04.07.2013 - 31.12.2013
Проведен систематический анализ современной литературы по теме исследования. Установлены последовательности наиболее перспективных, с точки зрения исполнителей проекта, производных олигонуклеотидов и их аналогов, которые должны проявлять противовирусную и антибактериальную активности.
Разработаны методики синтеза модифицированных олигонуклеотидов и их конъюгатов с использованием автоматических ДНК/РНК-синтезаторов или в режиме неавтоматизированного синтеза на твердотельном носителе. Для дизайна олигонуклеотидных производных с заданной функциональностью предложены различные подходы, в том числе, основанные на прогностическом анализе структуры и стабильности формируемых дуплексов с помощью метода молекулярной динамики. Предложен способ синтеза новых, ранее не описанных производных олигонуклеотидов, несущих модификации по атому фосфора межнуклеотидной фосфодиэфирной группировки.
Разработана методика анализа эффективности проникновения флуоресцеин-меченных соединений в бактериальные клетки. Показано, что положительно заряженные производные пептида Flu-(LR)4G-амида эффективно проникают и накапливаются в Pseudomonas aeruginosa, а эффективность проникновения в нее олигонуклеотидов без транспортного пептида низка.
Все разработанные при выполнении исследований методики, как синтетические, так и аналитические, внедрены в работу Лаборатории Биомедицинской Химии ИХБФМ СО РАН. Полученные теоретические наработки использованы в образовательных курсах.
Созданная в лаборатории синтетическая база для получения, выделения и характеризации олигонуклеотидов является уникальной для РФ и близка к уровню лучших мировых научно-исследовательских лабораторий соответствующей специализации. Привлечение специалистов биологического профиля делает лабораторию уникальной по потенциалу ее научно-исследовательской реализации в направлении разработки РНК-направленных противовирусных и антибактериальных препаратов.
Развернуть
01.01.2014 - 31.12.2014
i) Оценка антибактериальной активности аналогов олигонуклеотидов/олигонуклеотидных конъюгатов по отношению к Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium; Staphylococcus aureus;
ii) Оценка антивирусной активности аналогов олигонуклеотидов/олигонуклеотидных конъюгатов по отношению к вируса гриппа WSN33/A/H1N1.
iii) Выбор последовательностей олигонуклеотидных аналогов- лидеров, проявляющих антибактериальную или противовирусную активность на требуемом уровне;
iv) Разработка протоколов синтеза олигонуклеотидных конъюгатов, содержащих группы, которые увеличивают эффективность их накопления в эукариотических или бактериальных клетках
iv) Оценка эффективности проникновения и накопления разработанных соединений в бактериальных и эукариотических клетках.
v) Подготовленная лаборатория;
vi) Статьи в научной периодике, индексируемой в Web of Science.
vii) Тезисы докладов на конференциях;
viii) Свидетельства об участии в в образовательных курсах;
ix) Конференция;
Развернуть
01.01.2015 - 31.12.2015
3.1 Антибактериальная активность соединений, содержащих последовательности-лидеры по отношению к Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium; Staphylococcus aureus in vitro (в клеточной культуре);
3.2 Противовирусная активность соединений, содержащих последовательности-лидеры, по отношению к вирусу гриппа in vitro;
3.3. Технологические и терапевтические характеристики отобранных олигонуклеотидных аналогов и конъюгатов с учетом путей коммерциализации препаратов, в том числе:
3.3.1 Список стандартизованных экспериментальных методик для оценки антибактериальной и противовирусной активности препаратов олигонуклеотидных аналогов in vitro (в культуре клеток) и in vivo (на животных моделях);
3.3.3 Отобранные олигонуклеотидные аналоги и конъюгаты, которые наряду с проявлением высокой антибактериальной и противовирусной активности способны к эффективному проникновению и накоплению в клетках, в том числе:
3.3.2.1 Данные по проникновению в клетки и доставки модифицированных олигонуклеотидных аналогов и конъюгатов;
3.3.2.2 Оптимизированный полупрепаративный синтез, пре- и пост-синтетические модификации, выделение и количественный контроль олигонуклеотидных аналогов, проявляющих антибактериальную и противовирусную активность;
3.3.2.3. Оценка разработанных соединений с антибактериальной и противовирусной активностью с точки зрения коммерческого использования.
3.4 Подготовленный финальный отчет по Проекту;
3.5 Подготовленная лаборатория;
3.6 Тезисы докладов на конференциях;
3.7 Свидетельства об участии в в образовательных курсах;
3.8 3статьи в научной периодике, индексируемой в Web of Science
В большинстве методов генной терапии ех vivo и in vivo используются клонированные генетические конструкции, возмещающие функциональную форму белка, который не синтезируется в организме больного или синтезируется в дефектной форме. Однако многие заболевания человека (рак, воспаления, вирусные и паразитарные инфекции) связаны, напротив, с гиперпродукцией нормального белка. Для лечения таких состояний разработаны терапевтические
системы с использованием специфических олигонуклеотидов. Такой небольшой олигонуклеотид может гибридизоваться со специфическим геном или мРНК и снижать уровень транскрипции или трансляции, уменьшая тем самым количество синтезируемого белка, ответственного за патологию. Олигонуклеотид, который гибридизуется с самим геном и блокирует его транскрипцию, называется «антигенным», а тот, который гибридизуется с соответствующей мРНК, - «антисмысловым» (Antisense RNA). Для предотвращения активации транскрипции специфических генов можно так-же использовать двухцепочечные олигонуклеотиды, специфично присоединяющиеся к ДНК-связывающим белкам (белкам-активаторам). Наконец, для уменьшения количества определенной мРНК и синтезируемого на ней белка можно использовать рибозимы - природные РНК-последовательности, которые связываются со специфическими молекулами РНК и разрезают их.
В будущем лекарственные средства на основе нуклеиновых кислот, по-видимому, найдут широкое применение, при этом главным объектом научных исследований и клинических испытаний будут различные «антисмысловые» олигонуклеотиды.
3.1..«Антисмысловые» олигонуклеотиды как лекарственные средства
«Антисмысловая» РНК (Antisense RNA), которую предполагается использовать в качестве лекарственного средства, представляет собой короткий (15-20-нуклеотидов) олигонуклеотид, который может связываться с комплементарным ей определенным участком мРНК и ингибировать трансляцию кодируемого ей белка, подавляя тем самым патологический процесс (рис.2).
Терапевтический эффект синтетических «антисмысловых» олигонуклео-тидов зависит от специфичности их гибридизации с доступным сайтом мРНК-мишени, устойчивости к действию клеточных нуклеаз и наличия системы доставки в клетку. 15-20-нуклеотидные последовательности гибридизуются с уникальными мРНК с достаточно высокой специфичностью. Потенциальные сайты-мишени определяют тестированием набора «антисмысловых» олигонуклеотидов с использованием культуры клеток, синтезирующих мРНК-мишень. Для этого проводят электрофоретическое разделение клеточных белков, в которые включают радиоактивную метку во время трансляции, и с помощью радиоавтографии устанавливают, в присутствии какого из «антисмысловых» олигонуклеотидов снижается синтез определенного белка. Никаких общих критериев выбора наилучших сайтов-мишеней в разных РНК-транскриптах не существует. Эффективными могут оказаться олигонуклеотиды, комплементарные 5"- или 3"-концам мРНК, границам экзонов и интронов и даже двухцепочечным областям. Антисмысловые олигонуклеотиды могут разрушаться внутриклеточными нуклеазами, поэтому важно защитить их от действия последних так, чтобы они не утратили способности к гибридизации с мишенью. Для этого можно модифицировать определенным образом пиримидиновые основания, рибозу или дезоксирибозу (рис.3). Так, у наиболее широко применяющихся сейчас «антисмысловых» олигонуклеотидов свободный атом кислорода фосфодиэфирной связи заменен на группу SH (рис. 3Б), в результате чего образуется тиофосфатная связь. Модифицированные таким образом олигонуклеотиды растворяются в воде, несут отрицательный заряд и не расщепляются под действием эндонуклеаз. При гибридизации с сайтом-мишенью они образуют дуплексы, которые активируют рибонуклеазу (РНКазу), эндогенный фермент, расщепляющий мРНК в такой гибридной молекуле. Проведены первые клинические испытания таких олигонуклеотидов - лекарственных средств «первого поколения». Мишенями являются РНК цитомегаловируса, вируса иммунодефицита человека, а также мРНК генов, ответственных за развитие рака, болезней кишечника и других заболеваний.
Синтезированы «антисмысловые» олигонуклеотиды с фосфорамидитной и полиамидной (пептидной) связями - пептидные нуклеиновые кислоты (Peptide nucleicacids, PNAs) (рис.3В и Г ). Такие молекулы очень устойчивы к действию нуклеаз. Химические группы, присоединенные к 2"-углеродному атому сахарного остатка и С-5-атому пиримидинов, также защищают «антисмысловые» олигонуклеотиды и облегчают их связывание с сайтом-мишенью (рис. 32Д и Е ). Все преимущества этих и других модификаций сейчас интенсивно изучаются.
Проникновение «антисмыловых» олигонуклеотидов в клетку можно значительно облегчить, поместив их в липосомы. Такая высокоэффективная система доставки позволяет использовать «антисмысловые» олигонуклеотиды в небольших концентрациях. Если же конъюгировать липосомы с антителами, специфичными к эпитопам определенных клеток тех или иных органов, то можно будет осуществлять адресную доставку «антисмысловых» олигонуклеотидов.
Проведенные доклинические испытания оказали, что «антисмысловые» олигонуклеотиды являются весьма эффективными лекартвенными средствами. Изучена возможность их применения для лечения стеноза коронарых и сонных артерий, который приводит к инфарктам и инсультам. В этих случаях часто прибегают к ангиопластике, расширению артерий с помощью баллонного катетера, но примерно у 40% больных через 6 месяцев вновь возникают стенозы, поскольку ангиопластика стимулирует пролиферацию гладкомышечных клеток и секрецию межклеточного вещества во внутренний слой артерии в месте ее расширения. В одном из экспериментов в сонные артерии крыс после ангиопластики вводили антисмысловые» олигонуклеотиды с тиофосфатными связями, комплементарные мРНК, которые кодируют важные для клеточного циклa млекопитающих белки; в результате частота повторных стенозов уменьшилась на 90%. Пролиферация гладкомышечных клеток происходит также при атеросклерозе, сахарном диабете, осложнениях после коронарного шунтирования. Вероятно, все эти состояния можно будет контролировать аналогичными способами.
«Антисмыловые» олигонуклеотиды можно применять и для лечения вирусных инфекций и малярии. Кроме того, результаты I фазы клинических испытаний лечения болезни Крона с помощью орального введения «антисмыслового» олигонуклеотида проиллюстрировали четко выраженный терапевтический эффект без заметных побочных эффектов. В этом случае мРНК-мишень кодировала межклеточный адгезии типа 1, который вырабатывается в избытке у пациентов с болезнью Крона. Предполагается исследовать эффективность этого же олигонуклеотида для терапии других воспалительных заболеваний, например ревматоидного артрита, псориаза и язвенного колита.
В принципе «антисмысловые» олигонуклеотиды могут образовывать тройную спираль с хромосомной ДНК-мишенью и блокировать транскрипцию. Однако пока специфичность «антигенных» олигонуклеотидов не соответствует стандартам, принятым для лекарственных средств.
Олигонуклеотид – это короткий фрагмент нуклеиновой кислоты менее 50 нуклеотидов в длину. В течение последних 20 лет, смысл расширился, чтобы включать в себя все химически синтезированные нуклеиновые кислоты, независимо от длины. Первая публикация о направленном химическом синтезе олигонуклеотида появилась в 1955 году.
С тех пор, миллионы олигонуклеотидов синтезируются каждый год для использования в лабораториях по всему миру. Для большинства исследований нужны лишь небольшие количества ДНК. Гораздо большее количество ДНК (10 мкмоль или более) необходимы для использования в биофизических исследованиях (ЯМР и рентгеновской кристаллографии) поэтому, чтобы обеспечить синтез столь больших количеств, были разработаны методы твердофазного синтеза, что позволяет использовать олигонуклеотиды в качестве молекул лекарственного средства (например, антисмысловые олигонуклеотиды).
Синтез ДНК или РНК олигонуклеотидов относится к химическому синтезу фрагментов нуклеиновых кислот с определенными химическими структурами или последовательностей в различных размерах.
Рис.1. Структуры олигонуклеотидов.
Принцип твердофазного синтеза впервые был разработан и применен для синтеза полипептидов Роберта Брюса Меррифилда, американского биохимика, который получил Нобелевскую премию по химии в 1984 году за изобретение твердой фазы синтеза пептидов. Он понял, что ключ к успешному синтезу заключается в закреплении первого мономера к нерастворимой полимерной твердой фазе. Другие мономеры затем могут быть соединены, один за другим, к неподвижному терминальному концу растущего полимера. В конце синтеза, завершенная полимерная цепь может быть отсоединена от нерастворимого полимера и очищена. Этот процесс был оптимизирован на протяжении многих лет, чтобы стать высокоэффективным и теперь стал принципиально важным методом, используемым в автоматизированных олигонуклеотидных синтезаторах.
Для обеспечения успешного синтеза олигонуклеотидов необходимы следующие условия:
- Все реагенты должны быть растворимы в неводных растворителях.
- Амино- и гидроксильные группы нуклеотидных оснований и углеводных остатков должны быть соответствующим образом блокированы.
- Защитные группы, введенные в процессе синтеза, должны быть стабильными в условиях удлинения цепи при образовании межнуклеотидной фосфодиэфирной связи.
- Защитные группы должны быть достаточно лабильными, чтобы их можно было удалить в конце синтеза, не повредив продуктов реакции.
Функции олигонуклеотидов и перспективы их применения
В настоящее время олигонуклеотиды и их аналоги широко используются в различных областях, таких как медицина и в молекулярно-биологических исследованиях, а также рассматриваются в качестве перспективных терапевтических средств и зондов для молекулярной диагностики.
За последние 20 лет относительно хорошо были изучены только два типа аналогов нуклеиновых кислот с формально электронейтральным остовом – пептидные нуклеиновые кислоты и фосфордиамидные морфолиноолигонуклеотиды. Аналоги обоих типов способны к комплементарному связыванию с природными молекулами ДНК и РНК, и в силу этого они нашли применение как в молекулярной биологии, так и, в особенности, в медицине в качестве потенциальных лекарственных препаратов.
Кроме того, с развитием ДНК-технологий появилась возможность изучения экспрессии известных генов, определения мутаций в геномах различных организмов и проведения диагностики ряда инфекционных заболеваний. В решении этих задач наиболее перспективным является использование ДНК-чипов, представляющих собой небольшие пластины с нанесенными на их поверхность фрагментами ДНК.
Способ создания ДНК-чипов объединяет методы, основанные на адресном синтезе олигонуклеотидов непосредственно на поверхности чипа. Синтез проводят путем поэтапного добавления к растущей олигонуклеотидной цепи нуклеотидов, содержащих на 5’-конце лабильную защитную группу, снятие которой возможно под действием светового излучения, электрического напряжения или в ходе кислотного гидролиза.
Показано, также, что ген-направленные олигонуклеотиды, в зависимости от выбранного гена-мишени, отличаются значительным разнообразием модулирующих эффектов на опухолевые ткани, начиная от замедления и остановки пролиферации опухолевых клеток и заканчивая подавлением их инвазивных свойств.
Противоопухолевые препараты на основе нуклеиновых кислот представляют собой высокоспецифичный инструмент модуляции экспрессии генов. Подавление ряда генов, аномально высокая экспрессия которых возникает при неопластической трансформации, можно осуществить с помощью препаратов на основе нуклеиновых кислот, таких как антисмысловые олигонуклеотиды (asON). В общем, механизм подавления экспрессии генов заключается в их комплементарном связывании с мРНК-мишенью, после чего целевая мРНК либо подвергается расщеплению, либо блокируется процесс ее трансляции.
asON представляют собой синтетические одноцепочные ДНК длиной 15-20 нуклеотидов. В последнее время были получены asON, способные препятствовать транспорту сплайсированной мРНК из ядра в цитоплазму, а также asON, которые в результате блокирования сайта сплайсинга в пре-мРНК способны приводить к экспрессии альтернативного варианта белка.
Ввиду того, что природные олигодезоксирибонуклеотиды в культуре клеток и в условиях in vivo подвергаются быстрой деградации под действием нуклеаз, для повышения их стабильности в структуру asON вводят различные химические модификации.
Химический синтез олигонуклеотидов
Твердофазный синтез широко используется в синтезе пептидов, синтезе олигонуклеотидов, синтезе олигосахаридов и комбинаторной химии. Твердофазный химический синтез был изобретен в 1960-е годы Брюсом Меррифилдом, и был удостоен Нобелевской премии по химии в 1984 году.
Твердофазный синтез осуществляют на твердом носителе, между фильтрами, в столбцах, которые пропускают все реагенты и растворители. Твердофазный синтез имеет ряд преимуществ по сравнению с синтезом в растворе:
обеспечивает высокую скорость реакции
примеси и избыток реагентов смываются, поэтому очистка после каждого шага не требуется
процесс поддается автоматизации на твердофазных синтезаторах с компьютерным управлением.
Твердые носители (называемые также смолами) представляют из себя нерастворимые в воде частицы, как правило, 50-200 мкм в диаметре, к которым олигонуклеотид присоединяется в процессе синтеза.
Имеются данные, что одним из наиболее эффективных материалов, которые можно использовать в качестве твердого носителя, является пористое стекло. Оно достаточно жесткое и не способно к набуханю. В его глубоких порах, происходит синтез олигонуклеотидов. Стекло содержит 500 Å (50 нм) поры, которые подходят для синтеза коротких олигонуклеотидов. Тем не менее, оно плохо подходит для синтеза олигонуклеотидов более 40 оснований в длину. Это связано с тем, что растущий олигонуклеотид блокирует поры и уменьшает диффузию реагентов через матрицу.
Твердые носители для обычного синтеза олигонуклеотидов, как правило, изготовлены с нагрузкой 20-30 мкмоль нуклеозида на грамм смолы. Синтез олигонуклеотидов при более высоких нагрузках становится менее эффективным вследствие стерических затруднений между соседними цепями ДНК, присоединенных к смоле.
Этапы химического синтеза олигонуклеотидов
Фосфорамидатный олиго-синтез протекает в 3′- к 5′-направлении (противоположном 5′- к 3′-направлении биосинтеза ДНК в репликации ДНК). Один нуклеотид добавляется за синтез цикла.
Рис. 2. Фосфорамидатный олигонуклеотидный цикл синтеза
В начале олигонуклеотидного синтеза первый нуклеозид предварительно присоединяют к смоле (носителю), и выбираются колонны синтеза A, G, C или T в зависимости от нуклеозида на 3′-конце желаемого олигонуклеотида. Закрепленный нуклеозид имеет 5′-ДMT защитную группу (ДМТ = 4,4′-диметокситритил), роль которой состоит в предотвращении полимеризации, и эта защитная группа должна быть удалена (детритилирование). Механизм детрилирования показан на рисунке 3.
Рис.3. Механизм удаления защитной группы.
После детритилирования, закрепленный нуклеозид готов реагировать со следующим основанием, который добавляется в виде нуклеозид-фосфорамидатного мономера. Большой избыток соответствующего нуклеозида, смешивают с активатором (тетразолом или его производными). Диизопропиламиногруппа нуклеозида протонируется активатором, и, таким образом, превращается в хорошо отсоединяющуюся группу. Она быстро вытесняется 5′-гидроксильной группой связанного нуклеозида, создавая фосфит триэфир (рис. 4).
Рис.4. Механизм протонирования активатором.
Нуклеозидные фосфорамидиты достаточно стабильны в инертной атмосфере, и могут быть получены в больших количествах, доставляться по всему миру, и храниться в виде сухого твердого вещества в течение нескольких месяцев перед использованием.
Однако даже при высокоточных работах по синтезу олигонуклеотидов, остается вероятность, что там будет несколько непрореагировавших 5′-гидроксильных групп, которые будут доступны для участия в следующей стадии. Если подобное нарушение не остановить, они будут накапливаться с каждым последующим циклом, и конечный продукт будет сложной смесью олигонуклеотидов, большинство из которых будет нести неправильную генетическую информацию.
