Виды антител и вызываемые ими феномены. Антитела организма. Места образования антител. Расшифровка анализа крови на антитела

Глобулины сыворотки крови человека и животных, образующиеся в ответ на попадание в организм различных антигенов (принадлежащих бактериям, вирусам, белковым токсинам). Антитела вступают в реакции специфического взаимодействия с данными антигенами, в результате чего происходит дезактивация соответствующих бактерий, вирусов и токсинов.

Антитела являются важным элементом иммунной системы и принимают участие во многих процессах, отвечающих за защиту организма. Человек ежедневно сталкивается с огромным количеством чужеродных агентов, со многими из которых он встречается впервые, что создает потребность в постоянной адаптации защитных систем организма, представленных клеточным иммунитетом, исполнение задач которого возложено на специализированные клетки, и гуморальным, представленным специфическими (антитела) и неспецифическими структурами. Огромный прогресс в исследовании механизмов функционирования и регуляции иммунитета был достигнут в конце XIX века работой двух великих ученых – Ильи Мечникова, основоположника клеточной теории, и Пауля Эрлиха, основоположника гуморальной теории.

Антитела представлены белковыми молекулами Y-образной формы, состоящими из четырех полипептидных цепей (двух идентичных легких и тяжелых). Каждая легкая цепь соединена только с одной тяжелой цепью, в то время как тяжелые цепи соединены между собой. Антитела имеют три конца, два из которых называются Fab-фрагментами (fragment antigen binding, то есть фрагментами, отвечающими за связывание антигенов) и один – Fc -фрагментом (название обусловлено его тенденцией к кристаллизации в растворах). Fc фрагмент отвечает за выполнение биологических функций антител, связываясь с рецепторами на лимфоцитах и макрофагах или вызывая активацию комплемента.

Некоторые антитела объединены в мультимеры, состоящие из двух и более молекул, соединенных между собой.

Благодаря широкой вариабельности Fab-фрагментов, антитела способны связывать огромное количество антигенов, включающих как макромолекулы, так и маленькие химические соединения. Участки антигенов, содержащие уникальную последовательность химических соединений, узнаваемую антителами, называют эпитопами. Сила, с которой Fab-фрагмент взаимодействует с эпитопом, называется аффинитетом.

Антитела могут как свободно циркулировать, так и быть связанными с мембраной, являясь рецепторами В – лимфоцитов. У Т-лимфоцитов же рецепторами могут быть только ТCR (T cell receptor complex). Секретируемые антитела в норме представлены в крови и на слизистых, выполняя функции нейтрализации и удаления микробов и токсинов. Антитела также называют иммуноглобулинами, когда они попадают в кровоток, на слизистую или становятся рецепторами В-лимфоцитов.

После взаимодействия Fc фрагмента с антителом, связанным с антигенной детерминантой, сигнал через специальный комплекс передается внутрь клетки, приводя к ее активации.

Важно понять, что узнавание чужеродных агентов происходит в случайном порядке, и совпадение между индивидуальными участками антигенов и Fab-фрагментами антител обусловлено огромным количеством и вариабельностью клонов лимфоцитов.

Антитела у детей

Иммунитет у новорожденных не способен полноценно противостоять всем угрозам внешней среды, что обусловлено низкой степенью его развития. Постепенное совершенствование иммунного ответа происходит параллельно с развитием других органов и систем, однако на протяжении этого процесса можно наблюдать «критические периоды», сопровождаемые недостаточностью иммунной защиты.

Критические периоды:

Первый критический период длится первые 29 дней жизни и обусловлен тем, что иммунная защита ребенка представлена преимущественно антителами матери, попавшими в организм ребенка через плаценту или грудное молоко. В этом периоде повышен риск бактериальных и вирусных инфекций. Особое внимание следует уделить недоношенным.

Второй критический период наблюдается на 4-6 месяцах жизни и обусловлен истощением пула антител, попавших в организм ребенка от матери через плаценту и низкой способностью к синтезу своих антител. Кроме того, классом антител, производимым в этом периоде, являются антитела класса М. Почти полное отсутствие иммуноглобулинов G, являющихся главными защитниками, и других классов антител, приводит к низкой устойчивости ребенка в этом возрасте к инфекциям, передаваемым воздушно-капельным и кишечным путями.

Третий критический период можно наблюдать на 2-м году жизни, что связано с активной познавательной деятельностью ребенка и неполноценной иммунной защитой. В связи с недостаточной секрецией Ig А, отвечающего за местный иммунитет, сохраняется высокая восприимчивость к инфекциям, передаваемым воздушно-капельным и кишечным путями.

Четвертый критический период наблюдается на 6-7 годах жизни, что связано с физиологическим уменьшением количества лимфоцитов, однако сохраняющийся низкий уровень Ig A приводит к тому, что слизистые не способны полноценно противостоять инфекциям, передаваемым воздушно-капельным и кишечным путями. Кроме того, высокий уровень IgE, обусловленный значительной частотой глистных инвазий, повышает вероятность развития аллергических реакций в этой возрастной группе.

Пятый критический период наблюдается в подростковом возрасте и обусловлен относительным несоответствием объема органов иммунной системы фактическим размерам организма. Также повышение секреции половых гормонов приводит к угнетению клеточного компонента иммунной системы. Как правило, наблюдается высокая восприимчивость к заболеваниям вирусной природы.

У детей также могут встречаться наследственные заболевания, при которых наблюдается дефект гуморального звена иммунитета.

К дисгаммаглобулинемиям относят:

• Недостаток антител A класса;
• Недостаток антител G класса;
• Недостаток транскобаламина II;
• Гипер-IgM- синдром;
• Гипер-IgE синдром;
• Гипер-IgD синдром.

В зрелом возрасте у людей иммунная система, как правило, полностью сформирована и наделена большими компенсаторными возможностями, позволяющими адаптироваться к изменяющимся или тяжелым условиям окружающей среды. Однако вредное воздействие неблагоприятных факторов внешней среды может приводить к значительному снижению уровня иммунной защиты. Устранение вредных факторов, как правило, восстанавливает ее первоначальный уровень.

Антитела при беременности, влияющие на ее течение

Беременность является сложным физиологическим процессом, протекающим в течение длительного, порядка 40 недель в норме, срока. В этот период питание и дыхание плода, находящегося внутри материнского организма, осуществляется через гемоплацентарный барьер. Вместе с газами, растворенными в крови, и питательными веществами, через плаценту могут проходить иммуноглобулины. Однако, в норме не все антитела при беременности могут попадать в кровь плода. Этой способностью обладают только Ig G. Их основной целью в этом периоде является предотвращение развития внутриутробных инфекций или септических состояний.

К сожалению, не всегда антитела при беременности играют положительную роль. Так, развитие иммунных реакций, направленных против своего плода, не является редким явлением и может приводить к прерыванию беременности на ранних сроках.

Так, возможно формирование антител при беременности к белковым структурам на поверхности плода, отвечающим за резус-фактор или группу крови.

Резус-фактор присутствует у 85% населения и, при его наличии на поверхности эритроцитов, он считается положительным. При наличии положительного резус-фактора у плода, в то время как у матери он отрицателен, высока вероятность развития антител к эритроцитам и их последующему гемолизу. Выделяющийся при этом гемоглобин превращается в билирубин, в высоких концентрациях обладающий токсическим влиянием на нервную ткань. При условии, что мать не сталкивалась ранее с резус-положительной кровью и у нее отсутствуют антитела к резус-фактору, первая беременность может протекать без осложнений. Во время родов проводится инъекция анти-Д-иммуноглобулина, что в ряде случаев позволяет облегчить течение второй беременности и снизить риск резус-конфликта при повторной беременности до 10-15%. Однако, анализ на антитела может быть положительным и при несостоявшейся первой беременности и составляет 3% после выкидыша, после медицинского аборта в 5%, а при внематочной беременности- в 1% случаев.

Антитела при беременности к эритроцитам плода также могут вырабатываться у матери с I группой крови при рождении ребенка со II или III группами, что также может приводить к гемолизу эритроцитов, приводя к смерти плода.

В связи с незрелостью иммунной защиты новорожденных, выработка собственных антител у них практически отсутствует, что значительно повышает риск развития инфекционных процессов. Сразу после родов в грудном молоке содержится огромное количество Ig A, отвечающих за защиту слизистых оболочек и значительно снижающих риск заболеваний инфекционной природы. Кроме того, в организме ребенка циркулируют антитела, попавшие в кровь ребенка через плаценту еще до родов.

Таким образом, использование заменителей грудного молока значительно ухудшает прогноз в отношении иммунной защиты и не должно происходить без серьезных показаний.

Антитела у пожилых

Так как антитела являются неотъемлемой частью иммунитета, нельзя оценивать их состояние отдельно от общего состояния иммунной системы.

У людей с возрастом в норме происходят изменения, затрагивающие иммунные процессы:

• инволюция тимуса;
• дегенеративные изменения костного мозга;
• дегенеративные изменения органов лимфоидной системы.

Инволютивные изменения в тимусе начинаются во время полового созревания и сказываются на эффективности клеточного компонента иммунитета, что повышает риск инфекционных и онкологических болезней.

В отличие от клеточного, гуморальный иммунитет меньше подвержен влиянию возраста, хоть и может наблюдаться незначительное снижение уровня естественных иммуноглобулинов.

Однако, из-за снижения эффективности клеточного и гуморального компонентов иммунитета, повышается вероятность образования аутоантител, что повышает риск развития ревматоидного артрита, тиреоидита и других аутоиммунных заболеваний. Одной из причин образования антител к собственным тканям является снижение контроля за клетками, которые подверглись мутациям и не были уничтожены клеточным иммунитетом.

Следует отметить, что отмечается снижение атопий при увеличении инфекционной и химической форм аллергии с повышением риска развития анафилактического шока.

Классы антител

Цепи, принимающие участие в образовании молекулы антитела, имеют вариабельные участки (формируются в результате сложного процесса отбора отдельных участков ДНК В-лимфоцитов и участвуют в формировании Fab-фрагментов) и константные участки (участвуют в формировании Fc-фрагментов и определяют биологические функции молекулы). В зависимости от того, какие константные участки были синтезированы, выделяют 2 вида легких цепей и 5 видов тяжелых цепей, однако определяющее значение играют тяжелые цепи, в зависимости от которых выделяют пять изотипов, или классов:

• Ig M;
• Ig D;
• Ig G;
• Ig E;
• Ig A.

Каждый изотип имеет определенные функции и биологические свойства.

Антигенными рецепторами неактивированных В-лимфоцитов являются связанные с мембраной Ig M или Ig D антитела. После одновременной стимуляции антигеном и Т-хелпером, В-лимфоцит, который соответствует конкретному антигену, активно делится и дифференцируется на разные клоны, синтезирующие определенные классы антител.

Антитела класса М

Продолжительность жизни составляет 5 дней.

