוי נוגדנים לזיהומי רוטציה וקורונה.
שיטת ההכנה של אבחון נוגדנים לאיתור אנטיגנים של רוטה וקורונה ב-RNGA היא כדלקמן: השגת השעיה של אריתרוציטים; תיקון האקרוליינים שלהם; tanization, המאפשר השגת ספיגה יציבה של החלבון הנדרש על אריתרוציטים; רגישות של אריתרוציטים tanized עם אימונוגלובולינים; קביעת הספציפיות של האבחון המוכן. הכנת תרחיף של אריתרוציטים מתבצעת על ידי נטילת דם של איל בריא מבחינה קלינית לתוך בקבוקון עם חרוזי זכוכית. לאחר דפיברינציה בדם, יש לשטוף אריתרוציטים 3-5 פעמים בתמיסת נתרן כלורי איזוטונית (0.9%) על ידי צנטריפוגה למשך 15-20 דקות ב-400 גרם.
על מנת לייצב את תאי הדם האדומים, הם מטופלים באקרולין. כפי שאתה יודע, פעולתו מתונה במידת מה מפורמלדהיד, ומספקת יציבות ופעילות גבוהה יותר של אריתרוציטים. לשם כך, נפחים שווים של השעיה 10% של אריתרוציטים מעורבבים עם תמיסה של 0.2% של אקרוליין שהוכנה בתמיסת חיץ פוספט (PBS) עם pH של 7.2. ההשעיה שהתקבלה נשמרת למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, ערבוב יסודי, ולאחר מכן שחרור אקרוליין על ידי צנטריפוגה חוזרת למשך 5 דקות ב-600-800 גרם עד שהריח הספציפי נעלם לחלוטין. היתרון של אריתרוציטים המוכנים בצורה זו הוא שהם נקצרים לעתיד, ניתן לאחסן אותם לאורך זמן מבלי להיות נתונים להמוליזה.
לאחר מכן, אריתרוציטים מיוצבים בריכוז של 10% נשמרים ב-2-4 מעלות צלזיוס ב-PBS עם pH של 7.2 למשך חודשיים.
כדי להגביר את יכולת הספיחה והשקיעה של אריתרוציטים, יש צורך לשכך אותם על ידי ערבוב חלקים שווים של תרחיף 10% של אריתרוציטים שטופים ותמיסת טאנין ב-PBS ו-pH 7.2 בדילול של 1:30,000. התערובת מעורבת היטב ונשמרת ב-370 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן נשטפים האריתרוציטים היטב מטאנין פעמיים ב-PBS עם pH 7.2 ושלוש פעמים עם תמיסת נתרן כלוריד איזוטונית עם pH 7.2-7.4.
הזמן האופטימלי להבטיח קבלת אבחון אריתרוציטים באיכות גבוהה הוא רגישותם תוך 24-48 שעות לאחר הטיפול בטאנין.
בתהליך הכנת אבחון, תמיסת נתרן כלוריד איזוטונית 0.3% פנולית עם 0.1% סרום נורמלי של ארנב או סוס, שהושבתה בעבר ב-56 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ונספגה על ידי אריתרוציטים רגילים של כבשים, משמשת כממס ומשמר. 37 מעלות צלזיוס. למשך 30 דקות
יש לבצע רגישות של אריתרוציטים מזויפים עם סרום היפר-אימוני, בהתאמה, כנגד נגיף בקר וקורונה (מיוצר במכון המחקר הווטרינרי הכל-רוסי Ya.R. Kovalenko לרפואה וטרינרית ניסויית). יחד עם זאת, מינון הרגישות (ריכוז החלבון) של סרום חיסון נגד רוטה הוא 280 מיקרוגרם/מ"ל, וזה של הסרום החיסוני לקורונה הוא 260 מיקרוגרם/מ"ל.
הרגישות מתבצעת על ידי ערבוב של נפחים שווים של אריתרוציטים שזופים וסרום חיסון שחומם מראש למשך 30 דקות ב-560C בריכוז אופטימלי. בנוסף מוסיפים 3 חלקים מתמיסת נתרן כלוריד איזוטונית עם pH של 7.2 ו-5 חלקים מתמיסת כרום כלורי 0.1%. התערובת, תוך ערבוב מדי פעם, נשמרת בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. לאחר הזמן שצוין, התערובת נשטפת ביסודיות באמצעות PBS עם PH של 7.2, ולאחר מכן מעבירים מחדש את האבחונים האריתרוציטים המוכנים בחומר משמר לריכוז של 1%. האבחון המוכן שומר על איכויותיו הבסיסיות למשך 8 חודשים, אם מאוחסן ב-4 מעלות צלזיוס.