Поэтому метод ацетилирования 5′-гидроксильных групп делает их инертным по отношению к последующей реакции. Это необходимо также и для минимизации примесей.
Фосфит-триэфир (Р (III)), образованный на стадии присоединения неустойчив к кислотам и должен быть преобразован в стабильную форму (P (V)). Это достигается за счет окисления йода в присутствии воды и пиридина (рис. 5). Полученный фосфотриэфир фактически представляет собой ДНК ось, защищенную 2-цианоэтил группой. Группа цианоэтила предотвращает нежелательные реакции с фосфором во время последующих циклов синтеза.
Рис.5. Механизм окислительной стадии.
После этого, ДМТ-защитная группа на 5′-конце цепи ДНК должна быть удалена так, чтобы первичная гидроксильная группа могла вступить в реакцию со следующим нуклеотид-фосфорамидатом. Реакция удаления защитной группы с помощью трихлоруксусной кислоты в дихлорметане протекает быстро. Цикл повторяется, один раз для каждой основы, до получения требуемого олигонуклеотида.
Далее необходимо отсоединить синтезированный олигонуклеотид от твердого носителя. В этом случае используется сукцинил. Разделение возможно при обработке концентрированным водным раствором аммиака при комнатной температуре в течение одного часа (рис. 6).
Рис.6. Механизм отделения олигонуклеотида от твердого носителя в концентрированном водном растворе аммиака.
Реакция расщепления осуществляется автоматически на некоторых синтезаторах, и аммиачный раствор, содержащий олигонуклеотид, поступает в стеклянный флакон. В качестве альтернативы, расщепление может быть осуществлено вручную путем принятия колонки от синтезатора и промыванием в шприцах, содержащих гидроксид аммония.
Олигонуклеотид растворяется в концентрированном водном растворе аммиака, а последующий нагрев позволяет удалить защитные группы из гетероциклических оснований и фосфатов. Водный раствор затем удаляют выпариванием и олигонуклеотид готов к очистке.
Кроме ДМТ-защитной группы, необходимы также дополнительные защитные группы и для аденина, цитозина и гуанина (рис.7). Однако для тимина в этом нет необходимости.
Рис.7. Структуры защитных групп, обычно используемые для защиты адениновых, цитозиновых и гуаниновых оснований во время фосфорамидатного синтеза ДНК олигонуклеотидов.
Выводы
1. Искусственно синтезированные олигонуклеотиды находят все более широкое применение в различных областях науки, а методы их получения все более совершенствуются, что позволяет синтезировать достаточное количество олигонуклеотидов для лабораторных экспериментов и для создания терапевтических препаратов.
2. На сегодняшний день, самым распространенным методом синтеза олигонуклеотидов остается метод твердофазного синтеза, который позволяет существенно ускорять процесс получения олигонуклеотидов, а также уменьшать объемы затраченных реактивов.
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Основные идеи и пути создания противоопухолевых препаратов направленного действия 15 1.1.1. Препараты направленного действия в онкологии: лекарственные препараты на основе моноклональных антител и антисмысловых олигонуклеотидов.
1.2. Рецептор-опосредованный эндоцитоз и его роль в доставке биологическиактивных соединений в клетки-мишени
1.3. Альтернативные системы адресной доставки противоопухолевых препаратов для повышения эффективности терапии рака.
1.4. Опухолево-специфические антигены как мишени адресной доставки противоопухолевых препаратов
1.5. Адресная доставка лекарственных препаратов в составе конъюгатов с белковыми и пептидными векторными молекулами.
1.6. Химерные Белки
1.7. Альфа-фетопротеин и его рецепторы в качестве мишени избирательной доставки биологически активных веществ в опухолевые клетки.
1.7.1. Структура и функции альфа-фетопротеина
1.7.2. Рецепторы альфа-фетопротеина.
1.7.3. Биологически активные фрагменты альфа-фетопротеина
1.8. Адресная доставка противоопухолевых препаратов как основной подход к преодолению множественной лекарственной устойчивости (МЛУ)
1.8.1. Феномен множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток.
1.8.2. Современные подходы к преодолению множественной лекарственной устойчивости.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Выделение природного альфа-фетопротеина человека и получение рекомбинантных белков-фрагментов АФП.
2.1.1. Выделение АФП человека
2.1.2. Получение рекомбинантного С-концевого фрагмента АФП (гАФП27)
2.1.3. Получение рекомбинантного белка PGA
2.1.4. Получение рекомбинантного фрагмента АФП AFP-3BC
2.2. Синтез конъюгатов белков и пептидов с FITC, цитостатиками и олигонуклеотидами.
2.2.1. Синтез FITC-меченых АФП, МАт и С-концевого фрагментов АФП гАФП27 и AFP-3BC.
2.2.2. Синтез FITC-меченого октапептида АФП GIP8.
EMTPVNPG (GIP8) с доксорубицином.
2.2.4. Синтез конъюгатов АФП с винбластином.
2.2.5. Синтез конъюгатов АФП с фталоцианинами
2.2.6. Синтез конъюгатов АФП и GIP8 с эсперамицином Aib (EsA).
2.2.9. Синтез конъюгатов АФП с олигонуклеотидами.
2.2.10. Получение комплексов ON с белками.
2.3. Культуры клеток и условия культивирования.
2.4. Оценка связывания с рецептором и эндоцитоза флуоресцентно меченых белков, пептидов и конъюгатов с помощью метода проточной цитометрии.
2.4.1. Оценка связывания АФП и МАт с рецептором АФП.
2.4.2. Оценка эндоцитоза флуоресцентно меченных АФП, С-концевого фрагмента АФП, октапептида АФП GIP8.
2.5. Оценка эндоцитоза конъюгатов белков и пептидов с ДОКС с помощью метода проточной цитометрии.
2.6. Иммуноцитохимические и иммуногистохимические исследования.
2.6.1. Исследование экспрессии рецепторов АФП на поверхности клеток.
2.6.2. Исследование экспрессии белков с-Мус, Вс1-2 и Pgpl70.
2.6.3. Иммунохимическое окрашивание гистологических срезов.
2.7. Исследование экспрессии с-Мус, Вс1-2 и Pgpl70 в опухолевых клетках.
2.7.1. Исследование экспрессии с-Мус, Вс1-2 и Pgpl70 с помощью Western blot.
2.7.2. Исследование экспрессии с-Мус, Вс1-2 и Pgpl70 в опухолевых клетках с помощью проточной цитометрии.
2.8. Флуоресцентная микроскопия.
2.9. Определение цитостатической активности препаратов in vitro.
2.9.1. Определение выживаемости клеток.
2.9.2. Определение ингибирования пролиферативной активности клеток.
2.9.3. Анализ уровня апоптоза с помощью флуоресцентной микроскопии.
2.8.4. Определение фотоцитостатической и хемиоцитостатической активности конъюгатов АФП с фталоцианинами алюминия (А1Фц) и кобальта (СоФц).
2.9. Исследование пролиферативной активности клеток.
2.10. Анализ клеточного цикла с помощью проточной цитометрии.
2.11. Исследование противоопухолевой активности препаратов in vivo.
2.12. Статистическая обработка результатов.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Исследование экспрессии рецептора альфа-фетопротеина на клетках опухолевых линий человека.
3.1.1. Исследование специфичности клонов МАт к АФПР
3.1.2. Оценка количества АФПР на культивируемых in vitro опухолевых клетках человека.
3.2. Иммунохимическое выявление АФПР на клетках и срезах тканей
3.2.1. Исследование экспрессии рецепторов АФП на поверхности опухолевых клеток с помощью иммуноцитохимии.
3.2.2. Иммуногистохимическое окрашивание срезов опухолевых тканей
3.3. Исследование связывания и эндоцитоза флуоресцентно меченного АФП опухолевыми клетками in vitro.
3.3.1. Исследование связывания АФП с рецептором на поверхности опухолевых клеток и нормальных лимфоцитов периферической крови человека с помощью проточной цитометрии.
3.3.2. Исследование эндоцитоза АФП in vitro с помощью проточной цитометрии и флуоресцентной микроскопии.
3.4. Использование рецептор-опосредованного эндоцитоза для адресной доставки противоопухолевых препаратов - доксорубицина, винбластина, эсперамицина, фталоцианинов.
3.4.1. Анализ интернализации опухолевыми клетками in vitro конъюгатов
АФП с антибиотиками/цитостатиками на примере доксорубицина.
3.4.2. Исследование цитостатической активности конъюгатов белков с доксорубицином in vitro.
3.4.3. Исследование противоопухолевой активности конъюгатов АФП с ДОКС in vivo.
3.4.4. Исследование фотоцитостатической и хемиоцитостатической активности конъюгатов АФП с фталоцианинами алюминия (А1Фц) и кобальта
3.4.5. Исследование цитостатической активности конъюгатов АФП с некоторыми другими противоопухолевыми антибиотиками (цитостатиками).
3.4.6. Исследование цитостатической активности конъюгатов АФП с эсперамицином Ajb (EsA) in vitro.
3.4.7. Исследование противоопухолевой активности конъюгатов АФП с эсперамицином Aib (EsA) in vivo.
3.5. Преодоление множественной лекарственной устойчивости, обусловленной экспрессией гена MDR 1 с помощью конъюгатов АФП с противоопухолевыми препаратами in vitro.
3.5.1. Характеристика резистентных линий клеток.
3.5.2. Анализ интернализации ДОКС и его конъюгатов с белками в резистентных линиях клеток.
3.5.3. Исследование цитостатической активности конъюгатов ДОКС с АФП в отношении резистентных линий клеток.
3.6. Биологически активные фрагменты АФП.
3.6.1. Рекомбинантный С-концевой фрагмент АФП (гАФП27).
3.6.2. Рекомбинантный С-концевой фрагмент АФП АФП-ЗВС.
3.6.3. Биологически активный октапептид - фрагмент АФП
3.7. Адресная доставка антисмысловых олигонуклеотидов в опухолевые клетки.
3.7.1. Адресная доставка антисмысловых олигонуклеотидов в опухолевые клетки в виде их конъюгатов с АФП.
3.7.2. Исследование эффективности доставки ASON с помощью нековалентных комплексов с АФП.
Рекомендованный список диссертаций
Создание и изучение свойств рекомбинантных белков человека с потенциальным противоопухолевым эффектом 2007 год, кандидат химических наук Савватеева, Людмила Владимировна
Разработка противоопухолевых препаратов направленного действия на основе пептидных векторов и антиангиогенных агентов 2007 год, доктор биологических наук Фельдман, Наталия Борисовна
Использование С-концевого домена альфа-фетопротеина для адресной доставки противоопухолевых препаратов 2012 год, кандидат биологических наук Годованный, Артем Витальевич
Получение и изучение биологической активности конъюгатов эпидермального фактора роста с противоопухолевыми химиотерапевтическими препаратами 2000 год, кандидат биологических наук Гуманов, Сергей Георгиевич
Синтез конъюгатов α-фетопротеина человека с противоопухолевыми препаратами для направленной доставки в опухолевые клетки 2001 год, кандидат химических наук Заболотнев, Дмитрий Викторович
Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Использование белковых и пептидных векторов для избирательной доставки противоопухолевых препаратов и терапевтических олигонуклеотидов в опухолевые клетки»
Актуальность проблемы. Основными причинами недостаточной эффективности химиотерапевтического лечения онкозаболеваний является низкая биодоступность противоопухолевых агентов для опухоли, необходимость использовать высокие дозы препаратов и неселективный характер этих препаратов. Ограниченное проникновение лекарственных препаратов в биологически гетерогенные опухоли приводит к выживанию части опухолевых клеток, даже после длительного лечения с помощью цитотоксических агентов. Лечение высокими дозами, необходимое для полной ремиссии, является причиной тяжелейших системных побочных эффектов, что зачастую вынуждает прекратить лечение больных. Кроме того, длительное применение химиотерапевтических агентов чревато развитием множественной лекарственной устойчивости, что делает используемые препараты неэффективными. В основе феномена лекарственной устойчивости лежат различные по природе внутриклеточные механизмы, такие как снижение транспорта препаратов через плазматическую мембрану, нарушение уровня экспрессии онкогенов, повреждение систем сигнальной трансдукции и др. Для повышения эффективности терапии опухолей необходимо увеличение избирательности действия лекарственных препаратов. Здесь можно выделить 2 направления: разработка новых высокоселективных препаратов и создание новых систем регулируемого транспорта хорошо известных противоопухолевых соединений в клетки-мишени.
Избирательность действия лекарственного препарата может быть повышена за счет использования в системах доставки адресных агентов - молекул, способных связываться со специфическими детерминантами на поверхности клеток. Таким образом, использование адресного компонента определяет взаимодействие системы избирательной доставки со строго определенными клетками и тканями, в частности, опухолевыми. В качестве адресных агентов, или векторов, могут выступать физиологические лиганды рецепторов факторов роста или онкофетальных белков, т.е. сами факторы роста и онкофетальные белки. Противоопухолевый препарат может быть соединен с вектором ковалентно с образованием конъюгата, либо нековалентно, с образованием прочного комплекса. Связывание адресной молекулы со специфическим рецептором на поверхности клетки индуцирует процесс рецептор-опосредованного эндоцитоза, который обеспечивает аккумуляцию опухолевыми клетками лекарственного препарата, молекулярная мишень которого находится внутри клетки.
Необходимо отметить, что в некоторых случаях использование систем избирательной доставки является единственным способом, позволяющим использовать терапевтический потенциал некоторых высокотоксичных противоопухолевых антибиотиков, например, антибиотиков ендиинового ряда. В качестве примера можно привести препарат Милотарг, представляющий собой конъюгат калихемицина Xi с гуманизированными антителами к CD33. Кроме того, применение высокоэффективных систем доставки может существенно повысить терапевтический эффект антисмысловых олигонуклеотидов, которые, к сожалению, пока не нашли применения в клинической практике.
Успешное решение проблемы направленного транспорта лекарственных препаратов на основе рецептор-опосредованного эндоцитоза определяется, прежде всего, выбором векторной молекулы. Белковые векторы должны удовлетворять ряду основных требований, к числу которых относятся высокая афинность векторов к соответствующим рецепторам на поверхности опухолевых клеток-мишеней, высокая стабильность, возможность их химической модификации путем конъюгирования с химиопрепаратами без потери биологических свойств, доступность белков в препаративных количествах. Указанным требованиям наиболее близко соответствует онкофетальный белок альфа-фетопротеин. Важными факторами при конструировании систем избирательной доставки также являются выбор лекарственного препарата (цитостатика, фотосенсибилизатора, антисмыслового олигонуклеотида) и линкера, соединяющего адресный и цитотостатический компоненты. Скрининг созданных конструкций в системе in vitro и изучение их внутриклеточного поведения позволяет выявить наиболее оптимальные варианты систем доставки.
Целью настоящей работы являлась разработка принципов создания систем избирательной доставки противоопухолевых препаратов и терапевтических олигонуклеотидов в опухолевые клетки на основе природных и рекомбинантных белков и пептидов и выявление закономерностей, определяющих их эффективность. Задачи исследования:
Выбор белковых и пептидных векторных молекул для избирательной доставки противоопухолевых препаратов и антисмысловых олигонуклеотидов;
Создание конструкций для избирательной доставки противоопухолевых препаратов в клетки-мишени на основе альфа-фетопротеина и его пептидных фрагментов,
Исследование интернализации и внутриклеточного распределения препаратов в зависимости от типа конструкции для оптимизации систем доставки;
Разработка подходов к преодолению множественной лекарственной устойчивости с использованием систем направленной доставки; Разработка конструкций на основе альфа-фетопротеина и эпидермального фактора роста для избирательной доставки антисмысловых олигонуклеотидов и оценка их эффективности.
Научная новизна и практическая значимость.
Доказано наличие рецепторов АФП как на поверхности клеток опухолевых линий человека, так и на гистологических срезах злокачественных опухолей человека (яичника, молочной железы, печени, желудка, кишечника). На срезах доброкачественных опухолей и нормальных тканей, а также на поверхности покоящихся лимфоцитов, выделенных из крови здоровых добровольцев, рецептор АФП не обнаружен. Таким образом, рецептор АФП может быть использован в качестве опухолевого маркера для широкого спектра злокачественных опухолей, а антитела к рецептору - для диагностики опухолей.
Сформулирована и разработана концепция системы адресной доставки биологически активных соединений в клетки-мишени с использованием в качестве адресного мотива АФП и его пептидных фрагментов.
Разработаны методы, позволяющие в экспериментах in vitro в культурах клеток прогнозировать эффективность препаратов избирательного действия.
Впервые обнаружено, что рекомбинантный С-концевой фрагмент АФП (с 357 по 590 а.о.) специфически связывается с рецептором АФП, эндоцитируется опухолевыми клетками подобно АФП и аналогично АФП ингибирует эстрадиол-индуцированный рост гормонозависимых опухолевых клеток. Таким образом, данный рекомбинантный белок может быть использован в качестве векторной молекулы в системах адресной доставки.
Созданы генные конструкции для индуцированного биосинтеза С-концевых фрагментов АФП в E.coli. Разработаны высокоэффективные методы выделения рекомбинантных фрагментов АФП.
Впервые показана способность биологически активного фрагмента АФП -октапептида GIP8 (472-479 а.о.) избирательно связываться с поверхностью опухолевых клеток, с высокой эффективностью интернализоваться ими, что открывает возможность использования GIP8 в качестве вектора в системах адресной доставки.
Доказана эффективность и избирательность противоопухолевого действия конъюгатов АФП, АФП-ЗВС и GIP8 in vitro в отношении клеточных линий широкого спектра опухолей человека. Изучены закономерности их внутриклеточной транслокации, продемонстрирована зависимость эффективности действия конъюгатов от лабильности химической связи между белком и цитостатическим агентом.
При использовании систем адресной доставки на основе АФП обнаружена возможность преодоления множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток, обусловленной активностью Pgpl70
Впервые продемонстрирована высокая противоопухолевая эффективность конъюгата АФП с эсперамицином Aib in vivo.
Разработаны системы избирательной доставки терапевтических олигонуклеотидов и продемонстрирована принципиальная возможность и перспективность использования белковых векторов (АФП и эпидермального фактора роста) для их адресной доставки в опухолевые клетки.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Рецептор альфа-фетопротеина является уникальным опухолеспецифическим антигеном, который присутствует на поверхности опухолевых клеток и отсутствует у большинства нормальных клеток.
2. Рецептор альфа-фетопротеина может служить мишенью для избирательной противоопухолевой терапии. Связываясь специфически со своим рецептором, альфа-фетопротеин интернализуется опухолевыми клетками вместе с ковалентно присоединенными к нему молекулами лекарственных соединений, обеспечивая, таким образом, избирательную доставку препаратов в опухолевые клетки.
3. Использование систем адресной доставки на основе альфа-фетопротеина позволяет преодолеть множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток, обусловленную ABC-транспортерами плазматической мембраны.
4. Рекомбинантные фрагменты альфа-фетопротеина, содержащие рецептор-связывающий мотив, могут быть использованы в системах избирательной доставки вместо полноразмерного природного белка.
5. Применение белковых векторов (АФП и эпидермального фактора роста) позволяет значительно повысить эффективность внутриклеточной доставки антисмысловых олигонуклеотидов.
Личный вклад автора состоит в разработке идеи, организации и проведении экспериментальных исследований, анализе, обобщении и интерпретации полученных результатов. Все эксперименты с культурами клеток выполнены непосредственно автором. Апробация работы.
Основные результаты работы были доложены на V International Symposium on Biology and Clinical Usefulness of Tumor Markers (1995, Barcelona, Spain), XVI Intern.