Существуют в форме пентамера (состоят из пяти молекул антител формы Y, соединенных в области Fc-фрагмента).

Функции антител класса М:

• Активация комплемента;
• Рецептор В-лимфоцитов.

Антитела G класса

Продолжительность жизни составляет 23 дня. Существуют антитела G класса в качестве мономера, свободно циркулируя в кровотоке.

Функции Ig G:

• Опсонизация;
• Активация комплемента;
• Антитело-опосредованная цитотоксичность;
• Обеспечивают неонатальный иммунитет;
• Являются основными антителами, синтезирующимися в ответ на повторную активацию клеток памяти идентичным антигеном;
• Ингибирование активности В-лимфоцитов по способу обратной связи.

Продолжительность жизни составляет 6 дней. Существуют в форме мономеров, димеров и тримеров.

Функция антител класса Ig A заключается в защите слизистых от чужеродных агентов путем их связывания до попадания в ткани.

Антитела класса Е

Продолжительность жизни составляет 2 дня.

Антитела класса D являются рецепторами В- лимфоцитов, в связи с чем продолжительность их существования определяется продолжительностью жизни иммунной клетки. В свободной, циркулирующей форме не существуют.

Анализ на антитела играет огромное, а в некоторых случаях даже решающее значение в постановке диагноза заболевания, так как он отражает протекающие в гуморальном звене иммунитета процессы.

Определение количества и подкласса антител позволяет судить о длительности и природе заболевания, а в некоторых случаях возможно определение конкретного возбудителя, вызвавшего болезнь, поэтому широко применяется в специализированных учреждениях при постановке таких диагнозов, как вирусный гепатит, ВИЧ и других.

Норма антител

В норме антитела можно обнаружить в кровотоке, на слизистых и, особенно, в лимфоидных органах, где в основном и происходит активация иммунного ответа. Это обусловлено постоянным контактом организма со внешней средой, состоящей из чужеродных агентов.

Для определения антител проводится ряд тестов, оценивающих количественные и качественные характеристики гуморального компонента иммунной системы. Также рекомендуется оценивать изменение их уровня в динамике.

Норма антител в сыворотке крови составляет:

• У мужчин: IgM (0,55-1,41 г/л); IgG (6,64-14,0 г/л); IgA (1,03-4,04 г/л);
• У женщин: IgM (0,37-1,95 г/л); IgG (5,87-16,3 г/л); IgA (0,54-3,43 г/л).

Повышены антитела одного или нескольких подклассов

Степень повышения антител может быть выражена в разной степени. Для правильной интерпретации результата на антитела важно оценивать изменение их уровня в динамике.

Если не произошло активации В-лимфоцита из-за отсутствия контакта с подходящим ему чужеродным антигеном, то последующей его трансформации в плазматическую клетку, являющуюся фабрикой про производству иммуноглобулинов, не происходит, и такие клетки ждут своего часа. Если же В-лимфоцит проконтактировал с чужеродным агентом, то большую роль играет место встречи и тип чужеродного агента, вызвавшего иммунную реакцию.

Возможно три варианта развития событий:

• В-лимфоциты в фолликулах селезенки после встречи с белковым антигеном и Т-хелпером активируются с последующим активным делением и дифференцировкой на длительно живущие плазматические клетки, синтезирующие Ig G, IgA и IgE;
• Краевые В-лимфоциты в селезенке после контакта с антигенами, являющимися общими чужеродными структурами для большинства инородных агентов, активируются с последующим активным делением и дифференцировкой на короткоживущие плазматические клетки, синтезирующие IgM;
• В-лимфоциты слизистых оболочек или брюшной полости после контакта с чужеродными агентами также активируются с последующим активным делением и дифференцировкой на короткоживущие плазматические клетки, синтезирующие IgM.

Таким образом, после проведения анализа крови на антитела и определения спектра и уровня антител, можно судить о происходящих в организме процессах.

Повышены антитела могут быть также при заболеваниях, сопровождающихся нарушениями в системе иммунитета. К ним относятся парапротеинемии, проявляющиеся наличием антител с функциональными и структурными дефектами при миеломной и ряде других болезней.

Анализ крови на антитела может существенно помочь в диагностике заболеваний, что имеет большое значение для выяснения природы заболевания и выбора наиболее верной тактики лечения. Также определение антител позволяет оценивать состояние искусственного активного иммунитета, полученного путем вакцинации и, таким образом, контролировать уровень заболеваемости и потребность в вакцинации.

Однако, к сожалению, антитела, призванные защищать организм человека, могут в результате различных нарушений атаковать нормальные ткани организма.

Основные причины этого явления:

• Высокая степень антигенной схожести чужеродных агентов с собственными тканями организма может приводить к тому, что вновь образованные антитела атакуют не только инородные структуры, но и свои собственные;
• Некоторые ткани организма, такие как хрусталик глаза и сперматозоиды в здоровом организме напрямую не омываются кровью, что защищает их от ошибочного распознавания организмом как чужеродных;
• В процессе созревания лейкоциты проходят несколько этапов отбора в лимфоидных органах, что позволяет выбраковывать дефектные клетки. Сбой этого сложного процесса приводит к образованию дефектных антител.

Положительные антитела

Положительные антитела, как правило, говорят о том, что пациент ранее встречался с чужеродным агентом, но это не всегда является результатом полноценного инфекционного процесса. Это стало возможным благодаря широкому введению вакцинации. Так, в качестве вакцины возможно применение живых, но ослабленнных организмов, или мертвых частиц, представленных продуктами их жизнедеятельности. Для борьбы с инфекциями, тяжесть которых зависит от выработки токсина, нашли применение вакцинации анатоксинами – токсинами, потерявшими свои опасные свойства в результате химической или физической обработки.

Тем не менее, положительные антитела с высокой уверенностью позволяют подтвердить или, напротив, исключить предполагаемого возбудителя заболевания.

Если результат на антитела положительный, это также можно использовать для контроля напряженности иммунитета с определением показаний к вакцинации или ревакцинации, проведение которых позволяет смягчать тяжесть заболеваний и предотвращать эпидемические вспышки.

Также положительные антитела могут определяться после переливания иммунной плазмы крови или прямого введения в кровоток уже готовых взятых у человека или животных иммуноглобулинов, что иначе называется искусственной пассивной профилактикой. Ее целью является предотвращение развития инфекционного процесса и заключается в быстром образовании иммунных комплексов с последующим развитием реакций, обусловленных биологическим эффектом антител.

Отрицательный результат на антитела может наблюдаться в следующих ситуациях:

• ошибка в определении предполагаемого возбудителя, что говорит об отсутствии его роли в возникновении болезни;
• слишком раннее проведение диагностического теста;
• низкая чувствительность теста или его брак, что оправдывает возможность повторного проведения в ряде случаев диагностического теста.

Тем не менее, отрицательный результат на антитела не является абсолютным доказательством отсутствия заболевания. Примером может служить вирус иммунодефицита человека, антитела к которому определяются со значительной задержкой. Поэтому проведение полноценного физического и лабораторного обследования, а также оценка наличия антител являются частью единого комплекса мероприятий.

Антиспермальные антитела

Антиспермальные антитела взаимодействуют с антигенами на поверхности сперматозоидов. Впервые они были определены в крови мужчин, страдающих бесплодием, и описаны Rumke и Wilson в 1954 г. Эти антитела определяются у каждого пятого мужчины с бесплодием и представлены, как правило, IgG, реже IgA и IgM. Антиспермальные антитела в норме также можно обнаружить у мужчин без нарушений репродуктивной функции в 1-10% и у 5% бесплодных женщин.

Аутоиммунные антитела не возникают в норме благодаря гематотестикулярному барьеру, изолирующему клетки, принимающие участие в сперматогенезе. В основе этого барьера находятся клетки Сертоли и их отростки. В семявыносящих путях защита от образования антител осуществляется способностью сперматозоидов освобождаться от антигенов и антител на внешней оболочке, а также специальными иммуносупрессирующими факторами, находящимися в семенной жидкости.

При сбое защитных механизмов, травмах мошонки и воспалительных заболеваниях репродуктивной системы повышается вероятность образования антиспермальных антител.

Образование антиспермальных антител возможно и у женщин. В норме этого обычно не наблюдается, однако принято считать, что сопутствующие заболевания репродуктивной системы повышают риск развития этого явления.

На современном этапе не существует однозначного мнения о влиянии антиспермальных антител на репродуктивные свойства сперматозоидов, хотя и считается, что они несколько снижают их подвижность и выживаемость.

В норме антитела к тиреопероксидазе (ТПО) не наблюдаются и, по факту, являются проявлением аутоиммунных процессов, направленных против щитовидной железы. У человека этот фермент отвечает за образование радикалов йода, необходимых для формирования Т3 и Т4, поэтому антитела к ТПО часто снижают синтез этих гормонов.

Антитела к тиреопероксидазе характерны для:

• тиреоидита Хашимото;
• диффузного токсического зоба;
• послеродового тиреоидита;
• аутоиммунного тиреоидита;
• гипертиреоза или гипотиреоза у новорожденных.

Показанием к определению антител к тпо является также подозрение на повреждение щитовидной железы аутоиммунной природы, что может проявляться:

• увеличением щитовидной железы без изменения ее функции;
• изменением функции щитовидной железы.

Антитела к ТПО могут приводить к нарушению регулирования синтеза гормонов, что клинически будет проявляться картиной гипотиреоза или гипертиреоза.

Уменьшение антител к тиреопероксидазе позволяет судить об успешности лечения.

Анализ на антитела к ТПО при получении результатов, вызывающих сомнение, рекомендуется проводить в сочетании с другими анализами повышающими точность проводимого исследования. К ним относят определение:

• антител к рецептору ТТГ (анти-pTTГ);
• антител к тиреоглобулину (антиТГ);
• кальцитонина в сыворотке крови;
• тиреоглобулина;
• тиреотропного гормона (ТТГ);
• тироксина свободного (Т4 свободный);
• тироксина общего (Т4);
• трийодтиронина общего (Т3);
• трийодтиронина свободного (Т3 свободный).

Антитела к ТПО и беременность

Определение антител к тпо у матери во время беременности позволяет предположить развитие гипертиреоза у ребенка как в течение внутриутробного развития, так и после рождения.

Показанием к определению антител к тпо могут быть такие патологические явления, как выкидыш, преэклампсия, преждевременные роды и неудачные попытки искусственного оплодотворения.

Также рекомендуется определение антител к тиреопероксидазе у новорожденного при их наличии у матери во время беременности или послеродового тиреоидита. Выявление отклонений позволяет предотвратить их прогрессирование путем своевременного начала лечения.

Определение антител к гепатитам С, В, D, А, Е играет большое значение в выявлении и дифференциальной диагностике этих, большей частью, небезобидных заболеваний. Так, из всех этих заболеваний только гепатит А протекает в большинстве случаев безвредно, в то время как остальные вирусные гепатиты могут приводить к тяжелым, необратимым последствиям.