בכל שלבי ייצור האבחונים, מעקב אחר צבירה עצמית. הספציפיות של האבחונים המוכנים נקבעת על ידי שלב RNGA, שבו נעשה שימוש באנטיגנים סטנדרטיים של נגיפי RTI, PG-3, אדנו-וירוסים, שלשולים נגיפיים, כמו גם אנטיגנים של רוטה וקורונה.
בעת הגדרת RNHA, מכינים דילולים כפולים סדרתיים של החומר המכיל את הנגיף הנחקר (השעיה של 20-50% של דגימות צואה), ולאחר מכן מוסיפים נפח שווה של אבחון אריתרוציטים לכל באר. יש לנער את הצלחות ביסודיות מספר פעמים, להשאיר אותם בטמפרטורת החדר עד שהאריתרוציטים ישובבו לחלוטין בבקרה. אינדיקטור לתגובה חיובית הוא אגלוטינציה של אריתרוציטים דיאגנוסטיקום בעוצמת אגלוטינציה של 2+ בטיטר של 1:4 ומעלה.
האתר מספק מידע התייחסות למטרות מידע בלבד. אבחון וטיפול במחלות צריכים להתבצע תחת פיקוחו של מומחה. לכל התרופות יש התוויות נגד. דרוש ייעוץ מומחה!
סרולוגי ניתוח דםהיא שיטה לבדיקת מעבדה של אנטיגנים או נוגדנים מסוימים ( חלבונים ספציפיים) בסרום של המטופל על סמך התגובות החיסוניות של הגוף. שיטה זו מיושמת כאשר אבחוןמחלות זיהומיות לאיתור נוכחות של נוגדנים בדם החולה לסוג מסוים של וירוס או חיידק, וכן לקביעת סוג הדם.חומר במחקר
קודם כל, לניתוח סרולוגי, נעשה שימוש בחומר ביולוגי שנאסף מהמטופל:- סרום דם
- רוֹק
- חומר צואה
- הקרקע
שיטת ניתוח או דגימת דם
ניתוח זה אינו דורש הכנה מיוחדת של המטופל. דגימת הדם מתבצעת בבוקר על קיבה ריקה ומתבצעת בחדרי טיפול במוסדות רפואיים, לפי שיטות המטולוגיות מקובלות. לצורך בדיקה סרולוגית מתבצעת דגימת דם בשתי שיטות: דם ורידי נלקח מהווריד הקוביטלי של המטופל ודם נימי נלקח מהקמיצה. הדם מונח במבחנות אטומות סטריליות.תכונות של הובלת דם ואחסון בסרום
מיד לאחר דגימת הדם הוא מועבר למעבדה מיוחדת, שם מכינים את הסרום באותו היום. אחסון סרום מותר לא יותר מ-4-6 ימים במקרר בטמפרטורה של 2-4 מעלות. אם נדרש אחסון ארוך יותר, הסרום מוקפא. על מנת להימנע מפגיעה באיכות הסרום, מותר להקפיא אותו פעם אחת ובהתאם להפשירו. במהלך אחסון לטווח ארוך, נוגדנים מאבדים את תכונותיהם והופכים לא פעילים חלקית, הרגישים ביותר להקפאה הם אימונוגלובולינים מהכיתה M. לאחר הפשרת הסרום, יש צורך לערבב אותו היטב עד למסה הומוגנית, מה שעוזר לשחזר את ריכוז הנוגדנים הכלול בסרום זה.
למה משמשת סרולוגיה?