Congress of Clinical Chemistry, (1996, London), The interdependence of Tumor Biology and Clinical Oncology (1996, Coronado, USA) , p. 121.Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (ISOBM) (1996, 1997, 1998, 1999, 2000, 2001, 2005), The European cancer conference ECCO (1997, France), Российском Национальном конгрессе "Человек и лекарство" (2000, 2005, Москва), 37th Annual Scientific Meeting of the European Society for Clinical Investigation (2003, Verona, Italy), 1st EUFEPS Conference on Optimising Drug Delivery and Formulation: New Challenges in Drug Delivery (2003, Versailles, France), The 5th ISTC/Korea workshop on biotechnology (2004, Chungbuk, Korea), World Conference on Magic Bullets (2004, Nürnberg, Germany), международной конференции Молекулярная медицина и биобезопасность (2005, Москва), III Московском международном конгрессе "Биотехнология: состояние и перспективы развития" (2005, Москва), Московской международной конференции "Биотехнология и медицина" (2006, Москва), 19th Meeting of the European Association for Cancer Research (EACR), Budapest, Hungary, July 1 -4, 2006, конференции "Новая технологическая платформа биомедицинских исследований (биология, здравоохранение, фармация)" (2006, Ростов-на-Дону), I международной научно-практической конференции "Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине" (2010, Москва).
Структура и объем диссертации. Работа изложена на 256 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы, который включает 406 источников. Диссертация содержит 94 рисунка и 14 таблиц.
Похожие диссертационные работы по специальности «Биохимия», 03.01.04 шифр ВАК
Разработка противоопухолевых препаратов направленного действия на основе пептидных векторов и химиопрепаратов 2004 год, кандидат биологических наук Аль-Названи Нассер Салем
Рекомбинантные фрагменты альфа-фетопротеина человека для создания лекарств адресной доставки 2012 год, кандидат биологических наук Шарапова, Ольга Андреевна
Конструирование белок-нуклеиновых комплексов для направленного транспорта в клетки чужеродной ДНК 2010 год, кандидат биологических наук Татаринова, Ольга Николаевна
Синтез и исследование транспортных форм противоопухолевых лекарственных веществ на основе альфа-фетопротеина и полимерных наночастиц 2000 год, кандидат биологических наук Бобрускин, Алексей Игоревич
Получение и изучение противоопухолевого потенциала антиангиогенных полипептидов и химиопрепаратов направленного действия 2006 год, кандидат биологических наук Дигтярь, Антон Васильевич
Заключение диссертации по теме «Биохимия», Посыпанова, Галина Ароновна
1. Разработана концепция системы адресной доставки биологически активных соединений в опухолевые клетки, в которой в качестве адресного мотива используется альфа-фетопротеин (АФП) и его фрагменты.
2. Установлено наличие рецепторов АФП как на поверхности клеток опухолевых линий человека, так и на клетках злокачественных опухолей человека (яичника, молочной железы, печени, желудка, кишечника). На срезах доброкачественных опухолей и нормальных тканей, а также на поверхности лимфоцитов здоровых добровольцев, рецептор АФП не обнаружен.
3. Показано, что не только АФП, но и его рекомбинантные С-концевые фрагменты специфически связываются с рецептором АФП и эндоцитируются опухолевыми клетками.
4. Обнаружено, что биологически активный фрагмент АФП - октапептид GIP8 избирательно связывается с неизвестным рецептором на поверхности опухолевых клеток, с высокой эффективностью интернализуется и может быть использован в качестве вектора в системах адресной доставки.
5. Установлено, что конъюгаты противоопухолевых препаратов с АФП избирательно аккумулируются клетками-мишенями, оказывают выраженное цитостатическое воздействие на опухолевые клетки и малотоксичны для нормальных клеток человека; при этом эффективность действия конъюгатов определяется лабильностью химической связи между белком и цитотоксическим агентом.
6. Использование систем адресной доставки на основе АФП позволяет преодолеть множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток, обусловленную активностью Pgpl70.
7. Эффективность транспорта доксорубицина в опухолевые клетки в составе конъюгатов с АФП значительно превосходит эффективность его транспорта в составе конъюгатов с трансферрином и сывороточным альбумином.
8. Показана высокая противоопухолевая активность конъюгата АФП с эсперамицином Aib in vivo, при использовании модели перевиваемой опухоли мышей (излечение -30%, увеличение продолжительности жизни - 163%).
9. Конъюгат фрагмента АФП GIP8 с доксорубицином избирательно накапливается в чувствительных и резистентных линиях опухолевых клеток, оказывает выраженное цитостатическое воздействие на опухолевые клетки и малотоксичен для мононуклеарных лейкоцитов человека.
Продемонстрирована перспективность использования белковых векторов на основе АФП и эпидермального фактора роста для адресной доставки антисмысловых олигонуклеотидов в клетки-мишени.
Заключение.
Настоящая работа посвящена исследованию закономерностей при конструировании систем направленной доставки лекарственных препаратов на основе белковых векторов. Исследование особенностей внутриклеточной транслокации исследуемых препаратов, сопоставление их с биологической активностью в отношении опухолевых и нормальных клеток in vitro помогает прогнозировать успех той или иной стратегии и, таким образом, оптимизировать процесс создания эффективных противоопухолевых препаратов избирательного действия.
Использование адресного компонента определяет взаимодействие САД со строго определенными клетками и тканями, обеспечивая, таким образом, избирательность действия препаратов. Механизм рецептор-опосредованного эндоцитоза способствует аккумуляции лекарственного препарата, молекулярная мишень которого находится внутри клетки.
Сравнение САД, представляющих собой конъюгаты (векторный белок)-линкер-(лекарственный препарат), где в качестве векторного белка использовали сывороточный альбумин, трансферрин и альфа-фетопротеин, показало преимущество последнего как по способности аккумулироваться опухолевыми клетками, так и по цитотоксической активности для этих клеток. В этих конъюгатах в качестве линкера использовали гидразид 3-малеимидобензойной кислоты, а в качестве лекарственного препарата - доксорубицин. Указанный линкер является кислотолабильным и может подвергаться гидролизу в таких клеточных компартментах, как эндосомы и лизосомы, высвобождая при этом лекарственный препарат из САД. Доксорубицин - антибиотик из группы антрациклинов, является эффективным и широко используемым терапевтическим агентом. Существует два основных механизма, согласно которым препарат вызывает клеточную гибель : интеркаляция в ДНК, в результате которой ДОКС встраивается между двумя соседними нуклеотидами, обеспечивая прочное взаимодействие с ДНК и нарушая репликацию и транскрипцию; связывание и ингибирование топоизомеразы II. За счет наличия в структуре хиноновой группировки ДОКС участвует в окислительно-восстановительных процессах, что приводит к образованию свободных радикалов, индуцирующих повреждения ДНК и перекисное окисление липидов. Эффективность терапии ДОКС зависит от его внутриклеточного накопления.
Свободный ДОКС, благодаря своей гидрофобности, быстро проникает в клетки и клеточные ядра. Скорость захвата клетками ДОКС в составе конъюгата определяется количеством специфических рецепторов на поверхности клеток-мишеней и интенсивностью рецептор-опосредованного эндоцитоза.
В качестве векторных белков (адресных компонентов) кроме АФП мы использовали хорошо известные транспортные белки HSA и Trf, которые активно эндоцитируются опухолевыми клетками и с той или иной успешностью используются для внутриопухолевой доставки лекарственных препаратов (см. Обзор литературы, раздел 1.5). Однако, конъюгат АФП с ДОКС значительно превосходил аналогичные конъюгаты ДОКС с HSA и Trf как по эффективности накопления в опухолевых клетках, так и по цитотоксической активности в отношении этих клеток.
Исследование экспрессии рецептора АФП на поверхности клеток опухолевых линий человека и нормальных лимфоцитов периферической крови, а также на гистологических срезах раковых, доброкачественных и нормальных тканей с помощью моноклональных антител к АФПР выявило преимущественное присутствие указанного рецептора в клетках злокачественных опухолей. Позднее наши результаты были подтверждены исследованиями R. Moro . Таким образом, АФПР может служить уникальной мишенью на поверхности опухолевых клеток, а системы доставки на основе его природного лиганда - АФП -обеспечивать избирательную доставку лекарственных препаратов в эти клетки. Анализ связывания и эндоцитоза флуоресцентно меченного АФП позволяет говорить о высокой эффективности и специфичности накопления АФП в активно пролиферирующих опухолевых клетках, и отсутствии накопления этого белка в непролиферирующих лимфоцитах.
Исследование in vitro противоопухолевой эффективности ряда конъюгатов на основе АФП, в которых в качестве цитотоксических компонентов использовали разнообразные цитостатики, противоопухолевые антибиотики, антиметаболиты, фотосенсибилизаторы (доксорубицин, дауномицин, калихеамицин, блеомицин, эсперамицин, цисплатин, карбоксифосфамид, винбластин, метотрексат, фталоцианины) продемонстрировало их высокую избирательную противоопухолевую активность. Конъюгат АФП с эсперамицином Aib проявлял значительную эффективность в модельных экспериментах in vivo при лечении мышей с экспериментальными опухолями, препятствуя развитию опухолей и увеличивая в несколько раз продолжительность жизни животных. Следует отметить, что указанный антибиотик, относящийся к ендиинам, является крайне токсичным соединением. Химическая структура ендииновых антибиотиков имеет общий элемент, часто называемый "боеголовкой", который представляет собой 10-членный ендииновый цикл, содержащий две ацетиленовые связи в a-положениях к двойной связи или оксирановому циклу. В физиологических условиях и при определенной активации такая «боеголовка» претерпевает перегруппировку в реакционноспособный бирадикал . Цитотоксическое действие эсперамицина обусловлено индукцией одно- и двунитевых разрывов ДНК. Клинические испытания этого препарата закончились неудачей из-за его высокой системной токсичности. Пожалуй, единственная возможность использовать потенциал этого антибиотика - это повысить его селективность путем химического присоединения к векторным молекулам, обеспечив адресную доставку в опухоль, что и было нами сделано.
Необходимо отметить особую важность при конструировании САД выбора линкера, связывающего векторный белок с цитотоксическим агентом. Цитостатик может быть успешно доставлен в клетку-мишень, но если не обеспечить своевременное его отщепления от вектора, биологический эффект реализован либо не будет, либо будет слабо выражен. Анализ эффективности конъюгатов АФП с ДОКС, в которых были использованы линкеры, отличающиеся по своей лабильности, показал, что наиболее активными были конъюгаты, при синтезе которых использовали глутаровый альдегид и гидразид 3-малеимидобензойной кислоты. Цитотоксическая активность конъюгатов АФП с ДОКС коррелировала с накоплением ДОКС в ядрах клеток: чем быстрее это происходило, тем активней был конъюгат. При использовании в качестве линкера N-оксисукцинимидного эфира 3-(2-дитиопиридил)пропионовой кислоты, локализация в клетках ДОКС была преимущественно цитоплазматической, даже через сутки после применения конъюгата. При этом данный конъюгат проявлял очень низкую активность (в 25 раз ниже, чем свободный ДОКС). По-видимому, прочная дисульфидная связь препятствует быстрому отщеплению ДОКС в эндосомах. В клетках ферменты, способные восстанавливать дисульфидную связь (тиол-протеиндисульфидредуктаза, тиоредоксин, глутаредоксин, гамма-интерферон индуцибельная лизосомальная тиолредуктаза - GILT), локализованы в полости микросом, в структурах комплекса Гольджи ; тиоредоксин и глутаредоксин катализируют восстановление дисульфидных связей в ядре и цитоплазме ; GILT - в поздних эндосомах/лизосомах (оптимум pH 4-5) . Восстановление дисульфидных связей в белках происходит в поздних эндосомах/лизосомах после ограниченного протеолиза катепсинами . Восстановление дисульфидной связи под действием тиол-протеиндисульфидредуктазы значительно замедляется при снижении pH . Высвобождение ДОКС из конъюгатов, в которых антибиотик присоединен к белку с помощью дисульфидной связи, по всей видимости происходит достаточно медленно, чем и объясняется низкая цитотоксическая активность таких конъюгатов. Вторым фактором, который мог влиять на эффективность действия обсуждаемого конъюгата, является модификация по аминогруппе сахарного остатка ДОКС при введении тиольной группы с помощью SPDP. Хотя в ряде работ было продемонстрировано получение активных конъюгатов ДОКС с антителами с использованием данной стратегии синтеза, в других исследованиях было показано, что модификация ДОКС по аминосахару снижает цитотоксическую активность данного антибиотика и приводит к потере цитотоксической активности антрациклина в составе конъюгата .
Тем не менее, применение SPDP при синтезе конъюгатов АФП с EsA, оказалось весьма эффективным. Действительно, цитотоксичность конъюгата при тестировании in vitro была по большей части ниже токсичности свободного EsA. Однако, в результате повышения избирательности действия EsA в составе конъюгата, удалось добиться значительного успеха при испытании конъюгата in vivo.
Полученные результаты позволяют прогнозировать уровень эффективности препаратов направленного действия на основе белковых векторных молекул. Эффективность действия таких препаратов зависит не только от белка-вектора, но, в значительной степени, от типа химической связи между белком и противоопухолевым антибиотиком. Эта связь не должна быть слишком прочной, так как при этом теряются преимущества адресной доставки: невзирая на высокую внутриклеточную концентрацию антибиотика последний может не оказывать фармакологического воздействия, если не достигает своей мишени. Но связь не должна быть чересчур лабильной, так как препарат должен сохранять свою целостность до взаимодействия с клетками-мишенями. При этом при создании адресной конструкции, необходимо учитывать, что отщепление препарата (антибиотика, цитостатика и др.) от молекулы белка будет происходить, вероятнее всего, в эндосомах при значениях рН 5.5-6, то есть линкер, связывающий молекулу АФП с лекарством в идеале должен гидролизоваться при указанных значениях рН либо являться субстратом эндосомальных ферментов.
Важнейшим свойством синтезированных конъюгатов на основе АФП являлась их способность обращать множественную лекарственную устойчивость, обусловленную активностью АВС-транспортеров.
Полученные результаты позволяют заключить, что АФП можно эффективно применять в качестве адресного агента для доставки противоопухолевых лекарственных препаратов в опухолевые клетки различного происхождения.
Пожалуй, единственным значимым недостатком природного АФП человека является источник его выделения: в препаративных количествах АФП можно выделять только из абортивного материала. В пуповинной крови - использованном нами биоматериале, содержание АФП значительно ниже, и, собственно говоря, это тоже не лучший биологический источник. Поэтому мы поставили задачу получения рекомбинантного белкового вектора - фрагмента АФП, содержащего рецептор-связывающий участок, идентичный таковому в природной молекуле. Полученный рекомбинантный С-концевой фрагмент АФП (гАФП27) специфически связывался с рецептором АФП на опухолевых клетках и эндоцитировался ими аналогично полноразмерному АФП человека. гАФП27 сохранял также и некоторые другие биологические свойства полноразмерного белка. Использование гАФП27 в качестве вектора в САД открывает возможность практического использования потенциала белка как лиганда для АФПР.
Трансформированные клетки характеризуются изменениями генов, связанными с регуляцией клеточной пролиферации и апоптоза. Среди многочисленных исследований, посвященных разработке новых агентов избирательного действия для опухолевых клеток, особое место принадлежит антисмысловым олигонуклеотидам. ASON являются одним из классов новых агентов, способных ингибировать синтез специфических опухолеассоциированных белков путем связывания с кодирующей эти белки мРНК, тем самым блокируя синтез белка. Многие модифицированные (в частности, тиофосфатные) ASON in vitro демонстрировали убедительное снижение экспрессии целевого гена и предполагалось их успешное действие в отношении широкого спектра опухолей. Препятствием, снижающим избирательность действия ASON, является отсутствие в настоящее время адекватной и эффективной САД этих соединений в клетки-мишени, необходимой для реализации терапевтического потенциала ASON.
Трансформированные клетки характеризуются изменениями генов, связанными с регуляцией клеточной пролиферации и апоптоза. Среди многочисленных исследований, посвященных разработке новых агентов избирательного действия для опухолевых клеток, особое место принадлежит антисмысловым олигонуклеотидам. Антисмысловые олигонуклеотиды являются одним из таких классов новых агентов, способных ингибировать синтез специфических опухолеассоциированных белков путем связывания с кодирующей эти белки мРНК, тем самым блокируя синтез белка. В последние десятилетия некоторые антисенсы были разработаны и испытаны в доклинических и клинических исследованиях. Многие из них показали в системах in vitro убедительное снижение экспрессии целевого гена и предполагалось их успешное действие в отношении широкого спектра опухолей. Однако, из-за генетической неоднородности опухолей, использование антисенсов в качестве единственного лекарственного препарата, как представляется, не будут эффективны в лечении заболеваний. Антисенс-терапия, направленная на вмешательство в сигнальные пути, участвующие в клеточной пролиферации и апоптоза, являются особенно перспективными в сочетании с обычным противоопухолевым лечением .
Доставка тиофосфатных А8(Ж в опухолевые клетки в виде конъюгатов с АФП оказалась чрезвычайно эффективной, так как позволяла преодолевать барьер цитоплазматической мембраны, ограничивающей проникновение АБОИ в клетки. Эта эффективность проявлялась либо в виде прямого цитостатического действия, либо в виде сенсибилизации клеток-мишеней к действию других противоопухолевых препаратов. При этом было обнаружено, что неспецифическая токсичность некоторых последовательностей (Ж не являлась препятствием для применения этих (Ж, так как использование векторной молекулы в САД ограничивало их токсичность опухолевыми клетками. Однако синтез конъюгатов оказался весьма трудозатратным процессом, сопровождавшимся к тому же значительными потерями белка и АБОЫ. Альтернативные конструкции, представляющие собой нековалентные комплексы белков с АБОМ, возможно, являются более технологичными. ОЫ, в особенности их тиофосфатные аналоги, обладают высоким отрицательным зарядом и способны образовывать прочные комплексы с поликатионными молекулами. Для повышения эффективности образования таких комплексов в молекулы рекомбинантных белков (гАФП27 и ЕвР) была внесена положительно заряженная последовательность, обеспечивающая их прочное взаимодействие с ЛБОМ. Полученные конструкции проявили себя как удачные САД, не только многократно повышающие эффективность аккумуляции АБОК в клетках, характеризующихся повышенным содержанием рецепторов упомянутых белков, но и защищая природные фосфодиэфирные ОЫ от деградации. Однако, использование в качестве адресного компонента САД митогена, которым является ЕОР, ограничивает спектр применяемых АБОЫ, препятствуя в ряде случаев реализации биологического эффекта. Возможно, решению этой проблемы может помочь модификация рецептор-связывающего участка молекулы ЕвР, в результате которой будет утрачена способность рецептора активироваться (способность к аутофосфорилированию), но не влияющая на способность рецептора интернализоваться после связывания со своим лигандом.
Результаты экспериментальных исследований, представленные в данной работе, свидетельствуют о высокой эффективности и избирательности систем адресной доставки на основе альфа-фетопротеина, его фрагментов и модифицированного эпидермального фактора роста.
Прогресс в изучении молекулярных механизмов патогенеза заболеваний и появление новых методов в области молекулярной биологии и биотехнологии открывают возможности для разработки новых лекарств, которые избирательно влияют на различные сигнальные пути, характерные для в опухолевых клеток и, таким образом, появляется возможность целенаправленного индивидуального лечения на основе уникального комплекса молекулярных мишеней, продуцирующихся опухолью пациента. Лекарственные препараты могут достигать мишени самостоятельно (например, терапевтические антитела), либо в составе систем доставки, ориентированных на конкретные органы, пораженные опухолью, или непосредственно к поверхности или внутрь раковых клеток. Понимание клеточной биологии опухоли, изучение микроокружения опухолевых клеток позволит разработать эффективные варианты лекарственных препаратов направленного действия.
Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Посыпанова, Галина Ароновна, 2013 год
1. Jain R.K. Delivery of molecular and cellular medicine to solid tumors. // Adv Drug Deliv Rev. 2001. V. 46. №1-3. P. 149-168.
2. Jang S.H., Wientjes M.G., Lu D., Au J.L. Drug delivery and transport to solid tumors. // Pharm Res. 2003. V. 20. №9. P. 1337-1350.
3. Grillo-Lopez A.J., White C.A., Varns C., Shen D., Wei A., McClure A., Dallaire B.K. Overview of the clinical development of rituximab: first monoclonal antibody approved for the treatment of lymphoma. // Semin Oncol. 1999. V. 26. №5 Suppl 14. P. 66-73.
4. Huhn D., von Schilling C„ Wilhelm M„ Ho A.D., Hallek M., Kuse R, Knauf W„ Riedel U., Hinke A., Srock S., Serke S., Peschel C., Emmerich B. Rituximab therapy of patients with B-cell chronic lymphocytic leukemia. // Blood. 2001. V. 98. №5. P. 1326-1331.