Как правило, основным проявлением этих заболеваний является повышение печеночных ферментов и выраженная интоксикация. Однако понять, какой именно из вирусов поразил печень, может позволить только анализ на антитела к гепатитам С, В, D, А или Е.

Антитела к вирусу гепатита А класса Ig M определяются одновременно с манифестацией болезни, после чего их титр нарастает на протяжении месяца, снижаясь до нормальных значений в течение 10-12 месяцев.

При гепатите В диагностическое значение имеет определение антител к HBs-антигену. Их наличие может быть обусловлено как перенесенным инфекционным заболеванием, так и эффективной вакцинацией.

Анти-HBs-антитела появляются на 4-12-й неделе после инфицирования и образуют комплексы с HBsAg, в связи чем они могут не определяться, что называется «серологическим пробелом», продолжительностью от недели до месяца. Титры антител достигают максимума к 6-12 месяцам, и сохраняют высокий уровень 5 лет и больше. Иногда антитела могут определяться в течение всей жизни. Также имеет диагностическое значение анализ на антитела HBsAg, anti-HBc IgM, anti-HBc, HBeAg и anti-HBe.

Гепатит В в 90% случаев заканчивается выздоровлением, однако в 10% случаев его течение приобретает хронический, прогрессирующий характер поражения печени, что заканчивается чаще всего циррозом.

В ряде случаев к вирусу гепатита В присоединяется вирус гепатита D, не способный существовать самостоятельно. В этом случае определяется anti-HD IgM.

Антитела к гепатиту С у большинства инфицированных определяются спустя 1-3 месяца после заражения, но также возможно их отсутствие больше года. Антитела могут не определяться в 5% случаев.

Антитела к гепатиту С классов IgM и IgG возникают в начале болезни и образуются к нуклеокапсиду. При длительном, латентном течении или повторной активации заболевания отмечается появление IgG в крови.

Антитела G класса в течение 8-10 лет после манифестации болезни определяются в высоких титрах, после чего их концентрация постепенно снижается. Тем не менее, анализ на антитела к гепатиту С остается положительным до конца жизни.

В отличие от гепатита В, гепатит С более предрасположен к хроническому течению, что наблюдается в 90% случаев заболевания. Исходы те же, что и при гепатите В.

Проведение анализа на антитела к вирусу гепатита Е особенно важно для диагностики заболевания во втором периоде беременности, так как оно в 40% случаев заканчивается смертью матери, и почти всегда – плода.

Антитела к вирусу иммунодефицита

Вирус иммунодефицита человека является одной из самых болезненных проблем современного общества. В настоящее время, распространение ВИЧ носит характер пандемии, число случаев смерти от СПИДа превысило 20 млн. человек, а число инфицированных ВИЧ – 50 млн.

Основными путями передачи вируса являются половой (во время незащищенного полового акта) и парентеральный (характерен для внутривенных инъекций инфицированными шприцами или иглами). Однако, на сегодняшний день огромной проблемой стало распространение вируса при таких обыденных действиях, как лечение зубов у стоматолога, процедурах маникюра, педикюра и пирсинга. Также в особой зоне риска находятся врачи, в особенности – хирурги, анестезиологи и акушеры-гинекологи.

Особенностью ВИЧ-инфекции является отсутствие специфических клинических симптомов, в результате чего манифестация носит характер простуды или мононуклеозоподобного синдрома. Поэтому решающее значение в постановке диагноза имеет определение антител к вирусу иммунодефицита.

Для диагностики ВИЧ применяются скрининговый и подтверждающий тесты. Потребность в таком разделении методов диагностики обусловлено большей стоимостью и потребностью в наличии специализированного оборудования для проведения подтверждающего теста, что затруднило бы массовое проведение анализа на антитела к вирусу иммунодефицита.

Алгоритм диагностики ВИЧ:

1. Проведение скринингового теста;
2. При положительном результате первого, проводится второй скрининговый тест;
3. При положительном втором скрининговом анализе показано проведение подтверждающего теста;
4. Положительный подтверждающий тест позволяет поставить диагноз ВИЧ инфекции.

Как правило, в качестве скрининга используется метод ИФА.

В качестве подтверждающего теста во всем мире признан метод иммунного блоттинга.

Проведение ПЦР, даже при выявлении антигенов возбудителя, не является основанием для постановки диагноза вируса иммунодефицита человека.

Согласно требованиям ВОЗ, анализ на иммунный блот принято считать положительным при обнаружении антител ко всем, или к двум из трех гликопротеинам ВИЧ (gp160, gp 120, gp 41). Таким образом, при наличии антител только к одному гликопротеину, результат считают сомнительным и показано проведение повторного исследования с использованием тест-системы другого производителя или серии. При получении очередного сомнительного результата рекомендовано проведение наблюдения в течение последующих 6 месяцев, с повторным проведением анализа через 90 дней.

Однако определение антител ранее определенного момента не имеет смысла в связи с особенностями функционирования иммунной системы. Эффективность анализа крови на антитела в большей степени зависит от того, в какой раз человек встречается с чужеродным агентом. Так, если человек встречается с возбудителем болезни повторно, гуморальный ответ не только развивается быстрее, но обладает большей эффективностью, что обусловлено большей степенью соответствия эпитопов антигенам.

Для первой встречи с чужеродным агентом наблюдается преимущественное повышение антител класса М, достигающее пика и, соответственно, наибольшей эффективности через 5-10 дней. Антитела G класса появляются еще позже.

Для повторной встречи с чужеродным агентом характерно более быстрое формирование иммунного ответа в течение 1-3 дней, которое характеризуется более эффективным приростом количества антител. Антитела G класса играют основную роль в развитии иммунной защиты. Кроме того, при определенной стимуляции, возникает дифференцировка плазматических клеток с производством антител класса А или Е.

Таким образом, брать анализ крови на антитела ранее, чем через 5 дней после инфицирования в большом количестве случаев не имеет смысла, что обусловлено слишком коротким сроком для активации иммунного ответа, хотя при повторной встрече с возбудителем, анализ определит положительные антитела уже на 1-2 сутки после инфицирования. Однако, в связи с тем, что у большинства заболеваний инкубационный период длится более суток, точно определить идеальный момент для определения антител практически невозможно, из-за чего рекомендуется оценка их уровня в начале и конце заболевания.

Методом, позволяющим определить количественные характеристики антител каждого типа в организме, является электрофорез. Его действие основано на разнице в поведении белков на после их помещения в электрическое поле. Этот метод позволяет определить, повышены антитела или нет, но не дает возможности выяснить, против какого чужеродного агента они образованы и, таким образом, показывает лишь общую картину.

Серологические реакции позволяют определить отсутствие или наличие антител, обладающих специфичностью в отношении искомого антигена в биологических жидкостях.

К ним относят реакции:

1. Агглютинации;
2. Преципитации;
3. Нейтрализации;
4. С участием комплемента;
5. С мечеными антителами или антигенами.

Агглютинацией называют связывание антигенов, связанных с крупными нерастворимыми частицами, такими как бактерии или эритроциты, при взаимодействии с антителами.

Агглютинация бывает следующих видов:

• прямая агглютинация (позволяет выявить антитела в сыворотке больного и проводится путем смешивания взвеси убитых микробов с кровью, что приводит к появлению хлопьевидного осадка);
• непрямая гемагглютинация (позволяет выявить антитела в изучаемом материале и проводится путем смешивания эритроцитов, на которых находятся фиксированные антигены, что приводит к появлению фестончатого осадка);
• реакция торможения гемагглютинации (в результате связывания антител с рецепторами вирусов, обладающих гемаглютинирующей способностью, склеивания эритроцитов животных, не происходит);
• реакция коагглютинации (антигены возбудителя определяются добавлением специально обработанных диагностической сывороткой стафилококков).

При реакции преципитации наблюдается выпадение в осадок комплексов антиген-антитело, где антигены должны быть растворимыми (не связанными с крупными, нерастворимыми частицами). После образования комплексов антиген-антитело выпадает осадок, называемый преципитатом. Положительным считается результат на антитела, при котором можно увидеть кольцо преципитата.

Реакцией нейтрализации называется блокирование повреждающего действия микробов или их токсинов после взаимодействия с иммунной сывороткой, что обусловлено их связыванием с антителами с образованием комплексов антиген-антитело.

Комплементом называют сложную систему врожденного гуморального ответа, которая после активации получает способность к опсонизации, облегчению фагоцитоза и цитолизу чужеродных агентов. При проведении реакции с участием комплемента используется его способность к взаимодействию с иммунными комплексами. Поэтому сначала смешивается интересуемая сыворотки с известными антигенами. Затем, если образовались комплексы антиген-антитело, белки комплемента исчерпываются. Если же образования комплексов не произошло, то система комплемента остается способной к активации. Для того, чтобы это выяснить, добавляются эритроциты и антиэритроцитарные антитела, которые связываются с образованием иммунных комплексов, после чего наблюдается гемолиз эритроцитов, обусловленный действием комплемента, или наблюдается хлопьевидный осадок, если активации не произошло.

Реакция с мечеными антителами или антигенами, или реакция иммунофлюоресценции основана на обработке изучаемого материала сывороткой, содержащей антигены или антитела, помеченные флюорохромами, что в случае образования иммунных комплексов дает возможность наблюдать свечение при освещении ультрафиолетовой лампой при изучении через микроскоп.

При применении не флюорохромов, а ферментов (пероксидазы или щелочной фосфатазы), метод называют иммуноферментным анализом. Результат оценивается по изменению окраски.

Радиоиммунологический метод позволяет определить наличие антител или антигенов, помеченных радионуклидами и их количество после взаимодействия с изучаемым материалом (антигенами или антителами в сыворотке пациента).

Моноклональные антитела и их применение

Одна клетка В-лимфоцитов способна производить антитела, комплементарные исключительно к одному антигену. Это было использовано для получения моноклональных антител, которые по праву можно считать одним из самых важных технических достижений в области иммунологии, с колоссальными перспективами для клинической медицины и научных исследований. Для того, чтобы получить моноклональные антитела, В-клетки от животного, иммунизированного антигеном, которые имеют короткий срок жизни, скрещивают с клетками миеломы (опухоли плазматических клеток), которые могут быть размножены бесконечное количество раз при обеспечении необходимых условий. Клетки, полученные путем такого слияния, называют гибридомами. Из популяции полученных гибридом можно выбрать и клонировать непрерывно растущие клетки, которые секретируют нужные антитела, которые называют моноклональными.

Огромное количество вариантов синтезируемых антител позволяет подобрать практически любые моноклональные антитела против практически любого антигена. Однако на пути широкого применения этого метода имелись определенные препятствия. Так как вещества, синтезируемые в чужом организме, чужеродны и вызывают иммунный ответ, повторное введение тех же препаратов не вызывало преследуемого эффекта. Впоследствии эта проблема была решена сохранением вариабельных областей, отвечающих за их соответствие антигенам, с заменой константных участков на человеческие.