שיטות אבחון מעבדתיות סרולוגיות משמשות לאיתור מחלות כגון echinococcosis, trichinosis, toxocariasis, opisthorchiasis, cysticercosis, toxoplasmosis, amoebiasis, giardiasis, כדי לקבוע את יעילות מהלך הטיפול ולבסוף, לזהות הישנות של המחלה לאחר שהמטופל החלים לחלוטין.שיטות בסיסיות לאבחון סרולוגי
תגובה אימונופלואורסצנטית (RIF)
תגובה זו היא גרסה עקיפה של מחקר סרולוגי, כלומר, היא מבוצעת בשני שלבים. בשלב הראשון מזהים את הנוגדן הדרוש בקומפלקס אנטיגן-נוגדנים במחזור באמצעות אנטיגלובולין, הדומה במבנהו לחלבוני סרום חיסון. זיהוי הנוגדן הרצוי אפשרי גם כאשר לומדים תכשיר אנטיגני שהוכן מראש במיקרוסקופ פלואורסצנטי, ללא שימוש באנטיגלובולינים.תגובה אימונופלואורסצנטית היא תהליך שלוקח זמן רב הדורש הרבה זמן ואחריות ממומחה. התגובה מתחילה בהכנת תמיסות, ואז הסרה ודגימות הבקרה שלהן עוברות טיטרציה ( תהליך המאפשר קביעת התוכן של חומר מסוים על ידי ערבוב הדרגתי של תמיסת בדיקה עם כמות מבוקרת של מגיב). דילולים שהוכנו בעבר ודגימות הבקרה שלהם מוחלים בקפידה על שקופיות עם אנטיגן. לאחר מכן, התכשירים עוברים דגירה, ולאחר מכן שטיפתם וייבושם באוויר. על השקופיות המכילות אנטיגן מורחים שכבה דקה של אנטי-סרום ולאחר מכן מדגרים מחדש את התכשירים וחוזרים על כל שרשרת הפעולות הקודמת, המסתיימת בייבוש התכשיר. כתוצאה מכך, התכשיר על שקף זכוכית מטופל בגליצרול ונבדק במיקרוסקופ פלואורסצנטי.
תוצאות התגובה מוערכות בסולם של ארבע נקודות, המאופיין בעוצמת הזוהר הצהוב-ירוק פני השטח של תאי אנטיגן:
+
זוהר חלש מאוד של התא, מורגש רק בשוליו
++
זוהר חלש של פריפריית התא, אך עם גוון ירוק הנראה בבירור
+++/++++
זוהר ירוק עז של פריפריית התא
טיטר התגובה נחשב לדילול סרום כזה שבו לפחות 50% מתאי האנטיגן מציגים זוהר פני השטח ברור, כלומר, התוצאה של התגובה +++
אוֹ ++++
. הערך של טווח התגובה הוא מ-1/80 עד 1/100.
עוצמת התגובה תלויה במספר אריתרוציטים המשקעים בתחתית הבארות שנוצרו:
–
תגובה שלילית, המאופיינת בתצהיר של אריתרוציטים על החלק התחתון של הבארות בצורה של טבעת קטנה עם קצוות חלקים או "כפתורים"
+
בעוצמה נמוכה, תגובה זו מאופיינת במשקעים בודדים קטנים בתחתית החור. אריתרוציטים לא צמודים יוצרים "טבעת קטנה" במרכז הבאר
++
בעוצמה בינונית, הוא מאופיין ביצירת "טבעת צפופה רחבה" של אריתרוציטים לא צמודים בתחתית החור
+++
תגובה אינטנסיבית, אריתרוציטים צמודים יוצרים את מה שמכונה "מטריות", שבמרכזן נראות בבירור טבעות שנוצרו על ידי אריתרוציטים לא צמודים.
++++
תגובה אינטנסיבית בצורה חדה שבה כל אריתרוציטים צמודים ויוצרים "מטריות", מצפים את תחתית החורים.
הטיטר של תגובה זו נחשב לדילול האחרון של נסיוב, שבו מתגלה לפחות אגלוטינציה ברורה של אריתרוציטים +++
, כלומר, עם תגובה אינטנסיבית או חדה.
המהימנות והאיכות של שיטות אבחון סרולוגיות תלויות בארגון של בקרת מעבדה פנימית וחיצונית, המורכבת ממספר הליכים עצמאיים שנועדו להעריך את איכות תוצאות הניתוח.
התגובה של hemagglutination עקיפה (פאסיבית) (RIHA) מבוססת על העובדה שאריתרוציטים, אם אנטיגן מסיס נספג על פני השטח שלהם, רוכשים את היכולת להצטבר בעת אינטראקציה עם נוגדנים לאנטיגן הנספג. סכימת RNGA מוצגת באיור. 34. RNHA נמצא בשימוש נרחב באבחון של מספר זיהומים.