5. Gribben J.G., Hallek M. Rediscovering alemtuzumab: current and emerging therapeutic roles. //Br J Haematol. 2009. V. 144. №6. P. 818-831.
6. Ravandi F., O"Brien S. Alemtuzumab in CLL and other lymphoid neoplasms. // Cancer Invest. 2006. V. 24. №7. P. 718-725.
7. Alinari L., Lapalombella R., Andritsos L., Baiocchi R.A., Lin T.S., Byrd J.C. Alemtuzumab (Campath-IH) in the treatment of chronic lymphocytic leukemia. // Oncogene. 2007. V. 26. №25. P. 3644-3653.
8. Baselga J. A review of EGFR targeted therapy. // Clin Adv Hematol Oncol. 2003. V. 1. №4. P. 218-219.
9. Fischgrabe J., Wulfing P. Targeted therapies in breast cancer: established drugs and recent developments. // Curr Clin Pharmacol. 2008. V. 3. №2. P. 85-98.
10. Goldenberg M.M. Trastuzumab, a recombinant DNA-derived humanized monoclonal antibody, a novel agent for the treatment of metastatic breast cancer. // Clin Ther. 1999. V. 21. №2. P. 309-318.
11. Slamon D.J., Clark G.M., Wong S.G., Levin W.J., Ullrich A., McGuire W.L. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. // Science. 1987. V. 235. №4785. P. 177-182.
12. Azim H., Azim H.A., Jr. Targeting Her-2/neu in breast cancer: as easy as this! // Oncology. 2008. V. 74. №3-4. P. 150-157.
13. Albanell J., Codony J., Rovira A., Mellado В., Gascon P. Mechanism of action of anti-HER2 monoclonal antibodies: scientific update on trastuzumab and 2C4. // Adv Exp Med Biol. 2003. V. 532. P.253-268.
14. Stern M., Herrmann R. Overview of monoclonal antibodies in cancer therapy: present and promise. // Crit Rev Oncol Hematol. 2005. V. 54. №1. P. 11-29.
15. Gutheil J. The promise of monoclonal antibodies for the therapy of cancer. // Crit Rev Oncol Hematol. 2001. V. 38. №1. P. 1-2.
16. Моисеенко B.M. Моноклональные антитела в лечении злокачественных опухолей. // Практическая онкология. 2003. V. 4. №3. Р. 148-156.
17. Guillemard V., Uri Saragovi Н. Prodrug chemotherapeutics bypass p-glycoprotein resistance and kill tumors in vivo with high efficacy and target-dependent selectivity. // Oncogene. 2004. V. 23. №20. P. 3613-3621.
18. Ricart A.D., Tolcher A.W. Technology Insight: cytotoxic drug immunoconjugates for cancer therapy. // Nat Clin Prac Oncol. 2007. V. 4. №4. P. 245-255.
19. Younes A., Bartlett N.L., Leonard J.P., Kennedy D.A., Lynch C.M., Sievers E.L., Forero-Torres A. Brentuximab Vedotin (SGN-35) for Relapsed CD30-Positive Lymphomas. // New England Journal of Medicine. V. 363. №19. P. 1812-1821.
20. Krop I.E., Beeram M., Modi S., Jones S.F., Holden S.N., Yu W., Girish S., Tibbitts J., Yi J.-H., Sliwkowski M.X., Jacobson F., Lutzker S.G., Burris H.A. Phase I Study of Trastuzumab
21. DM1, an HER2 Antibody-Drug Conjugate, Given Every 3 Weeks to Patients With HER2-Positive Metastatic Breast Cancer. // Journal of Clinical Oncology. V. 28. №16. P. 2698-2704.
22. Stasi R. Gemtuzumab ozogamicin: an anti-CD33 immunoconjugate for the treatment of acute myeloid leukaemia. // Expert Opin Biol Ther. 2008. V. 8. №4. P. 527-540.
23. Tsimberidou A.M., Giles F.J., Estey E., O"Brien S., Keating M.J., Kantarjian H.M. The role of gemtuzumab ozogamicin in acute leukaemia therapy. // Br J Haematol. 2006. V. 132. №4. P. 398-409.
24. Gao Z., McAlister V.C., Williams G.M. Repopulation of liver endothelium by bone-marrow-derived cells. // Lancet. 2001. V. 357. №9260. P. 932-933.
25. Zein N., Sinha A.M., McGahren W.J., Ellestad G.A. Calicheamicin gamma II: an antitumor antibiotic that cleaves double-stranded DNA site specifically. // Science. 1988. V. 240. №4856. P. 1198-1201.
26. Reiter Y. Recombinant immunotoxins in targeted cancer cell therapy. // Adv Cancer Res. 2001. V. 81. P. 93-124.
27. Goyal A., Batra J.K. Inclusion of a furin-sensitive spacer enhances the cytotoxicity of ribotoxin restrictocin containing recombinant single-chain immunotoxins. // Biochem J. 2000. V. 345 Pt 2. P. 247-254.
28. Kreitman R.J. Recombinant immunotoxins containing truncated bacterial toxins for the treatment of hematologic malignancies. // BioDrugs. 2009. V. 23. №1. P. 1-13.
29. Jain R.K., Baxter L.T. Mechanisms of heterogeneous distribution of monoclonal antibodies and other macromolecules in tumors: significance of elevated interstitial pressure. // Cancer Res. 1988. V. 48. №24 Pt 1. P. 7022-7032.
30. Green M.C., Murray J.L., Hortobagyi G.N. Monoclonal antibody therapy for solid tumors. // Cancer Treat Rev. 2000. V. 26. №4. P. 269-286.
31. Brada M. BCL2 gene: current relevance to clinical oncology. // Eur J Cancer. 1992. V. 28. №1. P. 270-272.
32. Yip K.W., Reed J.C. Bcl-2 family proteins and cancer. // Oncogene. 2008. V. 27. №50. P. 6398-6406.
33. Reed J.C. Bcl-2 family proteins: strategies for overcoming chemoresistance in cancer. // Adv Pharmacol. 1997. V. 41. P. 501-532.
34. Reed J.C. Bel-2 family proteins: regulators of chemoresistance in cancer. // Toxicol Lett. 1995. V. 82-83. P. 155-158.
35. Tarhini A.A., Kirkwood J.M. Oblimersen in the treatment of metastatic melanoma. // Future Oncol. 2007. V. 3. №3. P. 263-271.
36. Oblimersen: Augmerosen, BCL-2 antisense oligonucleotide Genta, G 3139, GC 3139, oblimersen sodium. // Drugs R D. 2007. V. 8. №5. P. 321-334.
37. Manoharan M. Oligonucleotide conjugates as potential antisense drugs with improved uptake, biodistribution, targeted delivery, and mechanism of action. /"/ Antisense Nucieic Acid Drug Dev. 2002. V. 12. №2. P. 103-128.
38. Abels C. Targeting of the vascular system of solid tumours by photodynamic therapy (PDT). // Photochem Photobiol Sci. 2004. V. 3. №8. P. 765-771.
39. Nowis D., Makowski M., Stoklosa T., Legat M., Issat T., Golab J. Direct tumor damage mechanisms of photodynamic therapy. // Acta Biochim Pol. 2005. V. 52. №2. P. 339-352.
40. Robertson C.A., Evans D.H., Abrahamse H. Photodynamic therapy (PDT): a short review on cellular mechanisms and cancer research applications for PDT. // J Photochem Photobiol B. 2009. V. 96. №1. P. 1-8.
41. Aveline B.M., Redmond R.W. Exclusive Free Radical Mechanisms of Cellular Photosensitization. // Photochemistry and Photobiology. 1998. V. 68. №3. P. 266-275.
42. Henderson B.W., Dougherty T.J. How does photodynamic therapy work? // Photochem Photobiol. 1992. V. 55. №1. P. 145-157.
43. Cahill M.T., Smith B.T., Fekrat S. Adverse reaction characterized by chest pain, shortness of breath, and syncope associated with verteporfin (visudyne). // Am J Ophthalmol. 2002. V. 134. №2. P. 281-282.
44. Cheng Y., A C.S., Meyers J.D., Panagopoulos I., Fei B., Burda C. Highly efficient drug delivery with gold nanoparticle vectors for in vivo photodynamic therapy of cancer. // J Am Chem Soc. 2008. V. 130. №32. P. 10643-10647.
45. Sharman W.M., van Lier J.E., Allen C.M. Targeted photodynamic therapy via receptor mediated delivery systems. // Adv Drug Deliv Rev. 2004. V. 56. №1. P. 53-76.
46. Oleinick N.L., Evans H.H. The photobiology of photodynamic therapy: cellular targets and mechanisms. // Radiat Res. 1998. V. 150. №5 Suppl. P. S146-156.
47. Rosenkranz A.A., Jans D.A., Sobolev A.S. Targeted intracellular delivery of photosensitizers to enhance photodynamic efficiency. // Immunol Cell Biol. 2000. V. 78. №4. P. 452-464.
48. Rozanova Torshina N., Zhang J.Z., Heck D.E. Catalytic therapy of cancer with porphyrins and ascorbate. // Cancer Lett. 2007. V. 252. №2. P. 216-224.
49. Хорошева Е.В., Герасимова Г.К., Калия O.J1. Изучение механизма транспорта терафтала в опухолевые клетки
50. Российский биотерапевтический журнал 2007. V. 6. №1. Р. 8.
51. Кульбачевская Н.Ю., Манзюк Л.В., Михайлова JI.M. Клинико-экспериментальное изучение токсичности противоопухолевой каталитической системы «терафтал+аскорбиновая кислота» («ТФ+АК»). // Российский биотерапевтический журнал. 2004. V. 3. №2. Р. 70.
52. Ravi Kumar M.N. Nano and microparticles as controlled drug delivery devices. // J Pharm Pharm Sci. 2000. V. 3. №2. P. 234-258.
53. Brannon-Peppas L., Blanchette J.O. Nanoparticle and targeted systems for cancer therapy. // Adv Drug Deliv Rev. 2012. V. P.
54. Fu Q., Sun J., Zhang W., Sui X., Yan Z., He Z. Nanoparticle Albumin bound (nab) Technology is a Promising Method for Anti-cancer Drug Delivery. // Recent Pat Anticancer Drim Dkrnv 9ПП9 V P
55. Karmali P.P., Kotamraju V.R., Kastantin M., Black M., Missirlis D., Tirrell M., Ruoslahti E. Targeting of albumin-embedded paclitaxel nanoparticles to tumors. //Nanomedicine. 2009. V, 5. №1. P. 73-82.
56. Henderson I.C., Bhatia V. Nab-paclitaxel for breast cancer: a new formulation with an improved safety profile and greater efficacy. // Expert Rev Anticancer Ther. 2007. V. 7. №7. P. 919-943.
57. Moreno-Aspitia A., Perez E.A. Nanoparticle albumin-bound paclitaxel (ABI-007): a newer taxane alternative in breast cancer. // Future Oncol. 2005. V. 1. №6. P. 755-762.
58. Bareford L.M., Swaan P.W. Endocytic mechanisms for targeted drug delivery. // Advanced drug delivery reviews. 2007. V. 59. №8. P. 748-758.
59. Mousavi S.A., Malerod L., Berg T., Kjeken R. Clathrin-dependent endocytosis. // Biochem J. 2004. V. 377. №Pt l.P. 1-16.
60. Rodemer C., Haucke V. Clathrin/AP-2-dependent endocytosis: a novel playground for the pharmacological toolbox? // Handb Exp Pharmacol. 2008. V. №186. P. 105-122.
61. Mousavi S.A., Malerod L., Berg T., Kjeken R. Clathrin-dependent endocytosis. // The Biochemical journal. 2004. V. 377. №Pt 1. P. 1-16.
62. Slepnev Y.I., De Camilli P. Accessory factors in clathrin-dependent synaptic vesicle endocytosis. //Nat Rev Neurosci. 2000. V. 1. №3. P. 161-172.
63. Marsh M., McMahon H.T. The structural era of endocytosis. // Science. 1999. V. 285. №5425. P. 215-220.
64. Bareford L.M., Swaan P.W. Endocytic mechanisms for targeted drug delivery. // Adv Drug Deliv Rev. 2007. V. 59. №8. P. 748-758.
65. Hinshaw J.E., Schmid S.L. Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding. //Nature. 1995. V. 374. №6518. P. 190-192.
66. Ferguson S.M., De Camilli P. Dynamin, a membrane-remodelling GTPase. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2012. V. 13. №2. P. 75-88.
67. Aniento F., Emans N., Griffiths G., Gruenberg J. Cytoplasmic dynein-dependent vesicular transport from early to late endosomes. // The Journal of cell biology. 1993. V. 123. №6 Pt 1. P. 1373-1387.
68. Stahl P.D., Barbieri M.A. Multivesicular bodies and multivesicular endosomes: the "ins and outs" of endosomal traffic. // Science"s STKE: signal transduction knowledge environment. 2002. V. 2002. №141. P. pe32.
69. Piper R.C., Luzio J.P. Late endosomes: sorting and partitioning in multivesicular bodies. // Traffic. 2001. V. 2. №9. P. 612-621.
70. Pillay C.S., Elliott E., Dennison C. Endolysosomal proteolysis and its regulation. // The Biochemical journal. 2002. V. 363. №Pt 3. P. 417-429.
71. Eskelinen E.-L. Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. // Molecular Aspects of Medicine. 2006. V. 27. №5-6. P. 495-502.
72. Smart E.J., Graf G.A., McNiven M.A., Sessa W.C., Engelman J.A., Scherer P.E., Okamoto T., Lisanti M.P. Caveolins, liquid-ordered domains, and signal transduction. // Mol Cell Biol. 1999. V. 19. №11. P. 7289-7304.
73. Khalil I.A., Kogure K., Akita H., Harashima H. Uptake pathways and subsequent intracellular trafficking in nonviral gene delivery. // Pharmacol Rev. 2006. V. 58. №1. P. 32-45.
74. Lajoie P., Nabi I.R. Chapter 3 Lipid Rafts, Caveolae, and Their Endocytosis. In: Kwang WJ, editor. International Review of Cell and Molecular Biology: Academic Press; 2010. p. 135163.
75. Damm E.M., Pelkmans L., Kartenbeck J., Mezzacasa A., Kurzchalia T., Helenius A. Clathrin- and caveolin-1-independent endocytosis: entry of simian virus 40 into cells devoid of caveolae. // J Cell Biol. 2005. V. 168. №3. P. 477-488.
76. Rawat A., Vaidya B., Khatri K., Goyal A.K., Gupta P.N., Mahor S., Paliwal R., Rai S., Vyas S.P. Targeted intracellular delivery of therapeutics: an overview. // Die Pharmazie. 2007. V. 62. №9. P. 643-658.
77. Fenton C., Perry C.M. Gemtuzumab ozogamicin: a review of its use in acute myeloid leukaemia. // Drugs. 2005. V. 65. №16. P. 2405-2427.
78. Cang S., Mukhi N., Wang K., Liu D. Novel CD20 monoclonal antibodies for lymphoma therapy. // Journal of Hematology & Oncology. 2012. V. 5. №1. P. 64.
79. Chari R.V.J. Targeted Cancer Therapy: Conferring Specificity to Cytotoxic Drugs. // Accounts of Chemical Research. 2007. V. 41. №1. P. 98-107.
80. Casi G., Neri D. Antibody-drug conjugates: basic concepts, examples and future perspectives. // Journal of controlled release: official journal of the Controlled Release Society. 2012. V. 161. №2. P. 422-428.
81. Uckun F.M., Narla R.K., Jun X., Zeren Т., Venkatachalam Т., Waddick K.G., Rostostev A., Myers D.E. Cytotoxic activity of epidermal growth factor-genistein against breast cancer cells. // Clin Cancer Res. 1998. V. 4. №4. P. 901-912.
82. Rihova B. Targeting of Drugs to Cell Surface Receptors. // Critical Reviews in Biotechnology. 1997. V. 17. №2. P. 149-169.
83. Jaracz S., Chen J., Kuznetsova L.V., Ojima I. Recent advances in tumor-targeting anticancer drug conjugates. // Bioorganic & medicinal chemistry. 2005. V. 13. .№17. P. 50435054.
84. Bildstein L., Dubernet C., Couvreur P. Prodrug-based intracellular delivery of anticancer agents. // Advanced drug delivery reviews. 2011. V. 63. №1-2. P. 3-23.
85. Singh Y., Palombo M., Sinko P.J. Recent trends in targeted anticancer prodrug and conjugate design. // Current medicinal chemistry. 2008. V. 15. №18. P. 1802-1826.
86. Sanderson R.J., Hering M A., James S.F., Sun M.M., Doronina S.O., Siadak A.W., Senter P.D., Wahl A.F. In vivo drug-linker stability of an anti-CD30 dipeptide-linked auristatin immunoconjugate. // Clin Cancer Res. 2005. V. 11. №2 Pt 1. P. 843-852.
87. Krippendorff B.F., Kuester K., Kloft C., Huisinga W. Nonlinear pharmacokinetics of therapeutic proteins resulting from receptor mediated endocytosis. // J Pharmacokinet Pharmacodyn. 2009. V. 36. №3. P. 239-260.
88. Malyankar U.M. Tumor-associated antigens and biomarkers in cancer and immune therapy. // Int Rev Immunol. 2007. V. 26. №3-4. P. 223-247.
89. Тюряева И.И. Опухолевые антигены. // Цитология. 2008. V. 50. №3. Р. 189-209.
90. Duffour M.T., Chaux P., Lurquin C., Cornells G., Boon Т., van der Bruggen P. A MAGE-A4 peptide presented by HLA-A2 is recognized by cytolytic T lymphocytes. // Eur J Immunol. 1999. V. 29. №10. P. 3329-3337.
91. Houghton A.N. Cancer antigens: immune recognition of self and altered self. // J Exp Med. 1994. V. 180. №1. P. 1-4.
92. Carubia J.M., Yu R.K., Macala L.J., Kirkwood J.M., Varga J.M. Gangliosides of normal and neoplastic human melanocytes. // Biochem Biophys Res Commun. 1984. V. 120. №2. P. 500-504.
93. Tang C.K., Katsara M., Apostolopoulos V. Strategies used for MUC1 immunotherapy: human clinical studies. // Expert Rev Vaccines. 2008. V. 7. №7. P. 963-975.
94. Casalini P., Iorio M.V., Galmozzi E., Menard S. Role of HER receptors family in development and differentiation. //J Cell Physiol. 2004. V. 200. №3. P. 343-350.
95. Olayioye M.A., Neve R.M., Lane H.A., Hynes N.E. The ErbB signaling network: receptor heterodimerization in development and cancer. // EMBO J. 2000. V. 19. №13. P. 3159-3167.
96. Барышников А.Ю. Взаимоотношение опухоли и иммунной системы организма. // Практическая онкология. 2003. V. 4. №3. Р. 127-130.
97. Wang D., Rayani S., Marshall J.L. Carcinoembryonic antigen as a vaccine target. // Expert Rev Vaccines. 2008. V. 7. №7. P. 987-993.
98. Singer J.W., De Vries P., Bhatt R, Tulinsky J., Klein P., Li C., Milas L., Lewis R.A., Wallace S. Conjugation of camptothecins to poly-(L-glutamic acid). // Ann N Y Acad Sci. 2000. V. 922. P.136-150.
99. Nicolay K., Fok J.J., Voorhout W. Post LA, de Kruijff B. Cytofluorescence detection of adriamycin-mitochondria interactions in isolated, perfused rat heart. // Biochim Biophys Acta. 1986. V. 887. №1. P. 35-41.
100. Evdokimova V.N., Butterfield L.H. Alpha-fetoprotein and other tumour-associated antigens for immunotherapy of hepatocellular cancer. // Expert Opin Biol Ther. 2008. V. 8. №3. P. 325336.
101. Abelev G.I., Eraiser T.L. Cellular aspects of alpha-fetoprotein reexpression in tumors. // Semin Cancer Biol. 1999. V. 9. №2. P. 95-107.
102. Mizejewski G.J. Alpha-fetoprotein structure and function: relevance to isoforms, epitopes, and conformational variants. // Exp Biol Med (Maywood). 2001. V. 226. №5. P. 377-408.