Совсем недавно моноклональные антитела были синтезированы с использованием технологии рекомбинантной ДНК, кодирующей антитела человека. Это позволило выбирать антитела, имеющих желаемые Fab-фрагменты.

Моноклональные антитела широко применяются в качестве терапевтических и диагностических средств в борьбе со многими заболеваниями людей.

Полные антитела - это антитела, которые имеют 2 и более активных центра. После их соединения с антигеном образуется видимый осадок (агглютинат, преципитат).

Неполные антитела - это антитела, которые имеют один активный центр. Они способны связываться с антигенами, но это не сопровождается видимыми изменениями.

Нормальные антитела - это антитела, которые постоянно имеются у человека и животных без попадания в организм антигена (без иммунизации). К ним относятся, например, антитела плазмы крови (агглютинины), которые определяют деление крови человека на 4 группы.

Лекция№15 Иммунная система организма человека. Антителообразование. Аллергия.

Иммунная система – это система органов и клеток, которые осуществляют защиту от генетически чужеродных агентов (антигенов), в том числе микробных.

Иммунная система состоит из лимфоидной ткани . Основные клетки этой ткани называются лимфоцитами . Общая масса лимфоидной ткани в организме взрослого человека – 1,5 – 2кг, а количество лимфоцитов – 10 13 . Иммунная система включает лимфоидные органы, которые имеют определенную внутреннюю структуру и клетки, которые циркулируют в крови и лимфе.

Лимфоидные ткани делят на центральные и периферические .

Центральные органы : тимус (вилочковая железа) и костный мозг . У птиц центральный орган – сумка (бурса) Фабрициуса . В центральных органах происходит образование, созревание и "обучение" лимфоцитов, которые после этого (после приобретения иммунной компетентности) поступают в циркуляцию (в кровь и лимфу) и заселяют периферические органы. В тимусе образуются Т-лимфоциты , а в костном мозге и в сумке Фабрициуса – В-лимфоциты .

Периферические органы: селезенка, лимфатические узлы, небные миндалины, аденоиды, апендикс, пейеровы бляшки кишечника, групповые лимфатические фолликулы мочеполового, дыхательного трактов и др. органов, кровь и лимфа. Клетки этих органов под влиянием антигенов непосредственно осуществляют все реакции клеточного и гуморального иммунитета (образование антител, сенсибилизированных Т-лимфоцитов), поэтому эти клетки называются иммунокомпетентными или иммуноцитами .

К иммунокомпетентным клеткам относятся 3 вида клеток: макрофаги, Т-лимфоциты и В-лимфоциты.

Эти клетки образуются из общей стволовой клетки костного мозга, которая дает начало предшественнику макрофага и лимфоидной стволовой клетке. Предшественник макрофага затем превращается в макрофаг-моноцит, а лимфоидная стволовая клетка дает начало предшественнику Т-лимфоцитов и предшественнику В-лимфоцитов. Предшественники Т-лимфоцитов мигрируют в тимус, где они "созревают" и образуются все разновидности Т-лимфоцитов. "Созревание" В-лимфоцитов происходит в костном мозге, где они становятся зрелыми костномозговыми В-лимфоцитами. Под влиянием антигена они превращаются в плазматические клетки, которые синтезируют специфические антитела против этих антигенов.

На поверхности Т- и В-лимфоцитов находятся различные рецепторы (белковые структуры), которые являются антигенами этих лимфоцитов и по которым различные разновидности лимфоцитов отличаются друг от друга. По этим антигенам можно распознать различные разновидности лимфоцитов, поэтому их называют маркерами или СД-антигенами (международное название).

По функциям и СД-антигенам лимфоциты разделяют на следующие разновидности или субпопуляции.

Т-хелперы (СД4) – распознают антиген, затем стимулируют образование плазматических клеток и выработку ими антител, активируют макрофаги (участвуют в гуморальном иммунном ответе ).

Т-киллеры или цитотоксические Т-лимфоциты - ЦТЛ (СД8 и СД3 ) – распознают антигены и уничтожают клетки - мишени, несущие антигены, опухолевые клетки, клетки, пораженные вирусами, без участия антител и комплемента при помощи выделяемых ими ферментов-токсинов(лимфотоксинов) (участвуют в клеточном иммунном ответе).

Т-супрессоры (СД8) – снижают активность иммунокомпетентных клеток, тем самым, регулируя интенсивность иммунного ответа, участвуют в формировании иммунологической толерантности.

Т-индукторы (СД4) – распознают антиген и увеличивают активность иммунокомпетентных клеток (хелперов, супрессоров, киллеров, макрофагов), регулируя интенсивность иммунного ответа.

Т-эффекторы ГЗТ (гиперчувствительности замедленного типа) (СД8 ) – участвуют в аллергических реакциях замедленного (клеточного) типа, в отличие от ЦТЛ не обладают прямой цитотоксичностью, а разрушают клетки-мишени опосредованно (через другие клетки).

Т-клетки памяти – долго сохраняют "память" об антигене, при повторном попадании в организм этого антигена способствуют более быстрому и сильному иммунному ответу.

В-лимфоциты – участвуют в образовании антител (гуморальном иммунитете), под влиянием антигена превращаются в плазматические клетки , которые образуют антитела против этого антигена (их маркерами – СД-антигенами - являются эти антитела).

В-клетки памяти – как и Т-клетки памяти.

NK - клетки (естественные киллеры) (их антигены отличаются от Т- и В-лимфоцитов) – "убивают" опухолевые и чужеродные клетки, участвуют в отторжении пересаженных органов, не обладают специфичностью.

Нулевые клетки (не имеют антигенов Т- и В-клеток) – незрелые формы лимфоцитов, обладающие цитотоксичностью (способны "убивать"клетки-мишени).

При любой форме иммунного ответа происходит взаимодействие 3-х типов клеток : макрофагов, Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов .

Гуморальный иммунный ответ – это выработка иммуноглобулинов (специфических антител). В немучаствуют макрофаги, Т-хелперы и В-лимфоциты .

Основные стадии гуморального иммунного ответа.

1) поглощение макрофагом антигена (например, микробной клетки), его переваривание, "выставление" на своей поверхности не переваренных частей антигена (они сохраняют чужеродность) для их распознавания Т- и В-лимфоцитами;

2) распознавание антигена Т-хелпером (белковая часть) при непосредственном контакте с макрофагом;

3) распознавание антигена В-лимфоцитами (детерминантная часть) при непосредственном контакте с макрофагом;

4) передача неспецифического сигнала активации на В-лимфоцит через медиаторы (вещества): макрофаг вырабатывает интерлейкин-1 (ИЛ-1), который воздействует на Т-хелпер и побуждает его синтезировать и выделять интерлейкин-2 (ИЛ-2), который воздействует на В-лимфоцит;

5) превращение В-лимфоцита в плазматическую клетку под действием ИЛ-2 и после получения информации от макрофага об антигенной детерминанте;

6) синтез плазматическими клетками специфических антител против попавшего в организм антигена и выделение этих антител в кровь (антитела будут специфически связываться с антигенами и нейтрализовать их действие на организм).

Таким образом, для полноценного гуморального ответа В-клетки должны получить 2 сигнала активации:

1) специфический сигнал – информация об антигенной детерминанте, которую В-клетка получает от макрофага;

2) неспецифический сигнал – интерлейкин-2, который В-клетка получает от Т-хелпера.

Клеточный иммунный ответ лежит в основе противоопухолевого, противовирусного иммунитета и в реакциях отторжения трансплантанта, т.е. трансплантационного иммунитета. В клеточном иммунном ответе участвуют макрофаги, Т-индукторы и ЦТЛ.

Основные стадии клеточного иммунного ответа такие же, как и при гуморальном ответе. Отличие заключается в том, что вместо Т-хелпером участвуют Т-индукторы, а вместо В-лимфоцитов – ЦТЛ. Т-индукторы активируют ЦТЛ при помощи ИЛ-2. Активированные ЦТЛ при повторном попадании антигена в организм "узнают" этот антиген на микробной клетке, связываются с ним и только при тесном контакте с клеткой-мишенью "убивают" эту клетку. ЦТЛ вырабатывает белок перфорин , который образует в оболочке микробной клетки поры (дырки), что ведет к гибели клетки.

Антителообразование в организме человека происходит в несколько стадий.

1. Латентная фаза – происходит распознавание антигена при взаимодействии макрофагов, Т- и В-лимфоцитов и превращение В-лимфоцитов в плазматические клетки, которые начинают синтезировать специфические антитела, но антитела еще не выделяются в кровь.

2. Логарифмическая фаза – антитела выделяются плазматическими клетками в лимфу и кровь и их количество постепенно увеличивается.

3. Стационарная фаза – количество антител достигает максимума.

4. Фаза снижения уровня антител – количество антител постепенно уменьшается.

При первичном иммунном ответе (антиген впервые попадает в организм) латентная фаза длится 3 –5 суток, логарифмическая – 7 – 15 суток, стационарная – 15 – 30 суток, фаза снижения – 1 – 6 мес. и более. При первичном иммунном ответе вначале синтезируются Ig M, а затем Ig G, позже Ig A.

При вторичном иммунном ответе (антиген попадает в организм повторно) длительность фаз изменяется: более короткий латентный период (неск. часов – 1-2 дня), более быстрый подъем антител в крови до более высокого уровня (выше в 3 раза), более медленное снижение уровня антител (в течение нескольких лет). При вторичном иммунном ответе сразу же синтезируются Ig G.

Эти различия между первичным и вторичным иммунным ответом объясняются тем, что после первичного иммунного ответа образуются В- и Т-клетки памяти о данном антигене. Клетки-памяти вырабатывают рецепторы к этому антигену, поэтому сохраняют способность реагировать на данный антиген. При его повторном попадании в организм более активно и быстро формируется иммунный ответ.

Аллергия – это повышенная чувствительность (гиперчувствительность) к антигенам-аллергенам. При их повторном попадании в организм происходит повреждение собственных тканей, в основе которого лежат иммунные реакции. Антигены, которые вызывают аллергические реакции, называются аллергенами. Различают экзоаллергены , попадающие в организм из внешней среды, и эндоаллергены , образующие внутри организма. Экзоаллергены бывают инфекционного и неинфекционного происхождения. Экзоаллергены инфекционного происхождения – это аллергены микроорганизмов, среди них самыми сильными аллергенами являются аллергены грибов, бактерий, вирусов. Среди неинфекционных аллергенов различают бытовые, эпидермальные (волосы, перхоть,шерсть), лекарственные (пенициллин и др. антибиотики), промышленные (формалин,бензол), пищевые, растительные (пыльца). Эндоаллергены образуются при каких-либо воздействиях на организм в клетках самого организма.