אורז. 34. תכנית התגובה של המאגלוטינציה פסיבית (RPHA). A - קבלת אבחון אריתרוציטים: B - RPHA: 1 - אריתרוציטים: 2 - אנטיגן במחקר; 3 - אבחון אריתרוציטים; 4 - נוגדן לאנטיגן הנחקר: 5 - אגלוטינאט
הגדרת תגובה. סרום הבדיקה מחומם במשך 30 דקות ב-56 מעלות צלזיוס, מדולל ברצף ביחס של 1:10 - 1:1280 ומוזג לתוך 0.25 מ"ל לתוך מבחנות או בארות, ולאחר מכן מוסיפים 2 טיפות של אריתרוציטים דיאגנוסטיקום (אריתרוציטים עם אנטיגן). נספג עליהם).
בקרות: השעיה של אריתרוציטים אבחון עם סרום חיסוני ברור; השעיה של אבחון עם סרום תקין; השעיה של אריתרוציטים תקינים עם הסרום הנבדק. בביקורת הראשונה אמורה להתרחש אגלוטינציה, בשנייה ובשלישית היא לא אמורה להיות.
בעזרת RIGA, ניתן לקבוע אנטיגן לא ידוע אם נוגדנים ידועים נספגים על אריתרוציטים.
ניתן להגדיר את תגובת ההמגלוטינציה בנפח של 0.025 מ"ל (מיקרו-מתוד) באמצעות מיקרוטיטר Takachi.
שאלות מבחן
1. מה מעידה תוצאת RGA חיובית בין אריתרוציטים לחומר שנבדק לנוכחות הנגיף?
2. האם תיווצר אגלוטינציה של אריתרוציטים אם יתווספו להם וירוס והסרום המתאים? מה שם התגובה שחושפת את התופעה הזו?
תרגיל
שקול ורשום את התוצאה של RIGA.
תגובת משקעים
בתגובת המשקעים משקעים קומפלקס חיסוני ספציפי המורכב מאנטיגן מסיס (ליזאט, תמצית, הפטן) ונוגדן ספציפי בנוכחות אלקטרוליטים.
הטבעת העכורה או המשקע הנוצר כתוצאה מתגובה זו נקראת משקע. תגובה זו שונה מתגובת האגלוטינציה בעיקר בגודל חלקיקי האנטיגן.
תגובת המשקעים משמשת בדרך כלל לקביעת האנטיגן באבחון של מספר זיהומים (אנתרקס, דלקת קרום המוח וכו'); ברפואה משפטית - לקביעת מיני דם, זרע וכדומה; במחקרים סניטריים והיגייניים - בעת קביעת זיוף מוצרים; בעזרתו לקבוע את הקשר הפילוגנטי של בעלי חיים וצמחים. לתגובה אתה צריך:
1. נוגדנים (precipitins) - סרום חיסון בעל טיטר נוגדנים גבוה (לא נמוך מ-1:100,000). טיטר הסרום המשקע נקבע לפי הדילול הגבוה ביותר של האנטיגן איתו הוא מגיב. בדרך כלל משתמשים בסרום ללא דילול או בדילול 1:5 - 1:10.
2. אנטיגן - חומרים מומסים בעלי אופי פוליסכריד חלבוני או ליפואידי (אנטיגנים והפטנים מלאים).
3. תמיסה איזוטונית.
השיטות העיקריות לביצוע תגובת המשקעים הן: תגובת משקעים טבעת ותגובת משקעים באגר (ג'ל).
תשומת הלב! כל המרכיבים המעורבים בתגובת המשקעים חייבים להיות שקופים לחלוטין.
תגובת משקעים טבעת. 0.2-0.3 מ"ל (5-6 טיפות) של סרום מוסיפים לצינורית המשקעים באמצעות פיפטת פסטר (הסרום לא אמור ליפול על דפנות הצינורית). האנטיגן מונח בקפידה על הסרום באותו נפח, יוצקים אותו בעזרת פיפטת פסטר דקה לאורך דופן המבחנה. המבחנה נשמרת במצב משופע. בשכבות מתאימה, יש לקבל גבול ברור בין הסרום לאנטיגן. בזהירות, כדי לא לערבב את הנוזל, הניחו את המבחנה בחצובה. עם תוצאה חיובית של התגובה, נוצרת "טבעת" עכורה בגבול האנטיגן והנוגדן - משקע (ראה איור 48).