103. Castelli C., Rivoltini L., Andreola G., Carrabba M., Renkvist N., Parmiani G. T-cell recognition of melanoma-associated antigens. // J Cell Physiol. 2000. V. 182. №3. P. 323-331.
104. Van den Eynde B., Peeters O., De Backer O., Gaugier B., Lucas S., Boon T. A new family of genes coding for an antigen recognized by autologous cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. // J Exp Med. 1995. V. 182. №3. P. 689-698.
105. Lewis J. J., Houghton A.N. Definition of tumor antigens suitable for vaccine construction. // Semin Cancer Biol. 1995. V. 6. №6. P. 321-327.
106. Deprez-de Campeneere D., Masquelier M., Baurain R., Trouet A. Drug targeting in cancer treatment: active daunorubicin-protein conjugates. // Prog Clin Biol Res. 1982. V. 102 pt A. P. 291-298.
107. Maeda H., Wu J., Sawa T., Matsumura Y., Hori K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. // J Control Release. 2000. V. 65. №1-2. P. 271-284.
108. Noguchi Y., Wu J., Duncan R., Strohalm J., Ulbrich K., Akaike T., Maeda H. Early phase tumor accumulation of macromolecules: a great difference in clearance rate between tumor and normal tissues. // Jpn J Cancer Res. 1998. V. 89. №3. P. 307-314.
109. Kratz F., Beyer U. Serum proteins as drug carriers of anticancer agents: a review. // Drug Deliv. 1998. V. 5. №4. P. 281-299.
110. Kratz F., Beyer U., Collery P., Lechenault F., Cazabat A., Schumacher P., Falken U., Unger C. Preparation, characterization and in vitro efficacy of albumin conjugates of doxorubicin. // Biol Pharm Bull. 1998. V. 21. №1. P. 56-61.
111. Kratz F., Beyer U, Roth T., Schutte M.T., Unold A., Fiebig H.H., Unger C. Albumin conjugates of the anticancer drug chlorambucil: synthesis, characterization, and in vitro efficacy. // Arch Pharm (Weinheim). 1998. V. 331. №2. P. 47-53.
112. Association for Medical Oncology of the German Cancer Society. // Clin Cancer Res. 1999. V. 5. №4. P. 753-759.
113. Warnecke A., Fichtner I., Sass G., Kratz F. Synthesis, cleavage profile, and antitumor efficacy of an albumin-binding prodrug of methotrexate that is cleaved by plasmin and cathepsin B. // Arch Pharm (Weinheim). 2007. V. 340. №8. P. 389-395.
114. Kratz F., Drevs J., Bing G., Stockmar C., Scheuermann K., Lazar P., Unger C. Development and in vitro efficacy of novel MMP2 and MMP9 specific doxorubicin albumin conjugates. // Bioorg Med Chem Lett. 2001. V. 11. №15. P. 2001-2006.
115. Kratz F., Beyer U., Schutte M.T. Drug-polymer conjugates containing acid-cleavable bonds. // Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1999. V. 16. №3. P. 245-288.
116. Kratz F., Warnecke A., Schmid B., Chung D.E., Gitzel M. Prodrugs of anthracyclines in cancer chemotherapy. // Curr Med Chem. 2006. V. 13. №5. P. 477-523.
117. Unger C., Haring B., Medinger M., Drevs J., Steinbild S., Kratz F., Mross K. Phase I and pharmacokinetic study of the (6-maleimidocaproyl)hydrazone derivative of doxorubicin. // Clin Cancer Res. 2007. V. 13. №16. P. 4858-4866.
118. Kratz F., Mansour A., Soltau J., Warnecke A., Fichtner I., Unger C., Drevs J. Development of albumin-binding doxorubicin prodrugs that are cleaved by prostate-specific antigen. // Arch Pharm (Weinheim). 2005. V. 338. №10. P. 462-472.
119. Abu Ajaj K., Graeser R., Fichtner I., Kratz F. In vitro and in vivo study of an albumin-binding prodrug of doxorubicin that is cleaved by cathepsin B. // Cancer Chemother Pharmacol. 2009. V. 64. №2. P. 413-418.
120. Ajaj K.A., Biniossek M.L., Kratz F. Development of protein-binding bifunctional linkers for a new generation of dual-acting prodrugs. // Bioconjug Chem. 2009. V. 20. №2. P. 390-396.
121. Abu Ajaj K., Kratz F. Development of dual-acting prodrugs for circumventing multidrug resistance. // Bioorg Med Chem Lett. 2009. V. 19. №3. P. 995-1000.
122. Dautry-Varsat A. Receptor-mediated endocytosis: the intracellular journey of transferrin and its receptor. // Biochimie. 1986. V. 68. №3. P. 375-381.
123. Daniels T.R., Delgado T., Rodriguez J.A., Helguera G., Penichet M.L. The transferrin receptor part I: Biology and targeting with cytotoxic antibodies for the treatment of cancer. // Clin Immunol. 2006. V. 121. №2. P. 144-158.
124. Gomme P.T., McCann K.B., Bertolini J. Transferrin: structure, function and potential therapeutic actions. // Drug Discov Today. 2005. V. 10. №4. P. 267-273.
125. Singh M., Atwal H., Micetich R. Transferrin directed delivery of adriamycin to human cells. // Anticancer Res. 1998. V. 18. №3A. P. 1423-1427.
126. Berczi A., Barabas K., Sizensky J.A., Faulk W.P. Adriamycin conjugates of human transferrin bind transferrin receptors and kill K562 and HL60 cells. // Arch Biochem Biophys. 1993. V. 300. №1. P. 356-363.
127. Sun I.L., Sun E.E., Crane F.L., Morre D.J., Faulk W.P. Inhibition of transplasma membrane electron transport by transferrin-adriamycin conjugates. // Biochim Biophys Acta. 1992. V. 1105. №1. P. 84-88.
128. Berczi A., Ruthner M., Szuts V., Fritzer M., Schweinzer E., Goldenberg H. Influence of conjugation of doxorubicin to transferrin on the iron uptake by K562 cells via receptor-mediated endocytosis. // Eur J Biochem. 1993. V. 213. №1. P. 427-436.
129. Lai B.T., Gao J.P., Lanks K.W. Mechanism of action and spectrum of cell lines sensitive to a doxorubicin-transferrin conjugate. // Cancer Chemother Pharmacol. 1998. V. 41. №2. P. 155160.
130. Daniels T.R., Delgado T., Helguera G., Penichet M.L. The transferrin receptor part II: targeted delivery of therapeutic agents into cancer cells. // Clin Immunol. 2006. V. 121. №2. P. 159-176.
131. Hoshino T., Misaki M., Yamamoto M., Shimizu H., Ogawa Y., Toguchi H. In vitro cytotoxicities and in vivo distribution of transferrin-platinum(II) complex. // J Pharm Sci. 1995. V. 84. №2. P. 216-221.
132. Elliott R.L., Stjernholm R., Elliott M.C. Preliminary evaluation of platinum transferrin (MPTC-63) as a potential nontoxic treatment for breast cancer. // Cancer Detect Prev. 1988. V. 12. №1-6. P. 469-480.
133. Head J.F., Wang F., Elliott R.L. Antineoplastic drugs thai interfere with iron metabolism in cancer cells. //Adv Enzyme Regul. 1997. V. 37. P. 147-169.
134. Beyer U., Roth T., Schumacher P., Maier G., Unold A., Frahm A.W., Fiebig H.H., Unger C., Kratz F. Synthesis and in vitro efficacy of transferrin conjugates of the anticancer drug chlorambucil. //J Med Chem. 1998. V. 41. №15. P. 2701-2708.
135. Tanaka T., Shiramoto S., Miyashita M., Fujishima Y., Kaneo Y. Tumor targeting based on the effect of enhanced permeability and retention (EPR) and the mechanism of receptor-mediated endocytosis (RME). // Int J Pharm. 2004. V. 277. №1-2. P. 39-61.
136. Frankel A.E. Increased sophistication of immunotoxins. // Clin Cancer Res. 2002. V. 8. №4. P. 942-944.
137. Frankel A.E., Neville D.M., Bugge T.A., Kreitman R.J., Leppla S.H. Immunotoxin therapy of hematologic malignancies. // Semin Oncol. 2003. V. 30. №4. P. 545-557.
138. Martell L.A., Agrawal A., Ross D.A., Muraszko K.M. Efficacy of transferrin receptor-targeted immunotoxins in brain tumor cell lines and pediatric brain tumors. // Cancer Res. 1993. V. 53. №6. P. 1348-1353.
139. Weaver M., Laske D.W. Transferrin receptor ligand-targeted toxin conjugate (Tf-CRM107) for therapy of malignant gliomas. // J Neurooncol. 2003. V. 65. №1. P. 3-13.
140. Hyer M.L., Sudarshan S., Kim Y., Reed J.C., Dong J.Y., Schwartz D.A., Norris J.S. Downregulation of c-FLIP sensitizes DU145 prostate cancer cells to Fas-mediated apoptosis. // Cancer Biol Ther. 2002. V. 1. №4. P. 401-406.
141. Gijsens A., Missiaen L., Merlevede W., de Witte P. Epidermal growth factor-mediated targeting of chlorin e6 selectively potentiates its photodynamic activity. // Cancer Res. 2000. V. 60. №8. P. 2197-2202.
142. Shimizu N., Shimizu Y., Miskimins W.K. EGF-ricin A conjugates: kinetic profiles of cytotoxic effects and resistant cell variants. // Cell Struct Funct. 1984. V. 9. №3. P. 203-212.
143. Drin G., Mazel M., Clair P., Mathieu D., Kaczorek M., Temsamani J. Physico-chemical requirements for cellular uptake of pAntp peptide. Role of lipid-binding affinity. // Eur J Biochem. 2001. V. 268. №5. P. 1304-1314.
144. Vives E., Richard J.P., Rispal C., Lebleu B. TAT peptide internalization: seeking the mechanism of entry. // Curr Protein Pept Sci. 2003. V. 4. №2. P. 125-132.
145. Krauss U., Kratz F., Beck-Sickinger A.G. Novel daunorubicin-carrier peptide conjugates derived from human calcitonin segments. // J Mol Recognit. 2003. V. 16. №5. P. 280-287.
146. Rezler E.M., Bearss D.J., Hurley L.H. Telomere inhibition and telomere disruption as processes for drug targeting. // Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2003. V. 43. P. 359-379.
147. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. // Analytical Biochemistry. 1987. V. 162. №1. P. 156159.
148. Nechushtan A., Yarkoni S., Marianovsky I., Lorberboum-Galski H. Adenocarcinoma cells are targeted by the new GnRH-PE66 chimeric toxin through specific gonadotropin-releasing hormone binding sites. // J Biol Chem. 1997. V. 272. №17. P. 11597-11603.
149. Liu T.F., Cohen K.A., Ramage J.G., Willingham M.C., Thorburn A.M., Frankel A.E. A diphtheria toxin-epidermal growth factor fusion protein is cytotoxic to human glioblastoma multiforme cells. // Cancer Res. 2003. V. 63. №8. P. 1834-1837.
150. Osborne C.K., Coronado-Heinsohn E. Targeting the epidermal growth factor receptor in breast cancer cell lines with a recombinant ligand fusion toxin (DAB389EGF). // Cancer J Sci Am. 1996. V. 2. №3. P. 175-180.
151. Turturro F. Denileukin diftitox: a biotherapeutic paradigm shift in the treatment of lymphoid-derived disorders. // Expert Rev Anticancer Ther. 2007. V. 7. №1. P. 11-17.
152. Wong B.Y., Gregory S.A., Dang N.H. Denileukin diftitox as novel targeted therapy for lymphoid malignancies. // Cancer Invest. 2007. V. 25. №6. P. 495-501.
153. Duvic M., Talpur R. Optimizing denileukin diftitox (Ontak) therapy. // Future Oncol. 2008. V. 4. №4. P. 457-469.
154. Foss F. Clinical experience with denileukin diftitox (ONTAK). // Semin Oncol. 2006. V. 33. №1 Suppl 3. P. SI 1-16.
155. Mavromatis B.H., Cheson B.D. Novel therapies for chronic lymphocytic leukemia. // Blood Rev. 2004. V. 18. №2. P. 137-148.
156. Walker P.L., Dang N.H. Denileukin diftitox as novel targeted therapy in non-Hodgkin"s lymphoma. // Clin J Oncol Nurs. 2004. V. 8. №2. P. 169-174.
157. Eklund J.W., Kuzel T.M. Denileukin diftitox: a concise clinical review. // Expert Rev Anticancer Ther. 2005. V. 5. №1. P. 33-38.
158. Black J.H., McCubrey J.A., Willingham M.C., Ramage J., Hogge D.E., Frankel A.E. Diphtheria toxin-interleukin-3 fusion protein (DT(388)IL3) prolongs disease-free survival of leukemic immunocompromised mice. // Leukemia. 2003. V. 17. №1. P. 155-159.
159. Frankel A., Liu J.S., Rizzieri D., Hogge D. Phase I clinical study of diphtheria toxin-interleukin 3 fusion protein in patients with acute myeloid leukemia and myelodysplasia. // Leuk Lymphoma. 2008. V. 49. №3. P. 543-553.
160. Shimamura T., Husain S.R., Puri R.K. The IL-4 and IL-13 pseudomonas exotoxins: new hope for brain tumor therapy. // Neurosurg Focus. 2006. V. 20. №4. P. El 1.
161. Therapy with and without Temozolomide in Newly Diagnosed Malignant Gliomas: Phase 1 Study of Final Safety Results. //Neurosurgery. 2008. V. P.
162. Jarboe J.S., Johnson K.R., Choi Y., Lonser R.R., Park J.K. Expression of interleukin-13 receptor alpha2 in glioblastoma multiforme: implications for targeted therapies. // Cancer Res. 2007. V. 67. №17. P. 7983-7986.
163. Aqeilan R., Yarkoni S., Lorberboum-Galski H. Interleukin 2-Bax: a novel prototype of human chimeric proteins for targeted therapy. // FEBS Lett. 1999. V. 457. №2. P. 271-276.
164. Aqeilan R., Kedar R., Ben-Yehudah A., Lorberboum-Galski H. Mechanism of action of interleukin-2 (IL-2)-Bax, an apoptosis-inducing chimaeric protein targeted against cells expressing the IL-2 receptor. // Biochem J. 2003. V. 370. №Pt 1. P. 129-140.
165. Bergstrand C.G., Czar B. Demonstration of a new protein fraction in serum from the human fetus. // Scand J Clin Lab Invest. 1956. V. 8. №2. P. 174.
166. Абелев Г.И., Перова С.Д., Храмкова Н.И., Постникова З.А., С. И.И. Эмбриональный сывороточный а-глобулин и его синтез перевиваемыми гепатомами мышей. // Биохимия. 1963. V. 28. №4. Р. 625-634.
167. Татаринов Ю.С. Обнаружение эмбриоспецифического а-глобулина в сыворотке крови больного первичным раком печени. // Вопр. мед. химии. 1964. V. 10. Р. 90-91.
168. Абелев Г.И., Эльгорт Д.А. Альфа-фетопротеин как иммунологический маркер гепатоцеллюлярного рака и тератокарциномы яичка и яичников. // Онкология. 1978. V. 10. Р. 3-17.
169. Brock D.J., Bolton А.Е., Monaghan J.M. Prenatal diagnosis of anencephaly through maternal serum-alphafetoprotein measurement. // Lancet. 1973. V. 2. №7835. P. 923-924.
170. Aitken D.A., Crossley J.A. Neural tube defects/alpha-fetoprotein/Down"s syndrome screening. // Curr Opin Obstet Gynecol. 1997. V. 9. №2. P. 113-120.
171. Deutsch H.F. Chemistry and biology of alpha-fetoprotein. // Adv Cancer Res. 1991. V. 56.т» t i nг. zjj-j1z.
172. Luft A.J., Lorscheider F.L. Structural analysis of human and bovine alpha-fetoprotein by electron microscopy, image processing, and circular dichroism. // Biochemistry. 1983. V. 22. №25. P. 5978-5981.
173. Johnson P.J., Poon T.C., Hjelm N.M., Ho C.S., Blake С., Ho S.K. Structures of disease-specific serum alpha-fetoprotein isoforms. // Br J Cancer. 2000. V. 83. №10. P. 1330-1337.
174. Parmelee D.C., Evenson M.A., Deutsch H.F. The presence of fatty acids in human alpha-fetoprotein. // J Biol Chem. 1978. V. 253. №7. P. 2114-2119.
175. Urano Y., Sakai M., Watanabe K., Tamaoki T. Tandem arrangement of the albumin and alpha-fetoprotein genes in the human genome. // Gene. 1984. V. 32. №3. P. 255-261.
176. Лазаревич Н.Л. Молекулярные механизмы регуляции экспрессии гена альфа-фетопротеина. // Биохимия. 2000. V. 65. №1. Р. 139-158.
177. Jose-Estanyol М., Danan J.L. A liver-specific factor and nuclear factor I bind to the rat alpha-fetoprotein promoter. // J Biol Chem. 1988. V. 263. №22. P. 10865-10871.
178. Crowe A.J., Sang L., Li K.K., Lee K.C., Spear B.T., Barton M.C. Hepatocyte nuclear factor 3 relieves chromatin-mediated repression of the alpha-fetoprotein gene. // J Biol Chem. 1999. V. 274. №35. P. 25113-25120.
179. Galarneau L., Pare J., Allard D., Hamel D., Levesque L., Tugwood J., Green S., Belanger L. The alpha 1-fetoprotein locus is activated by a nuclear receptor of the Drosophila FTZ-F1 family. // Mol. Cell. Biol. 1996. V. 16. №7. P. 3853-3865.
180. Shen H., Luan F., Liu H., Gao L., Liang X., Zhang L., Sun W., Ma C. ZHX2 is a repressor of a-fetoprotein expression in human hepatoma cell lines. // Journal of Cellular and Molecular Medicine. 2008. V. 12. №6b. P. 2772-2780.
181. Van Reeth Т., Gabant P., Szpirer C., Szpirer J. Stimulation of the alphaj-feioproiein promoter by unliganded thyroid hormone receptor in association with protein deacetylation. // Molecular and Cellular Endocrinology. 2002. V. 188. №1-2. P. 99-109.
182. Lienard P., De Mees C., Drnze P.L., Dieu M., Dierick J.F., Raes M., Szpirer J., Szpirer C. Regulation of the alpha-fetoprotein promoter: Ku binding and DNA spatial conformation. // Biochimie. 2006. V. 88. №10. P. 1409-1417.
183. Mizejewski G.J. Biological roles of alpha-fetoprotein during pregnancy and perinatal development. // Exp Biol Med (Maywood). 2004. V. 229. №6. P. 439-463.
184. Nishihira J., Koyama Y., Sakai M., Nishi S. The fatty acid binding site of human alpha-fetoprotein. // Biochem Biophys Res Commun. 1993. V. 196. №3. P. 1049-1057.
185. Iturralde M., Alava M.A., Gonzalez B., Anel A., Pineiro A. Effect of alpha-fetoprotein and albumin on the uptake of polyunsaturated fatty acids by rat hepatoma cells and fetal rat hepatocytes. // Biochim Biophys Acta. 1991. V. 1086. №1. P. 81-88.
186. Mizejewski G.J., Pass K.A. Fatty acids, alpha-fetoprotein, and cystic fibrosis. // Pediatrics. 2001. V. 108. №6. P. 1370-1373.
187. Mizejewski G.J., Antelman D.E., Keenan J.F., Preiss I.L. Effects of heavy metals on alpha-fetoprotein in maternal sera and amniotic fluid of pregnant mice. // Toxicology. 1990. V. 64. №1. P. 19-32.
188. Keel B.A., Eddy K.B., He Y., Gangrade B.K., May J.V. Purified human alpha-fetoprotein inhibits follicle-stimulating hormone-stimulated estradiol production by porcine granulosa cells in culture. // Mol Cell Endocrinol. 1993. V. 94. №1. P. 21-25.
189. Mizejewski G.J., Vonnegut M., Jacobson H.I. Estradiol-activated alpha-fetoprotein suppresses the uterotropic response to estrogens. // Proc Natl Acad Sci USA. 1983. V. 80. №9. P. 2733-2737.