Аллергические реакции бывают 2-х видов:

-гиперчувствительность немедленного типа (ГНТ);

-гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ).

Реакции ГНТ появляются через 20-30 мин после повторного попадания аллергена. Реакции ГЗТ появляются через 6 – 8 часов и позже. Различны механизмы ГНТ и ГЗТ. ГНТ связана с выработкой антител (гуморальный ответ), ГЗТ – с клеточными реакциями (клеточный ответ).

Различают ГНТ 3-х типов: I тип – IgE -опосредованные реакции ; II тип – цитотоксические реакции ; III тип – реакции иммунных комплексов .

Реакции I типа чаще всего вызываются экзоаллергенами и связаны с выработкой IgE. При первичном попадании аллергена в организм, происходит образование IgE, которые обладают цитотропностью и связываются с базофилами и тучными клетками соединительной ткани. Накопление специфичных к данному аллергену антител называется сенсибилизацией. После сенсибилизации (накопления достаточного количества антител) при повторном попадании аллергена, вызвавшего образование этих антител, т.е. IgE, аллерген связывается с IgE, находящимися на поверхности тучных и др. клеток. В результате этого происходит разрушение этих клеток и выделение из них особых веществ - медиаторов (гистамина, серотонина, гепарина). Медиаторы действуют на гладкую мускулатуру кишечника, бронхов, мочевого пузыря (вызывают ее сокращение), кровеносные сосуды (повышают проницаемость стенок) и др. Эти изменения сопровождаются определенными клиническими проявлениями (болезненными состояниями): анафилактический шок, атопические болезни – бронхиальная астма, ринит, дерматит, детская экзема, пищевые и лекарственные аллергии. При анафилактическом шоке наблюдается одышка, удушье, слабость, беспокойство, судороги, непроизвольное мочеиспускание и дефекация.

Для предупреждения анафилактического шока проводят десенсибидизацию для уменьшенияколичества антител в организме. Для этого вводятся малые дозы антигена-аллергена, которые связывают и выводят из циркуляции часть антител. Впервые способ десенсибилизации предложил русский ученый А. Безредка, поэтому он называется способом Безредки. Для этого человеку, который ранее получал антигенный препарат (вакцину, сыворотку, антибиотики), при его повторном введении вначале вводят небольшую дозу (0,01 – 0,1 мл), а через 1 – 1,5 часа – основную дозу.

Реакции II типа вызываются эндоаллергенами и вызваны образованием антител к поверхностным структурам собственных клеток крови и тканей (печени, почек, сердца, мозга). В этих реакциях участвуют IgG, в меньшей степени IgM. Образующиеся антитела связываются с компонентами собственных клеток. В результате образования комплексов антиген-антитело активируется комплемент, что приводит к лизису клеток-мишеней, в данном случае клеток собственного организма. Развиваются аллергические поражения сердца, печени, легких, мозга, кожи и др.

Реакции III типа связаны с длительной циркуляцией в крови иммунных комплексов, т.е. комплексов антиген-антитело. Они вызываются эндо- и экзоаллергенами. В них участвуют IgG и IgM. В норме иммунные комплексы разрушаются фагоцитами. При определенных условиях(например, дефект фагоцитарной системы) иммунные комплексы не разрушаются, накапливаются и длительно циркулируют в крови. Эти комплексы осаждаются на стенках кровеносных сосудов и других органах и тканях. Эти комплексы активируют комплемент, который разрушает стенки сосудов, органы и ткани. В результате развиваются различные заболевания. К ним относятся сывороточная болезнь, ревматоидный артрит, системная красная волчанка, коллагенозы и др.

Сывороточная болезнь возникает при разовом парентеральном введении больших дозсывороточныхи других белковых препаратов через 10 – 15 дней после введения. К этому времени образуются антитела к белкам сывороточного препарата и образуются комплексы антиген-антитело. Сывороточная болезнь проявляется в виде отека кожи и слизистых оболочек, повышения температуры тела, припухания суставов, сыпи, зуда кожи. Профилактика сывороточной болезни проводится по способу Безредке.

Реакции IV типа – гиперчувствительность замедленного типа. В основе этих реакций лежит клеточный иммунный ответ. Они развиваются через 24 – 48 часов. Механизм этих реакций заключается в накоплении (сенсибилизации) специфических Т-хелперов под влиянием антигена. Т-хелперы выделяют ИЛ-2, который активирует макрофаги, и они разрушают антиген-аллерген. Аллергенами являются возбудители некоторых инфекций (туберкулеза, бруцеллеза, туляремии), гаптены и некоторые белки. Реакции IV типа развиваются при туберкулезе, бруцеллезе, туляремии, сибирской язве и др. Клинически они проявляются в виде воспаления в месте введения аллергена при туберкулиновой реакции, в виде замедленной аллергии к белкам и контактной аллергии.

Туберкулиновая реакция возникает через 5-6 часов после внутрикожного введения туберкулина и достигает максимума через 24 – 48 часов. Выражается эта реакция в виде покраснения, припухлости и уплотнения на месте введения туберкулина. Эта реакция используется для диагностики заболевания туберкулезом и называется аллергической пробой . Такие же аллергические пробы с другими аллергенами используются для диагностики таких заболеваний, как бруцеллез, сибирская язва, туляремия и др.

Замедленная аллергия развивается при сенсибилизации малыми дозами белковых антигенов. Реакция возникает через 5 дней и длится 2-3 недели.

Контактная аллергия развивается при действии низкомолекулярных органических и неорганических веществ, которые в организме соединяются с белками. Она возникает при длительном контакте с химическими веществами: фармацевтическими препаратами, красками, косметическими препаратами. Проявляется в виде дерматитов – поражений поверхностных слоев кожи.

Биологические свойства антител

Антителами называются специфические антимикробные гликопротеины, которые являются гуморальными факторами приобретённого иммунитета, относятся к фракции γ-глобулинов плазмы крови и являются продуктами секреторной деятельности плазматических клеток (конечной стадии дифференцировки В-лимфоцитов).

Микрофотография плазматической клетки приведена на рис. 11.

Антитела характеризуются такими фундаментальными свойствами: специфичностью, валентностью, авидностью и афинностью.

Cпецифичность – способность распознавать только один антиген из множества;

Валентность – способность к одновременному взаимодействию с определённым количеством одинаковых антигенов;

Афинность – степень сродства антигенсвязывающего сайта антитела с антигенной детерминантой возбудителя;

Авидность – сила связи между антителом и распознанными антигенами.

1. Нейтрализация вирусов.

Связываются с вирусами, предотвращая их проникновение в клетку и последующую репликацию.

Вызывают агрегацию вирусов с последующим поглощением фагоцитирующими клетками.

Взаимодействуют с клеточными рецепторами вирусов, ингибируя связывание вирусов с клеточной поверхностью.

Блокируют межклеточное проникновение вирусов.

Обладают ферментативными свойствами.

Антитела особенно эффективны в тех случаях, когда вирусу для достижения клеток-мишеней необходимо пройти через кровоток. Тогда эффективными могут быть даже относительно низкие концентрации антител в крови. Поэтому наиболее очевидный защитный эффект антител наблюдается при инфекциях с длительным инкубационным периодом, когда вирус, прежде чем достичь клеток-мишеней, должен пройти через кровоток, где может быть нейтрализован даже очень небольшим количеством специфических антител.

2. Нейтрализация токсинов.

Циркулирующие в крови продукты бактериального происхождения и другие экзотоксины (например, фосфолипаза пчелиного яда) связываются направленными против них антителами. Антитело, присоединившись вблизи активного центра токсина, может блокировать его взаимодействие с субстратом. Даже связываясь с токсином на некотором расстоянии от его активного центра, антитела могут подавить токсичность в результате аллостерических конформационных изменений. В комплексе с антителами токсин теряет способность к диффузии в тканях и может стать объектом фагоцитоза.

3. Опсонизация бактерий.

Опсонизация - связывание антител с антигенами поверхности бактерий. В результате опсонизации бактерии становятся объектом интенсивного поглощения фагоцитирующими клетками. Действие антител усиливается белками системы комплемента, которые также связываются с бактериальной поверхностью. (Белки системы комплемента могут и самостоятельно опсонизировать бактерии.) На фагоцитирующих клетках имеются рецепторы для Fc-участков иммуноглобулинов и рецепторы для белков комплемента.

4. Активация системы комплемента.

Связываясь с поверхностью клеток, антитела классов IgM и IgG приобретают способность инициировать классический путь активации комплемента. Активация приводит к отложению белков системы комплемента на поверхности бактериальных клеток, образованию пор в мембране и гибели клеток с последующим привлечением к месту событий фагоцитов и поглощением клеток фагоцитами.

5. Антителозависимая клеточная цитотоксичность.

Антитела, связавшиеся с чужеродными антигенами на поверхности клеток, приобретают способность взаимодействовать с Fc-рецепторами на мембране цитотоксических клеток (естественные киллеры, цитотоксические Т-лимфоциты). Примерами мембранных чужеродных антигенов могут служить вирусные белки, появляющиеся на поверхности вирусинфицированных клеток. В результате взаимодействия антигена с антителом и Fc-рецептором образуется мостик, сближающий клетку-мишень и цитотоксическую клетку. После сближения цитотоксическая клетка убивает клетку-мишень.

7. Иммунорегуляторная функция.

Антиидиотипические антитела взаимодействуют с активными центрами других антител (идиотипами) и осуществляют регуляцию гуморального иммунного ответа, подавляя их активность.

8. Проникновение через плаценту.

В эмбриональный период и первые несколько месяцев жизни, когда собственная иммунная система ребенка еще недостаточно развита, защиту от инфекций обеспечивают материнские антитела, проникающие через плаценту или поступающие с молозивом и всасывающиеся в кишечнике. Через плаценту в кровь плода поступают антитела класса IgG.

Основные классы иммуноглобулинов грудного молока - это IgG и секреторный IgA. Они не всасываются в кишечнике, а остаются в нем, защищая слизистые оболочки. Эти антитела направлены к бактериальным и вирусным антигенам, часто попадающим в кишечник.