לאחר התגובה יש מספר בקרות (טבלה 18). רצף החדרת מרכיבי התגובה למבחנה חשוב מאוד. לא ניתן לשכב את הסרום על האנטיגן (בבקרה - על התמיסה האיזוטונית), מאחר והצפיפות היחסית של הסרום גדולה יותר, הוא ישקע לתחתית הצינור, והגבול בין הנוזלים לא יתגלה. .
טבלה 18
הערה. + נוכחות של "טבעת"; - חוסר "טבעת".
התוצאות נרשמות לאחר 5-30 דקות, בחלק מהמקרים לאחר שעה, כמו תמיד, החל בפקדים. ה"טבעת" במבחנה השנייה מעידה על יכולתו של הסרום החיסוני להיכנס לתגובה ספציפית עם האנטיגן המתאים. לא אמורות להיות "טבעות" במבחנות 3-5 - אין נוגדנים ואנטיגנים התואמים זה לזה. ה"טבעת" בצינור 1 - תוצאת תגובה חיובית - מעידה על כך שהאנטיגן הבדיקה מתאים לסרום החיסוני שנלקח, היעדר "טבעת" ("טבעת" רק בצינור השני) מעיד על חוסר העקביות שלהם - תגובה שלילית תוֹצָאָה.
תגובת משקעים באגר (ג'ל). המוזרות של התגובה היא שהאינטראקציה של האנטיגן והנוגדן מתרחשת במדיום צפוף, כלומר בג'ל. המשקע המתקבל נותן רצועה עכורה בעובי המדיום. היעדר פס מעיד על אי התאמה בין מרכיבי התגובה. תגובה זו נמצאת בשימוש נרחב במחקר ביו-רפואי, בפרט בחקר היווצרות רעלנים בגורם הסיבתי של דיפתריה.
שאלות מבחן
1. מה ההבדל העיקרי בין תגובת האגלוטינציה למשקעים?
2. מדוע לא ניתן להשתמש במרכיבים עכורים בתגובת המשקעים?
תרגיל
1. הגדר את תגובת משקעי הטבעת וצייר את התוצאה.
2. למדו את אופי האינטראקציה של האנטיגן עם הנוגדן בתגובת משקעי האגר, ציירו את התוצאה (קבלו את הכוס מהמורה).
תגובת ליזה (ציטוליזה חיסונית)
תמוגה חיסונית היא פירוק תאים בהשפעת נוגדנים עם השתתפות חובה של משלים. לתגובה אתה צריך:
1. אנטיגן - חיידקים, אריתרוציטים או תאים אחרים.
2. נוגדן (ליזין) - סרום חיסון, לעיתים רחוקות סרום החולה. סרום בקטריוליטי מכיל נוגדנים המעורבים בתמוגה של חיידקים; hemolytic - המוליזינים התורמים להתמוגגות של כדוריות דם אדומות; עבור תמוגה של ספירוצ'טים יש צורך בספירוצ'טוליזין, תאים - איטוליזינים וכו'.
3. משלים. הכי משלים בסרום של שפני ניסיונות. סרום זה (תערובת ממספר בעלי חיים) משמש בדרך כלל כהשלמה. המשלים הטרי (ילידים) אינו יציב ונהרס בקלות על ידי חימום, ניעור, אחסון, כך שניתן להשתמש בו לא יותר מיומיים לאחר הקבלה. לשימור המשלים מוסיפים לו 2% חומצת בור ו-3% נתרן גופרתי. ניתן לאחסן את המשלים הזה ב-4 מעלות צלזיוס עד שבועיים. המשלים היבש נפוץ יותר. לפני השימוש, הוא מומס בתמיסה איזוטונית לנפח המקורי (מצוין על התווית).
4. תמיסה איזוטונית.
תגובת המוליזה(טבלה 19). לתגובה אתה צריך:
1. אנטיגן - תרחיף 3% של אריתרוציטים כבשים שטופים בשיעור של 0.3 מ"ל משקעי אריתרוציטים ו-9.7 מ"ל תמיסה איזוטונית.