190. Jacobson H.I., Bennett J.A., Mizejewski G.J. Inhibition of estrogen-dependent breast cancer growth by a reaction product of alpha-fetoprotein and estradiol. // Cancer Res. 1990. V. 50. №2. P. 415-420.
191. Mizejewski G.J., Warner A.S. Alpha-fetoprotein can regulate growth in the uterus of the immature and adult ovariectomized mouse. // J Reprod Fertil. 1989. V. 85. №1. P. 177-185.
192. Mizejewski G.J., Vonnegut M., Jacobson H.I. Studies of the intrinsic antiuterotropic activity of murine alpha-fetoprotein. // Tumour biology. 1986. V. 7. №1. P. 19-36.
193. Jacobson H.I., Lemanski N-, Narendran A., .Agarwal A., Bennett J.A., Andersen T.T. Hormones of pregnancy, alpha-feto protein, and reduction of breast cancer risk. // Adv Exp Med Biol. 2008. V. 617. P. 477-484.
194. Mizejewski G.J. Biological role of alpha-fetoprotein in cancer: prospects for anticancer therapy. // Expert Rev Anticancer Ther. 2002. V. 2. №6. P. 709-735.
195. Li M.S., Li P.F., He S.P., Du G.G., Li G. The promoting molecular mechanism of alpha-fetoprotein on the growth of human hepatoma Bel7402 cell line. // World J Gastroenterol. 2002. V. 8. №3. P. 469-475.
196. Li M.S., Li P.F., Yang F.Y., He S.P., Du G.G., Li G. The intracellular mechanism of alpha-fetoprotein promoting the proliferation of NIH 3T3 cells. // Cell Res. 2002. V. 12. №2. P. 151156.
197. Li M.S., Li P.F., Li G., Du G.G. Enhancement of proliferation of HeLa cells by the alpha-fetoprotein. // Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai). 2002. V. 34. №6. P. 769-774.
198. Li M., Li H., Li C., Wang S., Jiang W., Liu Z., Zhou S., Liu X., McNutt M.A., Li G. Alpha-fetoprotein: A new member of intracellular signal molecules in regulation of the PI3K/AKT signaling in human hepatoma cell lines. // Int J Cancer. V. P.
199. Chakraborty M., Mandal C. Immuno-suppressive effect of human alphafetoprotein: a cross species study. // Immunol Invest. 1993. V. 22. №5. P. 329-339.
200. Um S.H., Mulhall C., Alisa A., Ives A.R., Karani J., Williams R., Bertoletti A., Behboudi S. {alpha}-Fetoprotein Impairs APC Function and Induces Their Apoptosis. // J Immunol. 2004. V. 173. №3. P. 1772-1778.
201. Irony-Tur-Sinai M., Grigoriadis N., Lourbopoulos A., Pinto-Maaravi F., Abramsky O., Brenner T. Amelioration of autoimmune neuroinflammation by recombinant human alpha-fetoprotein. // Exp Neurol. 2006. V. 198. №1. P. 136-144.
202. Черешнев B.A., Родионов С.Ю. Черкасов В А, Малютина Н.Н., Орлов О.А. Альфа-фетопротеин. Екатеринбург: УрО РАН; 2004.
203. Dudich Е. ММ-093, a recombinant human alpha-fetoprotein for the potential treatment of rheumatoid arthritis and other autoimmune diseases. // Curr Opin Mol Ther. 2007. V. 9. №6. P. 603-610.
204. Laderoute M.P., Pilarski L.M. The inhibition of apoptosis by alpha-fetoprotein (AFP) and the role of AFP receptors in anti-cellular senescence. // Anticancer Res. 1994. V. 14. №6B. P. 2429-2438.
205. Ohkawa K., Hatano T., Tsukada Y., Matsuda M. Chemotherapeutic efficacy of the protein-doxorubicin conjugates on multidrug resistant rat hepatoma cell line in vitro. // Br J Cancer. 1993. V. 67. №2. P. 274-278.
206. Lubgan D., Jozwiak Z., Grabenbauer G.G., Distel L.V. Doxorubicin-transferrin conjugate selectively overcomes multidrug resistance in leukaemia cells. // Cell Mol Biol Lett. 2009. V. 14. №1. P. 113-127.
207. Sarti D.A., Crandall B.F., Winter J., Robertson R.D., Kaback N.M., Karp L.E. Correlation of biparietal and fetal body diameters: 12-26 weeks gestation. // AJR. American journal of roentgenology. 1981. V. 137. №1. P. 87-91.
208. Dingemans A.C., van Ark-Otte J., Span S., Scagliotti G.V., van der Valk P., Postmus P.E., Giaccone G. Topoisomerase Ilalpha and other drug resistance markers in advanced non-small cell lung cancer. // Lung Cancer. 2001. V. 32. №2. P. 117-128.
209. Bass H.N., Sparkes R.S., Crandall B.F., Marcy S.M. Congenital contractural arachnodactyly, keratoconus, and probable Marfan syndrome in the same pedigree. // The Journal of pediatrics. 1981. V. 98. №4. P. 591-593.
210. Mohandas T., Crandall B.F., Sparkes R.S., Passage M.B., Sparkes M.C. Late replication studies in a human X/13 translocation: correlation with autosomal gene expression. // Cytogenetics and cell genetics. 1981. V. 29. №4. P. 215-220.
211. Uriel J., Villacampa M.J., Moro R., Naval J., Failly-Crepin C. Uptake of radiolabeled alpha-fetoprotein by mouse mammary carcinomas and its usefulness in tumor scintigraphy. // Cancer Res. 1984. V. 44. №11. P. 5314-5319.
212. Baba T., Damke H., Hinshaw J.E., Ikeda K., Schmid S.L., Warnock D.E. Role of dynamin in clathrin-coated vesicle formation. // Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology. 1995. V. 60. P. 235-242.
213. Uriel J., Poupon M.F., Geuskens M. Alphafoetoprotein uptake by cloned cell lines derived from a nickel-induced rat rhabdomyosarcoma. // Br J Cancer. 1983. V. 48. №2. P. 261-269.
214. Hajeri-Germond M., Naval J., Trojan J., Uriel J. The uptake of alpha-foetoprotein by C-1300 mouse neuroblastoma cells. // Br J Cancer. 1985. V. 51. №6. P. 791-797.
215. Villacampa M.J., Moro R., Naval J., Failly-Crepin C., Lampreave F., Uriel J. Alpha-fetoprotein receptors in a human breast cancer cell line. // Biochem Biophys Res Commun. 1984. V. 122. №3. P. 1322-1327.
216. Naval J., Villacampa M.J., Goguel A.F., Uriel J. Cell-type-specific receptors for alpha-fetoprotein in a mouse T-lymphoma cell line. // Proc Natl Acad Sci USA. 1985. V. 82. №10. P. 3301-3305.
217. Suzuki Y., Zeng C.Q., Alpert E. Isolation and partial characterization of a specific alpha-fetoprotein receptor on human monocytes. // J Clin Invest. 1992. V. 90. №4. P. 1530-1536.
218. Esteban C., Geuskens M., Uriel J. Activation of an alpha-fetoprotein (AFP)/receptor autocrine loop in HT-29 human colon carcinoma cells. // Int J Cancer. 1991. V. 49. №3. P. 425430.
219. Torres J.M., Laborda J., Naval J., Darracq N., Calvo M., Mishal Z., Uriel J. Expression of alpha-fetoprotein receptors by human T-lymphocytes during blastic transformation. // Mol Immunol. 1989. V. 26. №9. P. 851-857.
220. Biddle W., Sarcione E.J. Specific cytoplasmic alpha-fetoprotein binding protein in MCF-7 human breast cancer cells and primary breast cancer tissue. // Breast Cancer Res Treat. 1987. V. 10. №3. P. 279-286.
221. Mizejewski G.J. Alpha-fetoprotein binding proteins: implications for transmembrane passage and subcellular localization. // Life Sci. 1995. V. 56. №1. P. 1-9.
222. Moro R., Tamaoki T., Wegmann T.G., Longenecker B.M., Laderoute M.P. Monoclonal antibodies directed against a widespread oncofetal antigen: the alpha-fetoprotein receptor. // Tumour Biol. 1993. V. 14. №2. P. 116-130.
223. Kanevsky V., Pozdnyakova L.P., Aksenova O.A., Severin S.E., Katukov V., Severin E.S. Isolation and characterization of AFP-binding proteins from tumor and fetal human tissues. // Biochem Mol Biol Int. 1997. V. 41. №6. P. 1143-1151.
224. Alava M.A., Iturralde M., Lampreave F., Pineiro A. Specific uptake of alpha-fetoprotein and albumin by rat Morris 7777 hepatoma cells. // Tumour Biol. 1999. V. 20. №1. P. 52-64.
225. Mizejewski G.J., MacColl R. Alpha-fetoprotein growth inhibitory peptides: potential leads for cancer therapeutics. // Mol Cancer Ther. 2003. V. 2. №11. P. 1243-1255.
226. Mizejewski G.J., Dias J.A., Hauer C.R., Henrikson K.P., Gierthy J. Alpha-fetoprotein derived synthetic peptides: assay of an estrogen-modifying regulatory segment. // Mol Cell Endocrinol. 1996. V. 118. №1-2. P. 15-23.
227. Butterstein G.M., Mizejewski G.J. Alpha-fetoprotein inhibits frog metamorphosis: implications for protein motif conservation. // Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 1999. V. 124. №1. P. 39-45.
228. Butterstein G., Morrison J., Mizejewski G.J. Effect of alpha-fetoprotein and derived peptides on insulin- and estrogen-induced fetotoxicity. // Fetal Diagn Ther. 2003. V. 18. №5. P. 360-369.
229. Eisele L.E., Mesfin F.B., Bennett J.A., Andersen T.T., Jacobson H.I., Soldwedel H., MacColl Pv., Mizejewski G.J. Studies on a growth-inhibitory peptide derived from alpha-fetoprotein and some analogs. // J Pept Res. 2001. V. 57. №1. P. 29-38.
230. Eisele L.E., Mesfin F.B., Bennett J.A., Andersen T.T., Jacobson H.I., Vakharia D.D., MacColl R., Mizejewski G.J. Studies on analogs of a peptide derived from alpha-fetoprotein having antigrowth properties. // J Pept Res. 2001. V. 57. №6. P. 539-546.
231. Mizejewski G.J., Butterstein G. Survey of functional activities of alpha-fetoprotein derived growth inhibitory peptides: review and prospects. // Curr Protein Pept Sci. 2006. V. 7. №1. P. 73-100.
232. Muehlemann M., Miller K.D., Dauphinee M., Mizejewski G.J. Review of Growth Inhibitory Peptide as a biotherapeutic agent for tumor growth, adhesion, and metastasis. // Cancer Metastasis Rev. 2005. V. 24. №3. P. 441-467.
233. Vakharia D., Mizejewski G.J. Human alpha-fetoprotein peptides bind estrogen receptor and estradiol, and suppress breast cancer. // Breast Cancer Res Treat. 2000. V. 63. №1. P. 41-52.
234. Maurin M., Garnuszek P., Karczmarczyk U., Mirowski M. Studies on 99mTc-labeling of the modified fragment of human alfa-fetoprotein (P149-QY). // Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry. 2008. V. 275. №1. P. 101-107.
235. Linton K.J., Higgins C.F. The Escherichia coli ATP-binding cassette (ABC) proteins. // Mol Microbiol. 1998. V. 28. №1. P. 5-13.
236. Dean M., Rzhetsky A., Allikmets R. The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily. // Genome Res. 2001. V. 11. №7. P. 1156-1166.
237. Dean M., Annilo T. Evolution of the ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily in vertebrates. // Annu Rev Genomics Hum Genet. 2005. V. 6. P. 123-142.
238. Riordan J.R., Ling V. Purification of P-glycoprotein from plasma membrane vesicles of Chinese hamster ovary cell mutants with reduced colchicine permeability. // J Biol Chem. 1979. V. 254. №24. P. 12701-12705.
239. Rees D.C., Johnson E., Lewinson O. ABC transporters: the power to change. // Nat Rev Mol Cell Biol. 2009. V. 10. №3. P. 218-227.
240. Choi C.H. ABC transporters as multidrug resistance mechanisms and the development of chemosensitizers for their reversal. // Cancer Cell Int. 2005. V. 5. P. 30.
241. Deeley R.G., Westlake C., Cole S.P. Transmembrane transport of endo- and xenobiotics by mammalian ATP-binding cassette multidrug resistance proteins. // Physiol Rev. 2006. V. 86. №3. P. 849-899.
242. Baker E.K., El-Osta A. MDR1, chemotherapy and chromatin remodeling. // Cancer Biol Ther. 2004. V. 3. №9. P. 819-824.
243. Labialle S., Gayet L., Marthinet E., Rigal D., Baggetto L.G. Transcriptional regulators of the human multidrug resistance 1 gene: recent views. // Biochem Pharmacol. 2002. V. 64. №5-6. P. 943-948.
244. Breier A., Barancik M., Sulova Z., Uhrik B. P-glycoprotein-implications of metabolism of neoplastic cells and cancer therapy. // Curr Cancer Drug Targets. 2005. V. 5. №6. P. 457-468.
245. Doz F., Roosen N., Rosenblum M.L. Metallothionein and anticancer agents: the role of metallothionein in cancer chemotherapy. // J Neurooncol. 1993. V. 17. №2. P. 123-129.
246. Lazo J.S., Basu A. Metallothionein expression and transient resistance to electrophilic antineoplastic drugs. // Semin Cancer Biol. 1991. V. 2. №4. P. 267-271.
247. Chen A.Y., Liu L.F. DNA topoisomerases: essential enzymes and lethal targets. // Annu Rev Pharmacol Toxicol. 1994. V. 34. P. 191-218.
248. Makin G. Targeting apoptosis in cancer chemotherapy. // Expert Opin Ther Targets. 2002. V. 6. №1. P. 73-84.
249. Fan S., Smith M.L., Rivet D.J., 2nd, Duba D., Zhan Q., Kohn K.W., Fornace A.J., Jr.,
250. П"РАППАГ \/f nicrimti An nf fimptmn opnciti^ap Krooct ломлаг nolle +А Лionlnfmv/ X .1*1, i^iiJl U^/ЫЧ/И VI 1U11VUU11 JVllJiU^VJ l/l WUJl W14J.11/W1. X*A\/1 / WHO IU WlOUlUlill ШШpentoxifylline. // Cancer Res. 1995. V. 55. №8. P. 1649-1654.
251. Sarkar R., Jain R.K., Puri P. Melasma in Indian males. // Dermatol Surg. 2003. V. 29. №2. P. 204.
252. Smith D.J., Ng H., Kluck R.M., Nagley P. The mitochondrial gateway to cell death. // IUBMB Life. 2008. V. 60. №6. P. 383-389.
253. Schwarz M., Andrade-Navarro M.A., Gross A. Mitochondrial carriers and pores: key regulators of the mitochondrial apoptotic program? // Apoptosis. 2007. V. 12. №5. P. 869-876.
254. Sekine I., Shimizu C., Nishio K., Saijo N., Tamura T. A literature review of molecular markers predictive of clinical response to cytotoxic chemotherapy in patients with breast cancer. // Int J Clin Oncol. 2009. V. 14. №2. P. 112-119.
255. Kirkin V., Joos S., Zornig M. The role of Bcl-2 family members in tumorigenesis. // Biochim Biophys Acta. 2004. V. 1644. №2-3. P. 229-249.
256. Daidone M.G., Luisi A., Veneroni S., Benini E., Silvestrini R. Clinical studies of Bcl-2 and treatment benefit in breast cancer patients. // Endocr Relat Cancer. 1999. V. 6. №1. P. 61-68.
257. Adams J.M., Cory S. Bcl-2-regulated apoptosis: mechanism and therapeutic potential. // Curr Opin Immunol. 2007. V. 19. №5. P. 488-496.
258. Wilds C.J., Maier M.A., Tereshko V., Manoharan M., Egli M. Direct observation of a cytosine analogue that forms five hydrogen bonds to guanosine: guanidino G-clamp. // Angew Chem Int Ed Engl. 2002. V. 41. №1. P. 115-117.
259. Cowling V.H., Cole M.D. Mechanism of transcriptional activation by the Myc oncoproteins. // Semin Cancer Biol. 2006. V. 16. №4. P. 242-252.
260. Ponzielli R., Katz S., Barsyte-Lovejoy D., Penn L.Z. Cancer therapeutics: targeting the dark side of Myc. // Eur J Cancer. 2005. V. 41. №16. P. 2485-2501.
261. Dominguez-Sola D., Ying C.Y., Grandori C., Ruggiero L., Chen B., Li M., Galloway D.A., Gu W., Gautier J., Dalla-Favera R. Non-transcriptional control of DNA replication by c-Myc. // Nature. 2007. V. 448. №7152. P. 445-451.
262. Spencer C.A., Groudine M. Control of c-myc regulation in normal and neoplastic cells. // Adv Cancer Res. 1991. V. 56. P. 1-48.
263. Nesbit C.E., Tersak J.M., Prochownik E.V. MYC oncogenes and human neoplastic disease. //Oncogene. 1999. V. 18. №19. P. 3004-3016.
264. Fukumura D., Ushiyama A., Duda D.G., Xu L., Tarn J., Krishna V., Chatterjee K., Garkavtsev I., Jain R.K. Paracrine regulation of angiogenesis and adipocyte differentiation during in vivo adipogenesis. // Circ Res. 2003. V. 93. №9. P. e88-97.
265. Sears R.C. The life cycle of C-myc: from synthesis to degradation. // Cell Cycle. 2004. V. 3. №9. P. 1133-1137.
266. Izumi Y., di Tomaso E., Hooper A., Huang P., Huber J., Hicklin D.J., Fukumura D., Jain R.K., Suit H.D. Responses to antiangiogenesis treatment of spontaneous autochthonous tumors and their isografts. // Cancer Res. 2003. V. 63. №4. P. 747-751.
267. Rapp U.R., Korn C., Ceteci F., Karreman C., Luetkenhaus K., Serafin V., Zanucco E., Castro I., Potapenko T. Myc Is a Metastasis Gene for Non-Small-Cell Lung Cancer. // PLoS One. 2009. V. 4. №6. P. e6029.
268. Ahmed F.E. Molecular markers that predict response to colon cancer therapy. // Expert Rev Mol Diagn. 2005. V. 5. №3. P. 353-375.
269. Butt A.J., McNeil C.M., Musgrove E.A., Sutherland R.L. Downstream targets of growth factor and oestrogen signalling and endocrine resistance: the potential roles of c-Myc, cyclin Dl and cyclin E. // Endocr Relat Cancer. 2005. V. 12 Suppl 1. P. S47-59.
270. Blackburn E.H. Telomeres: structure and synthesis. // J Biol Chem. 1990. V. 265. №11. P. 5919-5921.
271. Olovnikov A.M. A theory of marginotomy. The incomplete copying of template margin in enzymic synthesis of polynucleotides and biological significance of the phenomenon. // J Theor Biol. 1973. V. 41. №1. P. 181-190.
272. Wright W.E., Shay J.W. The two-stage mechanism controlling cellular senescence and immortalization. // Exp Gerontol. 1992. V. 27. №4. P. 383-389.
273. Rhodes D., Fairall L., Simonsson T., Court R., Chapman L. Telomere architecture. // EMBO Rep. 2002. V. 3. №12. P. 1139-1145.
274. Liu J.P. Studies of the molecular mechanisms in the regulation of telomerase activity. // FASEB J. 1999. V. 13. №15. P. 2091-2104.
275. Wu K.J., Grandori C., Amacker M., Simon-Vermot N., Polack A., Lingner J., Dalla-Favera R. Direct activation of TERT transcription by c-MYC. // Nat Genet. 1999. V. 21. №2. P. 220224.
276. Tian X., Chen B., Liu X. Telomere and telomerase as targets for cancer therapy. // Appl Biochem Biotechnol. V. 160. №5. P. 1460-1472.
277. Kang D.I., Kang H.K., Gwak H.S., Han H.K., Lim S.J. Liposome composition is important for retention of liposomal rhodamine in P-glycoprotein-overexpressing cancer cells. // Drug Deliv. 2009. V. 16. №5. P. 261-267.