Вопрос 7. Иммуноглобулины . Антигенное строение иммуноглобулинов Особенности строения различных участков молекулы иммуноглобулина, равно как и иммуноглобулинов различных классов (подклассов), находят отражение в их антигенной структуре. Помимо важной роли антигенного анализа иммуноглобулинов для сравнительного изучения их строения и понимания структурных основ генетически детерминированной неоднородности, антигенный анализ иммуноглобулинов позволил раскрыть важные принципы дифференцнровки клеток В-ряда и регуляции иммунного ответа. Наконец, на основе данных об антигенном строении иммуноглобулинов созданы методы их качественного н количественного определения, а также многие так называемые непрямые иммунологические (серологические) методы. Все антигенные детерминанты иммуноглобулинов подразделяют на четыре типа. Одни из них характерны для изотипа иммуноглобулина. Они отражают в своем строении классоспецифические особенности иммуноглобулина данного биологического вида. Другие зависят от особенностей строения тех участков молекулы иммуноглобулина данного класса (подкласса), которыми этот белок от одного индивидуума данного биологического вида отличается от белка, синтезируемого другим индивидуумом того же вида. Тем самым эти антигенные детерминанты характеризуют аллотип иммуноглобулина. Третьи антигенные детерминанты отражают те особенности строения иммуноглобулина, которыми белок, продуцируемый одним клоном клеток, отличается от белка того же класса (подкласса), продуцируемого другим клоном клеток того же индивидуума. Эти детерминанты определяют идиотип иммуноглобулина. Наконец, четвертый тип антигенных детерминант характеризует наиболее общие, независимые от индивидуальной или клоновой принадлежности свойства иммуноглобулинов данного вида, принадлежащие к любому классу (подклассу). Эти детерминанты характеризуют вариотип иммуноглобулинов. Ниже рассматриваются способы выявления, локализации и строение перечисленных антигенных детерминант. Изотипические детерминанты. Для выявления этих детерминант получают антитела, иммунизируя соответствующими иммуноглобулинами данного вида особей другого биологического вида. Тем самым выявляются различия в строении соответствующих иммуноглобулинов донора и реципиента. Из этого вытекает, что чем более удалены друг от друга на эволюционной лестнице донор и реципиент, тем большее число изотипических детерминант удастся выявить в иммуноглобулине донора. Так, для наиболее полного анализа нзотнпа иммуноглобулинов млекопитающих следует получать антитела против них, иммунизируя птиц. На практике однако чаще используют антиизотипические сыворотки млекопитающих. При этом для анализа того или иного иммуноглобулина целесообразно использовать антисыворотки от различных в видовом отношении реципиентов. Видовые различия в ответе на изотипические детерминанты отчетливо видны из следующего примера: при иммунизации козы IgG кролика образуются почти исключительно антитела против детерминант Fc-участка молекулы; при иммунизации тем же белком осла образуется примерно равное количество антител против Fab- и Fc-участков молекулы.

Вопрос 8. Полные антитела. Неполные антитела. Fc-фрагмент антитела.

Fab-фрагменты антитела взаимодействуют с антигенными детерминантами. Аг-связывающий центр комплементарен эпитопу Аг (принцип ключ-замок). Связывание Аг с AT нековалентно и обратимо. А

Полные антитела (в частности, IgM, lgG) вызывают агрегацию Аг, видимую невооружённым глазом (например, РА бактерий).

Неполные антитела содержат один Аг-связывающий центр и, поэтому, одновалентны (например, антитела, вырабатываемые при бруцеллёзе). Второй Аг-связывающий центр у подобных Ig экранирован различными структурами либо обладает низкой авидностью.

Неполные антитела функционально дефектны, так как не способны агрегировать Аг. Неполные AT могут связывать эпитопы Аг, препятствуя контакту с ними полных антител; поэтому их также называют блокирующими антителами.

Константные участки тяжёлых цепей определяют характер взаимодействий антитела с клетками и молекулами иммунной системы, в частности специфичность связывания молекулы Ig с клетками-эффекторами (например, фагоцитами, тучными клетками), несущими на своей поверхности рецепторы к Fc-фрагменту.

Fc-фрагмент определяет также эффекторные функции антитела (например, активацию комплемента). Для реализации этих свойств сразу после связывания Аг Fab-фрагментами происходят конформационные изменения структуры Fc-фрагментов. Пространственно изменённые Fc-фрагменты распознают фагоциты, именно они способствуют фиксации С1а-компонента комплемента и запуску комплементарного каскада по классическому пути. В противном случае ни клетки, ни эффекторные молекулы были бы не в состоянии отличить интактные AT или антитела, связавшие Аг.

Вопросы 9. Фазы образования антител

Образование антител протекает после первого попадания в организм антигена.

Фаза индукции, 7-10 дней. В это время происходит взаимодействие с антигеном макрофагов, Т-лпмфоцитов-хелперов, их кооперация с В-лимфоцптами, пролиферация последних с трансформацией в плазматические клетки, синтезирующие антитела. Фаза продукции, 7-10 дней (наработка антител).

Особенность работы В-клеток (вернее, плазматических клеток) в том, что вырабатываемые ими антитела, даже против одного и того же антигена, относятся к разным классам иммуноглобулинов. В то же время известно, что одна клетка продуцирует антитела одного класса. Но может происходить переключение программы биосинтеза на другой белок - другое антитело, под влиянием антигена.

Все антитела относятся к циркулирующим антителам, обусловливающим ГЧНТ (гиперергическую реакцию гуморального иммунитета). В аллергии ГЧЗТ (гиперергической реакции клеточного иммунитета) участвуют сенсибилизированные Т-лимфоциты, выделяющие активные факторы - лимфокины.

1. Опсонизация (иммунный фагоцитоз).

2. Антитоксический эффект.

3. Активация комплемента.

4. Нейтрализация.

5. Циркулирующие комплексы (связанные растворимые Аг образуют комплесы с Ат, которые выводятся из организма с желчью и мочой).

6. Антителозависимая цитотоксичность.

Динамика антителообразования.

Серологические реакции в лабораторной диагностике инфекционных заболеваний.

В защите организма от чужеродных антигенов решающую роль играют иммунологические механизмы, осуществляющиеся антителами и иммунокомпетентными клетками. Основа иммунологических механизмов – специфическая реакция между антителами или лимфоцитами (образовавшихся под воздействием попавшего в организм антигена) и антигена. Главная функция антител – связывание антигена и его дальнейшее выведение из организма.

Однако такие реакции между антителами и антигенами могут происходить и вне организма (in vitro) в присутствии электролита и возможны лишь при наличии комплементарности (структурного сходства, сродства) антигена и антитела.

Имея специфические антитела против определенного антигена можно распознать и выявить его среди других антигенов, а в сыворотке крови антитела против известного антигена.

Реакция антиген-антитело in vitro сопровождается возникновением определенного феномена – агглютинации, преципитации, лизиса.

Таким образом все серологические реакции используются с двумя целями:

выявление антител в сыворотке больного с помощью стандартных антигенов-диагностикумов (для серологической диагностики инфекционных болезней );

для выявления неизвестных антигенов по известным стандартным сывороткам, содержащим антитела определенной специфичности (для серологической идентификации возбудителей ).

Например, если сыворотка больного реагирует с конкретным микробным антигеном – значит в сыворотке больного есть антитела против данного микроорганизма.

Серологическая диагностика – берут стандартный антиген (диагностикум), представляющий собой инактивированные или живые бактерии, вирусы или же их антигены (компоненты) в изотоническом растворе.

Серологическая идентификация – используют стандартные иммунные сыворотки, которые получают от иммунизированных животных (в крови животных в результате многократной иммунизации возбудителем появляется большое количество антител).

Агглютинация.

Агглютинация – серологическая реакция между антителами (агглютининами) и антигенами (агглютининогенами), размещенными на поверхности бактериальной клетки, а в результате образуется комплекс антиген-антитело (агглютинат).

Механизм агглютинации – под влиянием ионов электролита уменьшается негативный поверхностный заряд бактериальной клетки и следовательно они могут сблизиться на такое расстояние при котором возникает склеивание бактерий.

Макро- и микроскопический вид агглютината :

О-агглютинация (соматическая) – мелкозернистая, при микроскопии – бактерии склеиваются полюсами клеток, образуя сеть.

Vi-агглютинация (капсульная) – мелкозернистая, при микроскопии - склеивание бактерий происходит всей поверхностью клетки.

Н-агглютинация (жгутиковая) – агглютинины взаимодействуют с жгутиками обездвиживая бактерии, при микроскопии – крупнохлопчатая, склеивание бактериальных клеток в области жгутиков.

Реакция агглютинации используется для определения антител в сыворотке крови больных, например, при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реакция Видаля) других инфекционных болезнях, а также при определении возбудителя, выделенного от больного. Эту же реакцию применяют для определения групп крови с использованием моноклональных антител против аллоантигенов эритроцитов.

Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировочная, непрямая и др.

Для определения у больного антител ставят развернутую реакцию агглютинации : к разведениям сыворотки крови больного добавляют взвесь убитых микробов (диагностикум) и через несколько часов инкубации при 37°С отмечают наибольше разведение (титр) сыворотки, при котором произошла агглютинация, т.е. образовался осадок.

Характер и скорость агглютинации зависят от вида антигена и антител.

Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентировочную реакцию агглютинации, применяя диагностические антитела, т.е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К 1 капле диагностической иммунной сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больного. Если появляется хлопьевидный осадок, то реакцию проводят в пробирках с увеличивающимися разведениями диагностической сыворотки, добавлял в каждую дозу сыворотки 2-З капли взвеси возбудителя. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмечается в разведении, близком к титру диагностической сыворотки. В контролях (сыворотка, разведенная изотоническим раствором хлорида натрия, или взвесь микробов в том же растворе) осадок в виде хлопьев должен отсутствовать.

Разные родственные бактерии могут агглютинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудняет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыворотками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыворотках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии. Получение таким способом монорецепторных диагностических агглютинирующих сывороток было предложено А.Кастелляни (1902). Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) основана на использовании эритроцитов (или латекса) с адсорбированными на их поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соответствующими антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка. РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гормона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительности к лекарственным препаратам и гормонам и в некоторых других случаях. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на блокаде, подавлении вирусов антителами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты. РТГА применяют для диагностики многих вирусных болезней, возбудители которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещевого энцефалита и др.) могут агглютинировать эритроциты различных животных. Реакцию агглютинации для определения групп крови применяют для установления системы АВО с помощью РА эритроцитов, используя антитела к группам крови А(II), В(III). Контролем служит сыворотка, не содержащая антител, т.е. АВ(IV) группы крови, антигены, содержащиеся в эритроцитах групп А(II), В(III); отрицательный контроль не содержит антигенов, т.е. используют эритроциты группы 0 (I). В реакции агглютинации для определения резус-фактора используют антирезусные сыворотки (не менее двух различных серий). При наличии на мембране исследуемых эритроцитов резус-антигена происходит агглютинация этих клеток. Контролем служат стандартные резус-положительные и резус-отрицательные эритроциты всех групп крови.

Реакцию агглютинации для определения антирезусных антител (непрямую реакцию Кумбса) применяют у больных при внутрисосудистом гемолизе. У некоторых таких больных обнаруживают антирезусные антитела, которые являются неполными. Они специфически взаимодействуют с резус-положительными эритроцитами, но не вызывают их агглютинации. Наличие таких неполных антител определяют в непрямой реакции Кумбса. Для этого в систему антирезусные антитела + резус-положительные эритроциты добавляют антиглобулиновую сыворотку (антитела против иммуноглобулинов человека), что вызывает агглютинацию эритроцитов. С помощью реакции Кумбса диагностируют: патологические состояния, связанные с внутрисосудистым лизисом эритроцитов иммунного генеза, например гемолитическую болезнь новорожденных: эритроциты резус-положительного плода соединяются с циркулирующими в крови неполными антителами к резус-фактору, которые перешли через плаценту от резус-отрицательной матери.