2. נוגדן - סרום המוליטי (המוליזין) נגד אריתרוציטים של כבשים; בדרך כלל מוכנים בייצור, lyofilized והטיטר מצוין על התווית.
טיטר המוליזין הוא דילול הסרום הגבוה ביותר שבו מתרחשת המוליזה מלאה של תרחיף 3% של אריתרוציטים בנוכחות משלים. עבור תגובת המוליזה, המוליזין נלקח בטיטר משולש, כלומר, הוא מדולל פי 3 פחות מאשר לפני הטיטר. לדוגמה, אם הטיטר בסרום הוא 1:1200, הסרום מדולל 1:400 (0.1 מ"ל סרום* ו-39.9 מ"ל של מי מלח איזוטוני). יש צורך בעודף של המוליזין, מכיוון שחלק ממנו יכול להיספג על ידי מרכיבים אחרים של התגובה.
* (אין ליטול פחות מ-0.1 מ"ל סרום - דיוק המדידה נפגע.)
3. משלים מדולל 1:10 (0.2 מ"ל של משלים ו-1.8 מ"ל של מי מלח איזוטוני).
4. תמיסה איזוטונית.
טבלה 19. סכימה של תגובת המוליזה
התחשבנות בתוצאות. עם תגובה מוגדרת נכונה במבחנה הראשונה, תתרחש המוליזה - התוכן שלה יהפוך לשקוף. בבקרות הנוזל נשאר מעונן: בצינור 2 חסר משלים להופעת המוליזה, בצינור 3 אין המוליזין, בצינור הרביעי לא קיים המוליזין ולא משלים, בצינור החמישי, האנטיגן אינו תואם לנוגדן,
במידת הצורך, סרום המוליטי עובר טיטרציה בהתאם לתכנית הבאה (טבלה 20).
לפני טיטרציה מכינים דילול נסיוב ראשוני של 1:100 (0.1 מ"ל סרום ו-9.9 מ"ל של מי מלח איזוטוני), שממנו עושים את הדילולים הדרושים, למשל:
מתוך דילולים אלה, 0.5 מ"ל של סרום מתווסף למבחנות של חווית הטיטרציה, כפי שמוצג בטבלה. עשרים.
טבלה 20. ערכת טיטרציה לסרום המוליטי (המוליזין)
בדוגמה שניתנה בטבלה. 20, הטיטר של סרום המוליטי הוא 1:1200.
בעת שימוש בסרום המוליטי טרי, יש להשבית אותו כדי להרוס את המשלים שלו. לשם כך, הוא מחומם במשך 30 דקות ב-56 מעלות צלזיוס באמבט מים או באינאקטיבטור עם תרמוסטט. השיטה האחרונה טובה יותר: היא מבטלת את האפשרות של התחממות יתר בסרום, כלומר הדנטורציה שלו. סרה דנטורטית אינה מתאימה לבדיקה.
תגובה בקטריוליזה. בתגובה זו משלימים חיידקים בנוכחות הסרום המתאים (הומולוגי). ערכת התגובה דומה ביסודה לתוכנית התגובה המוליזה. ההבדל הוא שאחרי דגירה של שעתיים, כל המבחנות מוזרעות על צלחות פטרי עם מדיום המתאים למיקרואורגניזם שנלקח בניסוי כדי לגלות אם הוא מוקף. עם ניסיון מוגדר נכון בגידולים מהמבחנות 2-5 (בקרות), אמורה להיות צמיחה בשפע. חוסר צמיחה או צמיחה חלשה בתרבית מהמבחנה הראשונה (ניסוי) מצביע על מוות של חיידקים, כלומר שהם הומולוגים לנוגדן.
תשומת הלב! תגובת הבקטריוליזה חייבת להתבצע בתנאים אספטיים.
שאלות מבחן
1. מה יקרה לאריתרוציטים אם נעשה שימוש במים מזוקקים במקום תמיסת נתרן כלוריד איזוטונית? מה עומד בבסיס התופעה?
2. איזו תגובה תתרחש כאשר אריתרוציטים מקיימים אינטראקציה עם סרום חיסוני הומולוגי בהיעדר משלים?
תרגיל
הגדר את תגובת המוליזה. רשמו וציירו את התוצאה.
מידע דומה.