278. Michieli M., Damiani D., Ermacora A., Masolini P., Michelutti A., Michelutti T., Russo D., Pea F., Baccarani M. Liposome-encapsulated daunorubicin for PGP-related multidrug resistance. // Br J Haematol. 1999. V. 106. №1. P. 92-99.
279. Morinaga T., Sakai M., Wegmann T.G., Tamaoki T. Primary structures of human alpha-fetoprotein and its mRNA. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1983. V. 80. №15. P. 4604-4608.
280. Bogush T., Robert J. Comparative evaluation of the intracellular accumulation and DNA binding of idarubicin and daunorubicin in sensitive and multidrug-resistant human leukaemia K562 cells. // Anticancer Res. 1996. V. 16. №1. P. 365-368.
281. Cartier R., Reszka R. Utilization of synthetic peptides containing nuclear localization signals for nonviral gene transfer systems. // Gene Ther. 2002. V. 9. №3. P. 157-167.
282. Collas P., Alestrom P. Nuclear localization signals: a driving force for nuclear transport of plasmid DNA in zebrafish. // Biochem Cell Biol. 1997. V. 75. №5. P. 633-640.
283. Bremner K.H., Seymour L.W., Logan A., Read ML. Factors influencing the Ability of Nuclear Localization Sequence Peptides To Enhance Nonviral Gene Delivery. // Bioconjugate Chemistry. 2003. V. 15. №1. P. 152-161.
284. Prakash T.P., Kawasaki A.M., Fraser A.S., Vasquez G., Manoharan M. Synthesis of 2"-0-2-[(N,N-dimethylamino)oxy.ethyl] modified nucleosides and oligonucleotides. // J Org Chem. 2002. V. 67. №2. P. 357-369.
285. Fritzer M., Szekeres T., Szuts V., Jarayam H.N., Goldenberg H. Cytotoxic effects of a doxorubicin-transferrin conjugate in multidrug-resistant KB cells. // Biochem Pharmacol. 1996. V. 51. №4. P. 489-493.
286. Lemieux P., Page M. Sensitivity of multidrug-resistant MCF-7 cells to a transferrin-doxorubicin conjugate. // Anticancer Res. 1994. V. 14. №2A. P. 397-403.
287. Garmann D., Warnecke A., Kalayda G.V., Kratz F., Jaehde U. Cellular accumulation and cytotoxicity of macromolecular platinum complexes in cisplatin-resistant tumor cells. // J Control Release. 2008. V. 131. №2. P. 100-106.
288. Sheldon K., Marks A., Baumal R. Sensitivity of multidrug resistant KB-C1 cells to an antibody-dextran-adriamycin conjugate. // Anticancer Res. 1989. V. 9. №3. P. 637-641.
289. Chitambar C.R. Gallium compounds as antineoplastic agents. // Curr Opin Oncol. 2004. V. 16. №6. P. 547-552.
290. Ehrlich P. The partial function of cells. (Nobel Prize address given on 11 December 1908 at Stockholm).. // Int Arch Allergy Appl Immunol. 1954. V. 5. №2. P. 67-86.
291. Butcher E.C., Weissman I.L. Direct fluorescent labeling of cells with fluorescein or rhodamine isothiocyanate. I. Technical aspects. // J Immunol Methods. 1980. V. 37. №2. P. 97108.
292. Le Bouteiller P.P., Mishal Z., Lemonnier F.A., Kourilsky F.M. Quantification by flow cytofluorimetry of HLA class I molecules at the surface of murine cells transformed by cloned HLA genes. // J Immunol Methods. 1983. V. 61. №3. P. 301-315.
293. Fenton C., Perry C.M. Spotlight on gemtuzumab ozogamicin in acute myeloid leukaemia. // BioDrugs: clinical immunotherapeutics, biopharmaceuticals and gene therapy. 2006. V. 20. №2. P. 137-139.
294. Torres J.M., Geuskens M., Uriel J. Receptor-mediated endocytosis and recycling of alpha-fetoprotein in human B-lymphoma and T-leukemia cells. // Int J Cancer. 1991. V. 47. №1. P. 110-117.
295. Esteban C., Trojan J., Macho A., Mishal Z., Lafarge-Frayssinet C., Uriel J. Activation of an alpha-fetoprotein/receptor pathway in human normal and malignant peripheral blood mononuclear cells. // Leukemia. 1993. V. 7. №11. P. 1807-1816.
296. Biaglow J.E., Miller R.A. The thioredoxin reductase/thioredoxin system: novel redox targets for cancer therapy. // Cancer Biol Ther. 2005. V. 4. №1. P. 6-13.
297. Arunachalam В., Phan U.T., Geuze H.J., Cresswell P. Enzymatic reduction of disulfide bonds in lysosomes: characterization of a gamma-interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT). // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. V. 97. №2. P. 745-750.
298. Kooistra Т., Millard P.C., Lloyd J.B. Role of thiols in degradation of proteins by cathepsins. // Biochem J. 1982. V. 204. №2. P. 471-477.
299. Feener E.P., Shen W.C., Ryser H.J. Cleavage of disulfide bonds in endocytosed macromolecules. A processing not associated with lysosomes or endosomes. // J Biol Chem.1qqh v p 18780-1878sx у у V/ . т ^ ■ v <-л. л. » x w I vy v x v f w
300. Bennett J.A., Semeniuk D.J., Jacobson H.I., Murgita R.A. Similarity between natural and recombinant human alpha-fetoprotein as inhibitors of estrogen-dependent breast cancer growth. // Breast Cancer Res Treat. 1997. V. 45. №2. P. 169-179.
301. DiMarco A. Adriamycin (NSC-123127): mode and mechanism of action. // Cancer Chemother. Rep. 1975. V. 6. P. 91-106.
302. Hamza A., Sarma M.H., Sarma R.H. Plausible interaction of an alpha-fetoprotein cyclopeptide with the G-protein-coupled receptor model GPR30: docking study by molecular dynamics simulated annealing. // J Biomol Struct Dyn. 2003. V. 20. №6. P. 751-758.
303. Tan W., Loke Y.H., Stein C.A., Miller P., Colombini M. Phosphorothioate oligonucleotides block the VDAC channel. // Biophys J. 2007. V. 93. №4. P. 1184-1191.
304. Lai J.C., Tan W., Benimetskaya L., Miller P., Colombini M., Stein C.A. A pharmacologic target of G3139 in melanoma cells may be the mitochondrial VDAC. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2006. V. 103. №19. P. 7494-7499.
305. Tan W., Lai J.C., Miller P., Stein C.A., Colombini M. Phosphorothioate oligonucleotides reduce mitochondrial outer membrane permeability to ADP. // Am J Physiol Cell Physiol. 2007. V. 292. №4. P. C1388-1397.
306. Carpenter G., Cohen S. Epidermal growth factor. // Annu Rev Biochem. 1979. V. 48. P. 193-216.
307. Saeki Т., Takashima S., Tachibana М., Koga М., Hiyama Е., Salomon D.S., Holland J.F., Ohnuma Т. Inhibitory effect of telomere-mimic phosphorothioate oligodeoxy nucleotides (S-ODNS) on human tumor cell lines. // Oncology. 1999. V. 57 Suppl 2. P. 27-36.
308. Page T.J., Mata J.E., Bridge J.A., Siebler J.C., Neff J.R., Iversen P.L. The cytotoxic effects of single-stranded telomere mimics on OMA-BL1 cells. // Exp Cell Res. 1999. V. 252. №1. P. 41-49.
309. Berkers J.A., van Bergen en Henegouwen P.M., Boonstra J. Three classes of epidermal growth factor receptors on HeLa cells. // J Biol Chem. 1991. V. 266. №2. P. 922-927.
310. Kroning R., Jones J.A., Horn D.K., Chuang C.C., Sanga R., Los G., Howell S.B., Christen R.D. Enhancement of drug sensitivity of human malignancies by epidermal growth factor. // Br J Cancer. 1995. V. 72. №3. P. 615-619.
311. Blackburn E.H., Chan S., Chang J., Fulton T.B., Krauskopf A., McEachern M., Prescott J., Roy J., Smith C., Wang H. Molecular manifestations and molecular determinants of telomere capping. // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 2000. V. 65. P. 253-263.
312. Collas P., Alestrom P. Nuclear localization signals enhance germline transmission of a transgene in zebrafish. // Transgenic Res. 1998. V. 7. №4. P. 303-309.
313. Morris M.C., Vidal P., Chaloin L., Heitz F., Divita G. A new peptide vector for efficient delivery of oligonucleotides into mammalian cells. // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. №14. P. 2730-2736.
314. Sinha B.K., Politi P.M. Anthracyclines. // Cancer Chemother Biol Response Modif. 1990. V. 11. P. 45-57.
315. Long B.H., Golik J., Forenza S., Ward B., Rehfuss R., Dabrowiak J.C., Catino J.J., Musial S.T., Brookshire K.W., Doyle T.W. Esperamicins, a class of potent antitumor antibiotics: mechanism of action. // Proc Natl Acad Sci USA. 1989. V. 86. №1. P. 2-6.
316. Kaneta Y., Tsukazaki K., Kubushiro K., Sakayori M., Ueda M., Nozawa S. Selective cytotoxicity of adriamycin immunoconjugate of monoclonal antibody MSN-1 to endometrial adenocarcinoma in vitro and in vivo. // Oncol Rep. 2000. V. 7. №5. P. 1099-1106.
317. Jinno H., Ueda M., Enomoto K., Ikeda T., Kyriakos P., Kitajima M. Effectiveness of an adriamycin immunoconjugate that recognizes the C-erbB-2 product on breast cancer cell lines. // Surg Today. 1996. V. 26. №7. P. 501-507.
318. Yamamoto K., Acton E.M., Henry D.W. Antitumor activity of some derivatives of daunorubicin at the amino and methyl ketone functions. // Journal of Medicinal Chemistry. 2002. V. 15. №8. P. 872-875.
319. Arnon R., Sela M. In vitro and in vivo efficacy of conjugates of daunomycin with antitumor antibodies. // Immunol Rev. 1982. V. 62. P. 5-27.
320. Hurwitz E., Levy R., Maron R., Wilchek M., Arnon R., Sela M. The covalent binding of daunomycin and adriamycin to antibodies, with retention of both drug and antibody activities. // Cancer Res. 1975. V. 35. №5. P. 1175-1181.
321. Biroccio A., Leonetti C., Zupi G. The future of antisense therapy: combination with anticancer treatments. // Oncogene. 2003. V. 22. №42. P. 6579-6588.
Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.
Резюме
В обзоре рассмотрены фармакокинетические особенности различных антисмысловых олигонуклеотидных препаратов. Проведено сравнение фармакокинетики препаратов первого и второго поколения. А так же рассмотрено влияние на фармакокинетику химической модификации молекулы.
Ключевые слова : антисмысловые олигонуклеотиды, фосфотиоатные олигодеоксинуклеотиды, фармакокинетика
Введение
Фармакокинетические свойства антисмысловых олигонуклеотидов (АСО) становятся наиболее понятными при рассмотрении их физических и химических свойств. Такие параметры как заряд, молекулярная масса и амфипатическая природа фосфотиоатных АСО оказывают заметное влияние на их фармакокинетику. Особенно значимое влияние на фармакокинетические свойства АСО оказывает химическая структура, в частности фосфотиоатная группа и 2"-метоксиэтил (МОЭ).
Всасывание, распределение, метаболизм, и выведение фосфотиоатных олигодеоксинуклеотидов (ОДН) первого поколения были тщательно изучены на лабораторных животных и в клинических исследованиях . Особенности фармакокинетики препаратов фосфотиоатных АСО заключаются в следующем: введённые парентерально фосфотиоатные ОДН быстро оказываются в плазме крови, где они связываются с гидрофильными участками белков плазмы и таким образом избегают гломерулярной фильтрации. Эти гидрофильные участки отличны от других гидрофильных участков, с которыми связываются липофильные препараты, и, таким образом, конкуренция за связывание с белками плазмы для АСО невелика. Кинетика в плазме характеризуется короткой фазой распределения (порядка нескольких часов), а затем наступает фаза выведения препарата с периодом его полувыведения, составляющим дни или недели. Начальная фаза распределения обязательно включает связывание АСО с белками и распределение этих комплексов по тканям печени, почек, лимфатических узлов, костного мозга и селезёнки, которые являются местами наиболее активного связывания и накопления АСО. Совершенно очевидно, что фаза выведения АСО вследствие начального связывания с белками, определяется начальным этапом его распределения. Вследствие возможного насыщения белков, площадь под фармакокинетической кривой (AUC) увеличивается с увеличением дозы, так как АСО уже не связываются с белками после их насыщения, а попадают в свободном виде в кровоток. После связывания АСО попадают в клетки по градиенту концентрации из внеклеточного пространства через клеточную мембрану во внутриклеточное пространство, вероятно, с помощью белка-переносчика. АСО в клетках связываются с доступными мишенями, но главным образом АСО в клетках, вероятнее всего, связываются с внутриклеточными белками. В клетке убиквитарные нуклеазы, но не ферменты цитохрома P450, метаболизируют препараты АСО. Поскольку ферменты цитохрома P450 обычно метаболизируют низкомолекулярные препараты, АСО не конкурируют в метаболических процессах с обычными низкомолекулярными соединениями, снижая риск развития лекарственных взаимодействий. Выведение АСО с мочой в конечном счёте является результатом метаболизма в тканях и установления равновесия метаболитов и нативного вещества вне тканей и в системном кровотоке. Эти процессы у лабораторных животных и человека очень сходны, в силу чего не удаётся выявить межвидовую корреляцию между лабораторными животными и человеком.
В настоящее время конфигурация «второго поколения» АСО, чьей особенностью являются МОЭ группы в положении 2"- нуклеотидов на 3"- и 5"-концах наиболее широко используется в клинических исследованиях. Эта конфигурация представляет собой более совершенную структуру по сравнению с немодифицированными фосфотиоатными ОДН, являющимися антисмысловыми препаратами первого поколения. Это обусловлено её повышенной эффективностью, уменьшенной токсичностью и повышенным периодом полувыведения. Многие факторы, связанные с переходом от первого ко второму поколению АСО, имеют непосредственное отношение к улучшению их фармакокинетики.
Особенности химического строения АСО
Фосфотиоатный скелет
Самые ранние попытки создать препараты с антисмысловой активностью были связаны с использованием немодифицированной ДНК, которая, к сожалению, была очень восприимчива к разрушению нуклеазой. Как оказалось, убиквитарные нуклеазы расщепляют фосфодиэстеразные связи нативной ДНК, в результате чего период полувыведения немодифицированных АСО составлял минуты. Такая быстрая деградация была основной особенностью фармакокинетического профиля немодифицированных антисмысловых ДНК. Изменение фосфодиэфирного скелета ДНК на фосфотиоатный резко изменило фармакокинетический профиль АСО. В этих препаратах фосфотиоатная структура заменяет в фосфодиэфирных связях один атом серы на один немостиковый атом кислорода. Такая структура повышает устойчивость АСО к нуклеазам и, как следствие, улучшает их кинетические свойства.
Фосфотиоатная хиральность
Как показали исследования, тиатион диэфирного скелета АСО не только повышает его устойчивость к нуклеазам, но и способствует возникновению хиральности, то есть возможности существования стереоизомеров, по каждой фосфотиоатной связи, что приводит к тому, что в любой 20-mer АСО существуют 219 Sp или Rp стереоизомеров . Комбинация резистентности к нуклеазам и повышение связывания с белками сильно влияет на фармакокинетику АСО. Повышение стабильности фосфотиоатных АСО приводит к тому, что период полувыведения препарата из плазмы увеличивается до 30-60 минут в сравнении с периодом полувыведения фосфодиэфирных АСО, составляющим 1-2 минуты.
Устойчивость к нуклеазам и хиральность из-за замены фосфодиэфирных на фосфотиоатные связи заслуживают обсуждения, потому что физические свойства связанные с этой структурной особенностью важны как для первого-, так и для второго поколений АСО. Устойчивость к нуклеазам фосфотиоатных АСО возникает из-за близости серы на немостиковом кислороде в активном участке экзонуклеазы к иону металла. Эта близость может вызывать смещение иона металла из активного участка. Данный эффект был продемонстрирован на модели 3"–5" экзонуклеазы ДНК-полимеразы. Рентгеновские кристаллографические данные подтверждают эту гипотезу о смещении иона металла. Очевидные различия в чувствительности стереоизомеров к экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы согласуются с предложенной конформацией фосфотиоатных стереоизомеров ОДН в активном участке. Вполне вероятно, что хиральность фосфоротиоатных связей может помешать другим нуклеазам таким же образом, то есть смещением иона металла, хотя различные экзонуклеазы могут показать различные предпочтения связей Rp и Sp в зависимости от природы активного центра фермента.
В альтернативе, сера может просто занимать место кислорода в диэфирных связях. Различия в способности серы брать на себя отрицательный заряд, по сравнению с кислородом, позволяют прогнозировать изменения активного центра. Это изменение, скорее всего, происходит из-за гидролиза фосфодиэфирных связей, и может осуществляться через формирование переходного пятивалентного фосфора с двумя отрицательно заряженными атомами кислорода. Замена одного из экваториальных атомов кислорода серой будет иметь отрицательные последствия на активность ферментов: (1) снижается связывание воды, которая стабилизирует местный отрицательный заряд на атомах, что приводит к трудностям для получения второго отрицательного заряда серы; и (2) снижение связывания Mg 2+ с серой. Существует доказательство для последнего эффекта в исследованиях уровня расщепления рибозимами диастереомерных фосфотиоатных включений, когда добавление Mg 2+ ингибирует расщепляющие эффекты фосфоротиоатных рибозимов . Кроме того, было показано, что существует некоторое снижение активности нуклеаз на участках скелета, находящихся дальше от фосфотиоатных связей, что даёт возможность предположить передачу эффекта хиральности . Этот феномен лучше всего объясняется изменениями в расположении молекул воды вокруг фосфотиоатного скелета по сравнению с фосфодиэфирным .
Стереоспецифические воздействия на активность нуклеаз заметно влияют на фармакокинетику фосфоротиоатных АСО и это наиболее наглядно проявляется в скорости метаболизма фосфоротиоатных АСО первого поколения в плазме крови. Скорость полного выведения АСО из плазмы уменьшается, предполагая замедление метаболизма. Эти изменения в скорости не могут быть объяснены исходя только из кинетики первого порядка, но их можно объяснить различиями в восприимчивости связей Rp и Sp.
Стереоспецифические различия в экзонуклеазной активности для АСО второго поколения менее важны. Это обусловлено тем, что АСО второго поколения имеют 2"-модификации на 3"- и 5"-концах, которые предотвращают их расщепление экзонуклеазой. С помощью эндонуклеазы, выделенной из возбудителя Serratia marcescens, были изучены эффекты хиральности фосфоротиоатнных связей . Сайт воздействия эндонуклеазы так же, как экзонуклеазы – это один из немостиковых кислородов для гидролиза фосфодиэфирных связей. В диастереомере сера локализуется в непосредственной близости от Mg 2+ , вследствие чего уменьшается активность фермента, в то время как в диастереомере Rp – нет. Поскольку эндонуклеаза Serratia имеет значительные сходства с некоторыми эндонуклеазами млекопитающих, следует предположить, что этот механизм может быть широко применим. Каким образом стереохимические особенности фосфоротиоатных связей влияют на действие других эндонуклеаз – не известно. Однако если предположить, что реакция развивается по схеме, аналогичной эндонуклеазе Serratia, можно думать, что активный участок будет содержать ион металла (вероятно, Mg 2+) и сера будет влиять на действие нуклеаз, когда она будет ориентирована на ион металла. Если эндонуклеазы чувствительны к хиральности, это могло бы иметь важные последствия для развития проблемы создания эффективных препаратов второго поколения. Как и влияние хиральности на препараты первого поколения, так и хиральное воздействие на метаболизм препаратов второго поколения может привести к замедлению их метаболизма. Так, например, можно предположить, что быстро метаболизирующиеся стереоизомеры будут выборочно разрушаться, оставляя функционирующими только медленно метаболизирующиеся изомеры.