Реакция коагглютинации - разновидность РА: клетки возбудителя определяют с помощью стафилококков, предварительно обработанных иммунной диагностической сывороткой. Стафилококки, содержащие белокА, имеющий сродство к иммуноглобулинам, неспецифически адсорбируют антимикробные антитела, которые затем взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба.

Схема постановки реакции агглютинации.

Компоненты	Пробирки
Изотонический раствор NaCl (физиологический раствор)
Сыворотка больного в разведении 1:5 (стартовое разведение)
Разведение
Диагностикум, капли

КС – контроль сыворотки; КД – контроль диагностикума

Титр сыворотки - наибольше разведение сыворотки, при котором произошло образование агглютината, т.е. образовался осадок. Фактически – это разведение сыворотки в последней пробирке, где произошло образование агглютината.

3367 0

Одной из основных функций иммунной системы является продукция растворимых белков, свободно циркулирующих и обладающих особыми свойствами, необходимыми для работы иммунной системы и защиты от чужеродных субстанций. Эти растворимые белки - антитела - относятся к классу белков, называемых глобулинами в связи с их глобулярной структурой.

Первоначально из-за способности к перемещению при электрофорезе их назвали γ-глобулинами (в отличие от более быстро перемещающихся альбумина, α-глобулинов и β-глобулинов). Теперь они известны под общим названием иммуноглобулины (Ig).

Иммуноглобулины экспрессируются в виде секретируемых и мембранных форм. Секретируемые антитела вырабатываются В-клетками на терминальной стадии дифференцировки - плазматическими клетками, которые служат фабриками по производству антител и располагаются в основном в костном мозге. Мембранные антитела присутствуют на поверхности В-клеток, где они служат антигенспецифичными рецепторами. Мембранная форма антитела, ассоциированная с гетеродимером, называемым Iga/Igp, образует В-клеточный рецептор (BCR). Гетеродимер Iga/Igp проводит внутрь клетки сигналы, связанные с активацией В-лимфоцита.

Структура иммуноглобулинов определяет некоторые свойства, необходимые для их участия в иммунном ответе. Двумя наиболее важными из этих свойств являются специфичность и биологическая активность. Как будет показано далее, специфичность обусловлена определенной областью молекулы антитела, которая содержит гипервариабельный участок, или участок, определяющий комплементарность (CDR). Этот участок ограничивает связь антитела только с теми субстанциями, которые содержат одну определенную антигенную структуру.

Существование огромного разнообразия потенциальных антигенных детерминант, или эпитопов, обусловило эволюцию системы в направлении продукции такого спектра молекул антител, чтобы каждая из них была способна комбинироваться со строго определенной (частной) антигенной структурой. Все вместе - репертуар антител - характеризуется большим разнообразием в отношении типов молекулярных структур, с которыми они способны реагировать, однако по отдельности эти антитела проявляют высокий уровень специфичности, поскольку одно антитело способно реагировать только с одной определенной антигенной структурой.

Хотя количество антител разных специфичностей, способных реагировать со многими структурными единицами, очень велико, биологические эффекты таких реакций довольно немногочисленны. К ним относятся: нейтрализация токсинов, иммобилизация микроорганизмов, нейтрализация вирусной активности, агглютинация (скопление) микроорганизмов или антигенных частиц, связывание растворимого антигена, ведущее к образованию преципитатов (которые активно элиминируются фагоцитирующими клетками) и активация сывороточного комплемента для усиления лизиса микроорганизмов или фагоцитоза и деструкции, осуществляемых либо фагоцитирующими клетками, либо лимфоцитами-киллерами.

Еще одним важным биологическим свойством антител является их способность проникать через плаценту от матери к плоду. Не все молекулы антител способны одинаково выполнять все эти биологические функции.

Различия в биологических функциях антител определяются их изотипической структурой (классом). В то время как одна часть молекулы антитела должна легко подвергаться адаптации, чтобы обеспечить возможность приспосабливаться к "большому числу эпитопов, другая часть должна легко адаптироваться для выполнения биологических функций, общих для многих антител.

Определение структуры антител, установление взаимосвязи между их структурой и функцией и выявление генетической организации молекул иммуноглобулинов в значительной степени способствовали нашему пониманию эволюционирования иммунной системы. Весь антительный репертуар представляет собой сложную, высокоспециализированную систему, в которой различные структуры (иммуноглобулины) распознают одно и то же - антиген, но комплекс иммуноглобулина с антигеном определяет развитие множества различных биологических эффектов. В этой главе описываются структурные и биологические свойства иммуноглобулинов.

Обнаружение антител и определение их характеристик

Антитела содержатся в сыворотке крови, которую получают после ее свертывания и удаления образовавшегося сгустка с находящимися в нем клетками и факторами свертывания. При электрофорезе сыворотки (разделении в электрическом поле) в условиях слабощелочной среды (рН 8,2), в ней, как правило, можно различить пять основных компонентов (рис. 4.1). Было показано, что антитела содержатся в области γ-глобулинов, где располагаются самые медленные с точки зрения миграции относительно анода элементы. После выявления этой закономерности провели простое сравнение элекрофоретических профилей антисыворотки, взятой у гипериммунизированного кролика (получившего многоразовую иммунизацию тест-антигеном) до и после удаления тестируемых антигенспецифичных антител, для чего провели преципитацию с антигеном.

Эта процедура привела к уменьшению размера только фракции γ-глобулинов. Анализ показал, что когда эта фракция собиралась отдельно, в ней содержались все определяемые антитела. Позднее было показано, что активность антител присутствует не только в γ-глобулиновой фракции, но и в области, несколько более близкой к аноду. В результате все глобулярные белки, обладающие свойствами антител, были в основном отнесены к иммуноглобулинам, что подтверждает γ-пик (см. рис. 4.1).

Ширина электрофоретических пиков свидетельствует, что они представляют гетерогенную смесь иммуноглобулиновых молекул с немного различающимися зарядами. Эта гетерогенность была одним из первых препятствий на пути определения структуры антител, поскольку аналитическая химия в качестве первичного материала требует гомогенных материалов, способных кристаллизоваться.

Эта проблема была частично решена после открытия миеломных белков, которые являются гомогенными иммуноглобулинами, производимыми потомством одной плазматической клетки, подвергшейся опухолевой трансформации при злокачественном заболевании, называемом множественной миеломой. Это наглядно демонстрирует форма ү-глобулинового зубца элекрофореграммы сывороточных белков больного множественной миеломой (см. рис. 4.1). Когда выяснили, что некоторые миеломные белки связывают антиген, стало очевидно, что с ними можно обращаться, как с типичными молекулами иммуноглобулина.

Рис. 4.1. Электрофоретическая мобильность белков сывороток, полученных от нормального индивидуума (голубая) и больного с lgG-миеломой (красная) (с любезного разрешения д-ра С Miller, School of Medicine, University of California at Davis)

Другим подспорьем в исследованиях структуры антител стало открытие белков Бенс-Джонса в моче. Эти гомогенные белки, определяемые в больших количествах у некоторых больных множественной миеломой, являются димерами κ- или λ-легких цепей иммуноглобулинов. Они оказались очень полезными при определении структуры этой части иммуноглобулиновой молекулы. Сегодня разработана эффективная методика гибридизации двух клеток (гибридомная технология), которая позволяет получать большое количество гомогенных препаратов моноклональных антител практически любой специфичности.

Структура легких и тяжелых цепей

Структурные характеристики антител начали анализировать в 1959 г. после двух открытий, показавших, что эти молекулы могут быть разделены на части, пригодные для дальнейшего исследования. В Англии Р. Р. Портер (R.R., Porter) обнаружил, что после протеолитического расщепления молекулы иммуноглобулина (молекулярная масса 150000 Да) ферментом папаином получаются три фрагмента примерно одинаковой величины (рис. 4.2). Два фрагмента сохраняют способность к специфическому связыванию антигена, хотя в отличие от интактной молекулы утрачивают способность к преципитации антигена в растворе.

Рис 4.2. Протеолитическое расщепление иммуноглобулина с использованием папаина и пепсина

Эти два фрагмента назвали Fab-фрагментами (fragment antigen binding - фрагмент, связывающий антиген), их считают моновалентными (имеющими по одному связывающему центру) и идентичными по всем параметрам. Третий фрагмент может быть выкристаллизован из раствора, что указывает на его явную гомогенность. Он называется Fc-фрагментом (crystallizable fragment - кристаллизуемый фрагмент). Он не может связываться с антигеном, но, как было показано в дальнейшем, отвечает за биологические функции молекулы антитела после того, как антиген связывается с Fab-фрагментом интактной молекулы.

Примерно в то же время в США Д. Г. Эдельман (D. H.Edelman) обнаружил, что при воздействии меркаптоэтанола (реактива, разрушающего S - S-мостики) молекула γ-глобулина значительно уменьшается; она разделяется на четыре цепи: две одинаковые легкие цепи молекулярной массой около 53000 Да каждая и две другие примерно по 22000 Да каждая. Более крупные молекулы были названы тяжелыми (heavy - Н) цепями, а более мелкие - легкими (light - L). На основании этих результатов была определена структура молекул иммуноглобулина, как она представлена на рис. 4.2.

В последующем была доказана принципиальная правильность модели, а Р. Р. Портер и Д. Г. Эдельман поделили Нобелевскую премию за открытие структуры антител. Таким образом, все молекулы иммуноглобулина имеют базовую структуру, состоящую из четырех полипептидных цепей - двух одинаковых тяжелых и двух одинаковых легких, связанных несколькими дисульфидными мостиками. Следует отметить, что папаин расщепляет иммуноглобулиновую молекулу в N-терминальном конце шарнирной области до дисульфидного мостика, в результате чего получаются два моновалентных Fab- и Fc-фрагмента.

В отличие от папаина пепсин расщепляет шарнирную область в С-терминальном конце ниже дисульфидного мостика, что приводит к получению двухвалентного фрагмента, названного F(ab")2, в котором содержатся два Fab-фрагмента, соединенных дисульфидным мостиком, а также несколько Fc-субфрагментов (см. рис. 4.2). Детально базовая структура молекулы иммуноглобулина, состоящая из двух гликозилированных тяжелых и двух легких цепей, представлена на рис. 4.3.

Заметьте, что кроме дисульфидных мостиков между цепями, которые удерживают их вместе, внутри каждой тяжелой и легкой цепи содержатся дисульфидные мостики создающие иммуноглобулиновые (петлевые) домены, которые формируют антипараллельную β-складку - структуру, характерную для молекул антител. Другие молекулы, принадлежащие к так называемому суперсемейству иммуноглобулинов, также обладают этим структурным признаком.

Рис. 4.3. Молекула иммуноглобулина с наличием иммуноглобулиновых петлевых доменов, сформированных дисульфидными мостиками внутри цепей

Как в случае с другими белками, иммуноглобулины одного вида иммуногенны для другого вида. Использование иммуноглобулинов определенного вида в качестве иммуногенов у другого вида позволяет вырабатывать различные антисыворотки, которые способны распознавать структуру разных цепей иммуноглобулинов. При совместном использовании биохимических и серологических (с использованием сывороточных антител) методов было показано, что почти у всех исследованных видов животных имеются два основных класса легких цепей: κ и λ.

У животных каждого вида продуцируются легкие цепи обоих типов, но соотношение κ- и λ-цепей различны для каждого вида (у мыши 95 % κ-цепей, у человека 60%). Однако в любой молекуле иммуноглобулина обе легкие цепи всегда или κ-, или λ-типа; никогда не бывает по одной цепи каждого типа. Хотя существует всего два типа легких цепей, было показано, что иммуноглобулины практически у всех видов состоят из пяти разных классов (изотипов), различающихся по структуре тяжелых цепей.

Эти тяжелые цепи различаются по антигенным свойствам (серологически), содержанию углеводородов и размеру. Более важно то, что они определяют различные биологические свойства, присущие каждому изотипу. Тяжелые цепи, чьи константные области являются производными генов тяжелых цепей иммуноглобулинов, обозначаются греческими буквами, как показано в табл. 4.1.

Гены, кодирующие константные области тяжелых цепей, обозначаются сходным образом. Поэтому гены, кодирующие константные (С) области, отвечающие за μ, δ, γ, α и ε тяжелые цепи, называются Сμ, Сδ, Сγ, Сα, Сε соответственно.

Таблица 4.1. Распределение иммуноглобулинов по изотипам в соответствии с наличием тяжелых цепей

У представителей любого вида есть тяжелые цепи в пропорциях, характерных для данного вида, но в любой молекуле антитела обе тяжелые цепи идентичны (например 2γ, 2ε). Таким образом, молекула антитела класса IgG может иметь структуру κ2γ2 с двумя идентичными легкими κ-цепями и двумя тяжелыми γ-цепями. В отличие от этого антитело класса IgE может иметь структуру κ2ε2 или λ2ε2. В каждом случае именно природа тяжелых цепей придает молекуле ее уникальные биологические свойства, такие как период полураспада в кровотоке, способность связываться с определенными рецепторами и активировать ферменты в комбинации с антигенами.

Дальнейшее определение характеристик этих изотипов с помощью специфических антисывороток привело к выявлению ряда подклассов, имеющих более тонкие отличия. Так, основной класс IgG человека может быть разделен на подклассы IgG1 IgG2, IgG3 и IgG4. Иммуноглобулин А также был разделен на два подкласса: IgA1 и lgA2. Подклассы отличаются друг от друга по числу и организации дисульфидных мостиков между цепями, а также по изменениям в других структурных свойствах. Эти изменения в свою очередь вызывают изменения функциональных свойств, как описано далее.

Домены

На ранних этапах исследования структуры иммуноглобулинов стало ясно, что кроме дисульфидных мостиков, которые удерживают вместе легкие и тяжелые цепи, а также две тяжелые цепи, внутри каждой цепи существуют дисульфидные мостики, формирующие петли в структуре каждой цепи. Глобулярная структура иммуноглобулинов и способность ферментов расщеплять эти молекулы на крупные составляющие в строго определенных местах, а не разрушать их до олигопептидов и аминокислот, указывает на чрезвычайную компактность структуры.

Более того, наличие дисульфидных мостиков внутри цепи через регулярные и примерно равные промежутки по 100-110 аминокислот означает, что каждая петля в пептидных цепях должна формировать компактно сложенный глобулярный домен. В действительности каждая легкая цепь имеет по два домена, а тяжелые цепи - по четыре или пять доменов, разделенных несложно организованными отрезками (см. рис. 4.3). Наличие таких конфигураций было подтверждено прямыми наблюдениями и с помощью генетического анализа.

Молекулы иммуноглобулинов собраны из отдельных доменов, каждый из которых располагается вокруг дисульфидного мостика и настолько гомологичен остальным, что можно предположить, что они развились из одного общего гена-предшественника, который дуплицировал себя несколько раз, а затем изменил свою аминокислотную последовательность, чтобы получившиеся разные домены выполняли различные функции. Каждый домен обозначают буквой, означающей его принадлежность к легкой или тяжелой цепи, и числом, указывающим его положение.

Как мы детально рассмотрим далее, первый домен на легкой и тяжелой цепях всех антител крайне вариабелен по последовательности аминокислот; он обозначается как VL и VH соответственно (см. рис. 4.3). Второй и последующие домены на обеих тяжелых цепях гораздо более постоянны по последовательности аминокислот и обозначаются CL или Сн1, Сн2 и Сн3 (см. рис. 4.3). В дополнение к дисульфидным мостикам между цепями глобулярные домены связываются друг с другом в гомологичные пары в основном за счет гидрофобных взаимодействий в следующем порядке: VHVL, Ch1Cl, Сн2Сн2, Сн3Сн3.

Шарнирная область

У иммуноглобулинов (возможно, за исключением IgM и IgE) шарнирная область состоит из короткого сегмента аминокислот и обнаруживается между участками Сн1 и Сн2 тяжелых цепей (см. рис. 4.3). Этот сегмент состоит преимущественно из остатков цистеина и пролина. Цистеины вовлечены в формирование дисульфидных мостиков между цепями, а пролиновые остатки предотвращают складывание в глобулярную структуру. Этот участок тяжелой цепи отвечает за важную структурную характеристику иммуноглобулинов.

Он обеспечивает подвижность между двумя Fab-фрагментами Ү-образной молекулы антитела. Это позволяет Fab-фрагментам открываться и закрываться, чтобы обеспечивать связывание с двумя эпитопами, разделенными фиксированным промежутком, что может наблюдаться на поверхности бактерии. Кроме того, поскольку этот отрезок аминокислот открыт и доступен, как любой другой несвернутый пептид, он может быть расщеплен протеазами для получения Fab- и Fc-фрагментов, описанных ранее (см. рис. 4.2).

Вариабельная область

Биологические функции молекулы антитела проистекают из свойств константной области, которая идентична для антител любой специфичности внутри определенного класса. При этом часть молекулы, которая связывается с эпитопом, составляет вариабельную область. Основной проблемой для иммунологов было определение, каким образом вариабельная область может обеспечить такое большое разнообразие индивидуальных специфичностей, которое необходимо для соответствия огромному количеству антигенов.

Когда была определена последовательность аминокислот у белков с высокой однородностью (например, миеломные белки и белки Бенс-Джонса), обнаружили, что наибольшая вариабельность последовательностей существует для 110 N-терминальных аминокислот как легкой, так и тяжелой цепей. Е.А.Кабат (E.A.Kabat) и Т.Т.Ву (T.T.Wu) сравнили последовательность аминокислот многих Vl- и Vн-областей. Они схематически представили вариабельность аминокислот в каждой позиции цепи и показали, что наибольшая степень вариабельности (определяемая соотношением числа различных аминокислот в данной позиции к частоте наиболее характерных аминокислот в данной позиции) наблюдается в трех областях легкой и трех областях тяжелой цепи.

Эти участки называются гипервариабельными. Менее вариабельные участки, которые находятся между гипервариабельными участками, называются каркасными. Теперь известно, что гипервариабельные участки принимают участие в связывании антигена и формируют регион, комплементарный по структуре эпитопу антигена. Исходя из этого, гипервариабельные участки называются участками, определяющими комплементарность легких и тяжелых цепей: CDR1, CDR2 и CDR3 (рис. 4.4).

Рис. 4.4. Вариабельность аминокислот, составляющих N-концевые остатки VHf в молекуле иммуноглобулина

Гипервариабельные участки, хотя и разделены в линейной двухмерной модели пептидных цепей, в действительности приближены друг к другу в свернутой форме интактной молекулы антитела. Вместе они составляют антигенсвязывающий центр, комплементарный эпитопу (рис. 4.5).

Рис. 4.5. Комплементарность между эпитопом и анти генсвязывающим центром, состоящим из гипервариабельных участков L- и Н-цепей. Пронумерованные буквы обозначают CDR тяжелой и легкой цепей, номера в кружках - номера аминокислотных остатков в CDR

Вариабельность этих CDR обеспечивает различия в конфигурации антигенсвязывающего центра, которые необходимы для функционирования антител различной специфичности. Все известные силы, вовлеченные во взаимодействие антиген - антитело, являются слабыми нековалентными взаимодействиями (например, ионные, водородные, ван-дер-ваальсовы силы и гидрофобные взаимодействия). Поэтому необходимо, чтобы между антигеном и антителом был тесный контакт в достаточно большой области, чтобы обеспечить общую связывающую силу, адекватную для устойчивого взаимодействия. В соединении между эпитопом и антителом участвуют и тяжелая, и легкая цепи.

Теперь должно быть ясно, что две молекулы антитела с разной антигенной специфичностью должны иметь и различную последовательность аминокислот в своих гипервариабельных участках, а те, которые обладают одинаковой последовательностью, обычно имеют и одинаковую специфичность. Однако существует возможность, что два антитела с разной последовательностью аминокислот обладают специфичностью к одному и тому же эпитопу. В этом случае аффинность связывания антител с эпитопом будет, вероятно, различной, поскольку будут существовать различия в числе и типах связывающих сил, доступных для связывания идентичных антигенов с разными связывающими участками двух антител.

Дополнительный источник вариабельности может заключаться в размере антигенсвязывающего участка на антителе, который обычно (но не всегда) имеет форму углубления или щели. В некоторых случаях, особенно если вовлечены небольшие гидрофобные гаптены, эпитопы занимают не весь антигенсвязывающий участок. Однако при этом достигается достаточная аффинность связывания. Было показано, что антитела, специфичные для таких небольших гаптенов, могут в действительности реагировать с другими антигенами, не обладающими явным сходством с гаптеном (например, динитрофенол и эритроциты барана). Эти большие отличающиеся антигены связываются или с большим участком, или же с другим участком антигенсвязывающего центра на антителе (рис. 4.6).

Рис. 4.6. Варианты того, как антитело (АТ1) определенной специфичности может проявлять способность к связыванию с двумя различными эпитопами (АГ1 и АГ2)

Таким образом, способность определенного антигенсвязывающего центра связываться с двумя (или более) действительно различными эпитопами называют избыточностью. Способность одной молекулы антитела перекрестно реагировать с неопределенным числом эпитопов может уменьшить количество антител, необходимых для защиты индивида от широкого спектра агрессивных антигенов.

Р.Койко, Д.Саншайн, Э.Бенджамини