Связывание АСО с белками
Было установлено, что в сравнении с АСО с фосфодиэфирным скелетом, на фармакокинетику фосфотиоатных структур оказывает существенное влияние их связывание с белками. Химической основой повышения связывания с белками является повышенная липофильность фосфотиоатных связей по сравнению с фосфодиэфирными. Поскольку молекулярные взаимодействия с водой определяются формой и функцией макромолекул в водном растворе , то даже небольшие изменения в липофильности скелета по всей длине АСО могут иметь последствия для взаимодействия олигомера с водой и макромолекулами, такими как белки.
В первом приближении, фосфотиоатные ОДН связываются с клеточными белками более беспорядочно, чем фосфодиэфирные ОДН . Почему фосфотиоатные АСО лучше связываются с белками до конца не выяснено. Возможные объяснения предполагают повышение липофильности и комплексообразование с ионами металлов.
Важность связывания с белками плазмы для фармакологии, фармакокинетики и токсикологии фосфотиоатных АСО (как первого, так и второго поколений) сложно переоценить. На микромолярном уровне концентраций более чем 90% фосфотиоатных ОДН связываются в плазме. Есть особые отличия в проценте и силе связывания с белками, так же как качественные отличия в связывании АСО с особыми белками у разных видов. Связывание фосфотиоатных АСО с циркулирующими белками удерживает эти соединения от фильтрации в почечных клубочках и выведения с мочой. В случае насыщения, например при введении большой дозы АСО, выведение с мочой АСО полной длины усиливается. Вследствие видовых различий, насыщение у различных видов определяется разными концентрациями АСО. Например, белки плазмы мышей имеют меньшее сродство к АСО, по сравнению с таковыми крыс или человека. Поэтому эффект насыщения процесса связывания АСО с белками плазмы у мышей происходит при более низких концентрациях, по сравнению с другими видами. Видовые различия в связывании плазмы с белками являются существенным фактором отличия в межвидовой фармакокинетике.
Устойчивость к нуклеазам и связывание с белками, которые характерны для АСО с фосфотиоатными связями, изменяют и фармакокинетику терапии с применением АСО. Дополнительные химические структуры, характерные для второго поколения создаваемых препаратов, вносят и другие изменения в их фармакокинетику.
Метоксиэтильные производные АСО
АСО второго поколения были разработаны для улучшения некоторых характеристик ОДН первого поколения. Так фосфотиоатные структуры, добавленные к группам МОЭ в позиции 2", повышают их устойчивость к нуклеазам и изменяют эффективность связывания с белками.
Устойчивость МОЭ к нуклеазам
Было показано, что структура МОЭ влияет на устойчивость АСО к нуклеазам. В то время как фосфотиоатные структуры уменьшают активность экзонуклеазы, структура в позиции 2" практически исключает экзонуклеазную активность. Устойчивость к нуклеазам может быть результатом (1) замещения в позиции 2" водорода на МОЭ, (2) стерических эффектов МОЭ или (3) образования жёсткой водной оболочки вокруг скелета АСО . Какими бы не были причины устойчивости к нуклеазам, наличие группы МОЭ делает измененные в позиции 2" АСО практически невосприимчивыми к воздействию циркулирующих и к большинству клеточных нуклеаз. Центральный участок скелета АСО, состоящий из деоксифосфотиоатов, далеко не так устойчив к опосредованным нуклеазой расщеплениям. Различия АСО первого и второго поколений в участках, подверженных метаболизму, определяют и различия метаболических моделей.
При оценке моделей метаболизма с помощью капиллярного гель-электрофореза (КГЭ) или путём жидкостной хроматографии/масс спектрометрии (ЖХ/МС), не было обнаружено метаболитов, которые были бы короче на один нуклеотид. Больше всего было обнаружено метаболитов, расщеплённых в дезокси участке (предположительно эндонуклеазами), дальнейший путь метаболизма заключается в уменьшении размеров продуктов расщепления. Устойчивость к экзонуклеазам и медленный метаболизм под влиянием действующих эндонуклеаз приводит к образованию соединений, характеризующихся большим периодом полувыведения.
Связывание МОЭ с белками
Экспериментальными исследованиями доказано, что фосфотиоатные АСО со структурами 2"-МОЭ имеют меньшее сродство к белкам плазмы, в сравнении с немодифицированными фосфотиоатными АСО. Например, при добавлении пяти структур МОЭ к 3"-концам фосфотиоатных ОДН первого поколения, константы диссоциации для альбуминов повышаются от примерно 18 до примерно 40 мкM. При этом, в полностью замещённой МОЭ структуре АСО только слегка снижается сродство к белкам плазмы . Почему увеличение количества структур МОЭ в олигонуклеотиде не влияет на дальнейшее уменьшение сродства к белкам плазмы не ясно, но может быть это связано с особенностями вторичной структуры АСО.
Уменьшение сродства к белкам, связанное со структурами МОЭ, можно обосновать некоторыми физическими свойствами. Вероятно наиболее значительным физическим фактором, который отличает модифицированные МОЭ АСО от немодифицированных – это наличие молекулярной оболочки воды, которая возникает из-за боковой цепи МОЭ . Заместители МОЭ в углеводородном скелете «хелатируют» молекулы воды (и, возможно, ионы металлов), образуя водную оболочку, и уменьшая потенциальный контакт между «липкими» молекулами серы и плазменными или клеточными белками. Степень связывания АСО с белками обратно коррелирует с их выведением с мочой. Введение фосфотиоатных связей и заместителей 2"-МОЭ изменяет связывание с белками и в результате изменяет свойства АСО.
Всасывание, распределение, метаболизм и выведение АСО
Всасывание
Парентеральный путь введения АСО
Исследованиями установлено, что вследствие молекулярной массы (около 7000 Д) и отрицательных зарядов АСО, всасывание этих препаратов из ЖКТ ограничено. Именно поэтому, обычно применяется парентеральный путь их введения. Подкожные, внутривенные инфузии или интравитриальные инъекции используется для введения препаратов первого поколения. Меньшая провоспалительная активность АСО второго поколения делает их более подходящими для подкожного введения. Фармакокинетика этих препаратов в плазме при подкожных инъекциях и внутривенных инфузиях сравнима. Исследования на лабораторных животных показывают, что, в конечном счёте, распределение АСО так же сопоставимо по различным органам, за исключением места введения и лимфатических узлов.
После подкожного введения, АСО как первого, так и второго поколения всасываются быстро из места введения в системный кровоток. В клинических исследованиях после подкожного введения АСО второго поколения время достижения максимальной концентрации (T max), находится в пределах от 1,5 до 4,7 часа в диапазоне доз от 25 до 200 мг при постоянном объёме 1 мл . Биодоступность подкожной дозы лежит в пределах от 36 до 82% от введенной дозы. Доклинические и клинические исследования предполагают, что биодоступность АСО повышается в зависимости от концентрации.
Кинетика АСО в месте введения может повлиять на местный ответ, также как на их системную кинетику и на распределение. Уменьшение концентрации АСО в месте введения гипотетически уменьшает местный ответ на инъекцию. Одним из подходов к снижению концентрации АСО в месте введения является разведение раствора и, как следствие, повышение площади поверхности всасывания из подкожного депо. Теоретически, разведение растворов и большая площадь поверхности всасывания должны уменьшить местную концентрацию и снизить местные реакции. Этих же эффектов можно было бы ожидать и при повышении системного всасывания. Поэтому изменения дозы и объёма можно рассматривать как потенциальные переменные величины. Однако даже на сегодняшний день подкожные инъекции с низкими объёмами и относительно высокими концентрациями демонстрируют высокую биодоступность применяемого материала.
Местное введение АСО
Изучение различных приёмов введения АСО демонстрирует, что их аэрозольные формы, ректальное введение и интравитриальные инъекции используются как средства местного введения. Для лечения лёгочных заболеваний возможно создавать относительно высокие концентрации АСО в лёгких используя аэрозоли .
Кинетика ОДН первого поколения была изучена на мышах. Установлено, что кинетика таких препаратов дозозависима, клиренс – лёгочный с периодом полувыведения около 2 часов. В отличие от этого, исследования модифицированных МОЭ АСО второго поколения, показывают, что период их полувыведения составляет более 4 дней. Так же как и для другого местного лечения, преимущество ингаляций заключается в возможности создать высокие местные концентрации в тканях, которые обычно не накапливают применяемых веществ. В лёгких АСО обычно не накапливаются после парентерального введения. Местное введение так же редко вызывает системные эффекты. Например, при введении АСО обезьянам в дозе 0,1 мг/кг с помощью ингаляций (по три дозы в течение 1 недели) концентрация препарата в лёгких составляла примерно 1 мкг/г. Но у этих же обезьян, концентрация в печени и почках составила примерно 5% от концентрации в лёгких, свидетельствуя о существенно меньшем системном эффекте .
Данные литературы свидетельствуют о том, что ректальное введение АСО с успехом используется для лечения язвенных колитов. В отличие от ингаляций, где могут использоваться небольшие количества вводимого вещества, применяемая для лечения клизма может содержать до 240 мг вещества (alicaforsen) первого поколения. В данном случае эпителий прямой кишки подвергается воздействию вводимого вещества, однако из-за плохой проницаемости сильно заряженных ОДН, наблюдается минимальное всасывание препарата, как и общий системный эффект. Расчёты показывают, что концентрация АСО в эпителии кишечника через 12 часов после введения составляет 20 мкг/г. Биодоступность у человека лежит в пределах от 0,03 до 2,14% и максимальная концентрация АСО, определяемая в плазме, составляет только 0,126 мкг/мл . Отсутствие значительного системного всасывания и высокая местная концентрация лечебного препарата положительно сказываются на лечении.
Проведено исследование интравитреальных инъекций препаратов АСО как первого, так и второго поколений. В данном случае вещества вводятся в глаз в очень маленьких количествах. Вследствие изоляции места введения, системные эффекты препарата снижаются в ещё большей степени. В глазу, в стекловидное тело и сетчатку АСО поступают с разной скоростью: в стекловидное тело быстрее по сравнению с сетчаткой. И местный метаболизм, и диффузия из глаза способствуют выведению препарата. Как уже отмечалось, из-за небольших количеств системный эффект вводимого препарата оказывается минимальным. Однако, при этом механизм системного распределения сходен с большинством других препаратов.
Энтеральное введение АСО
Отмеченная стабильность АСО второго поколения к нуклеазам обеспечивает стабильность препарата в кишечнике, что делает возможным его дальнейшее всасывание. Тем не менее, размер молекулы и заряды АСО ограничивают всасывание препарата. После всасывания из кишечника, кинетика АСО подобна таковой при его парентеральном введении. Хотя печень является одним из главных мест накопления АСО, эффект первого прохождения через печень не является важным фактором, влияющим на кинетику препарата АСО .
Распределение АСО в организме
Роль перфузионного и тканевого сродства
Распределение АСО и других препаратов зависит от проницаемости, интенсивности кровоснабжения, связывания с белками плазмы, тканей и клеток. Показано, что распределение в тканях фосфотиоатных АСО первого и второго поколения с их множественными отрицательными зарядами и их связыванием с белками в наименьшей степени зависит от кровоснабжения, и гораздо более зависит от факторов, влияющих на их транспорт внутрь клетки.
Внутреннее распределение из плазмы в ткани относительно быстрое, период полувыведения составляет 30-90 минут после в/в введения. Период полувыведения АСО после подкожного введения больше, чем после в/в. Это отличие происходит из-за времени, необходимого для всасывания, а не из-за других отличий фармакокинетики .
Изучение кинетики препаратов первого и второго поколения отметило её небольшие отличия. Большая стабильность к нуклеазам АСО второго поколения компенсируется меньшим их связыванием с белками. Наряду с этим, фармакокинетические профили препаратов 1-го и 2-го поколения сходны или почти неотличимы, если сумму нативного АСО и его метаболитов (общие АСО) первого поколения сравнивать с интактным препаратом второго поколения (ISIS 13650). В противном случае, более быстрое разрушение АСО экзонуклеазами укорачивало бы период полувыведения препаратов первого поколения в сравнении со вторыми. Распределение препаратов обоих поколений дозозависимо .
Как отмечалось выше, после всасывания из места инъекции или кишечника АСО связываются с белками плазмы. Два белка плазмы, которые точно связываются с фосфотиоатными АСО – это альбумин и альфа-2-макроглобулин. Другой распространённый белок, кислый гликопротеин не связывает АСО . Связывание с белками очень важно для распределения АСО в ткани-мишени. Химические структуры, уменьшающие связывание приводят к заметному снижению концентрации препарата в тканях, повышают степень его фильтрации через почечные клубочки и выведения с мочой. Это явление можно наблюдать при использовании АСО с диэфирными связями в скелете препарата или при наличии структуры МОЭ. Уменьшение сродства диэфиров и МОЭ-структур (или и то, и то) к белкам позволяет более свободно циркулировать АСО в кровотоке, приводя к интенсификации его выведения с мочой .
Во всех исследованиях с парентерально введенными АСО первого и второго поколения, мы не наблюдали линейного клиренса АСО из плазмы. Клиренс уменьшался с увеличением дозы препарата, и, следовательно, его биодоступность была большей, чем можно было предположить исходя из введённой дозы . Поскольку начальный клиренс обусловлен распределением АСО в тканях и при этом наблюдалось поглощение препарата тканями, можно предположить возможность их насыщения АСО. Изучение процесса насыщения в результате введений АСО может проводиться с использованием фагоцитов печени. Когда связывание АСО с клетками Купфера достигнет насыщения, начнётся уменьшение сродства. Последующее введение АСО мышам улучшает распределение АСО по не фагоцитарным клеткам печени, и в результате улучшается фармакологическая активность в гепатоцитах в сравнении с контролем. И, наоборот, при концентрации в плазме ниже 1 мкг/мл АСО активнее связываются с клетками Купфера, и меньше накапливаются в гепатоцитах.
Исследование процесса связывания АСО с белками плазмы показало, что этот эффект сопровождается быстрым распределением комплекса в тканях по поверхности клеток. Хотя точные механизмы клеточного связывания не установлены, можно предположить, что АСО связываются с белками плазмы или с клеточными белками, пока есть свободные участки связывания. Затем связанные АСО распределяются по градиенту концентрации через клеточную мембрану путём обмена внеклеточного белка на внутриклеточный.
Таким образом, движущей силой попадания АСО в клетки является градиент концентраций. Было описано челночное движение АСО между цитоплазмой и ядром . В целом, является очевидным, что связывание с белками облегчает движение АСО через барьеры, которые обычно тормозят движение гидрофильных сильно заряженных молекул. Данный челночный механизм движения через мембраны остаётся гипотезой для АСО, но ранее он был описан для металлоорганических соединений . Транспорт АСО из внеклеточного матрикса во внутриклеточное пространство был визуализирован на печени мышей при помощи иммуногистохимических методов и на почках крыс с помощью витальной микроскопии с флуоресцентной меткой для АСО второго поколения (S. Henry, B. Molitoris).
Идентичность белков, контролирующих транспорт АСО из внеклеточного во внутриклеточное пространство не известна, однако считается, что связывание комплекса белок-АСО с клеткой осуществляется при помощи фагоцитарного рецептора . Поскольку высоким сродством к АСО обладают фагоциты, такие как клетки Купфера, тканевые макрофаги и клетки проксимальных канальцев, можно думать о возможности нахождения таких рецепторов на их клеточной поверхности .
Тем не менее, клеточное распределение и фармакодинамика АСО у трансгенных мышей, лишённых фагоцитарного рецептора SR-A I/II не отличались от таковых показателей контрольных сингенных животных . Таким образом, этот рецептор, известный как «рецептор для уборки мусора» (Scavenger receptor), по-видимому, не ответственен за поглощение комплекса печенью и почками. Роль других акцепторных структур, участвующих в процессах эндоцитоза комплекса АСО-белок, не изучена.
Мембранные белки, функционирующие как переносчики, присутствуют во всех организмах . Основными переносчиками лекарственных средств являются: ABC (ATP-binding cassette transporters) и SLC (solute carrier family). Известно, что скорость переноса веществ через биологические мембраны с помощью процессов, опосредованных транспортёрами, характеризуется насыщаемостью. Описано несколько членов семейства SLC с известными функциями, в основном для переноса нуклеозидов, нуклеозид-сахаров и фосфат-сахаров. Есть мнение, что будущие исследования, скорее всего, будут касаться процессов межмембранного транспорта АСО.
Ясно, что помимо указанных выше отличий в накоплении создаваемых конструкций разными органами и тканями и зависимости клиренса и распределения таких соединений от их дозы, на распределение АСО в тканях оказывают влияние транспортные системы, особенности кровотока особей, возможное время нахождения препарата в организме и, наконец, насыщаемость тканей АСО. Несмотря на существенную роль указанных факторов в процессах тканевого распределения АСО, считается, что начальное связывание АСО с поверхностью клетки является одним из определяющих факторов в анализируемых механизмах. Такое заключение основывается на том, что печень и почки являются начальными участками связывания АСО с некоторым дополнительным накоплением в первые 24 часа после введения АСО . При изучении параметров распределения АСО в печени и почках показано фракционное повышение концентрации препарата в органах в течение первых 24 часов. Это происходит в период клеточного и субклеточного перераспределения АСО , но предположительно, первичные органы распределения должны накапливать больше вещества с течением времени из-за большего сродства этих органов к АСО. Белки, ответственные за это сродство могут содержать гепариноподобные участки связывания ламинина и фибриногена, и фактор роста фибробластов (FGF, Fibroblast growth factor) . Раннее взаимодействие АСО с клеткой может быть обусловлено связыванием этих белков, но природа этих белков, как отмечалось выше, изучена мало.
Рассматривая значимость сочетания специфических участков связывания АСО с клетками в распределении препарата в организме, следует отметить и такой важный фактор, как различное кровоснабжение разных органов, возможность которого влиять на различное распределение фосфотиоатных АСО очевидна. По данным разных авторов, работа с десятками серий веществ как первого, так и второго поколений свидетельствует об их сходном распределении, и заметно подобном распределении у особей различных видов. Почки, печень, лимфатические узлы, селезёнка и костный мозг – это органы, накапливающие самое большое количество АСО и их метаболитов. То, что лёгкие и сердце не накапливают АСО, свидетельствует о том, что для объяснения выраженного накопления АСО в печени и почках недостаточно только одного объяснения об их хорошем кровоснабжении. Например, участки с наилучшим кровообращением в почках – это клубочки, а они не являются участками, содержащими большее количество АСО. Напротив, в проксимальных канальцах кровообращение менее активно. Однако клетки проксимальных канальцев характеризуются большим количеством активно фагоцитирующих клеток, накапливают свободные АСО, а так же АСО, связанные с белками, которые обычно реабсорбируются в проксимальных канальцах . В результате почечная кора и эпителий проксимальных канальцев содержат самую высокую концентрацию фосфотиоатных АСО, как первого, так и второго поколения.
Следует отметить также, что кровоснабжение (мл/г ткани) печени составляет примерно 20% от почечного. 4-5-кратные различия в перфузии между почками и печенью не приводят к 4-5-кратным различиям в концентрации АСО в этих органах. Окончатые капилляры увеличивают площадь соприкосновения АСО с кровотоком и, следовательно, это может компенсировать недостаточную перфузию печени относительно почек.
Связывание АСО с белками плазмы при распределении
Хотя насыщение клеток АСО в конечном счёте влияет на их распределение в органах, связывание АСО с белками плазмы может изменять распределение в почках и печени в различных сериях. Существуют посерийные различия в связывании с белками. При снижении связывания АСО с белками плазмы происходит уменьшение их накопления в печени и повышение их накопления в почках. И, наоборот, при более высоком связывании, концентрация АСО в свободном виде в кровотоке будет находиться в меньшем количестве, меньше накапливаться в почках и больше в других органах. Существует обратная зависимость между степенью связывания АСО с белком и накоплением их в почках крыс и обезьян после повторяющегося внутривенного и подкожного введения.
Связывание с белками может быть использовано как критерий выбора АСО для клинических исследований. К настоящему времени, определение связывания с белками – это эмпирический процесс без возможности предсказать, какая серия будет связываться с белками больше или меньше.
Распределение АСО по другим органам
Независимо от последовательности распределения фосфотиоатных АСО первого и второго поколения, наблюдается характерная картина локализации этих препаратов в почках и печени, а также в селезёнке и лимфатических узлах, кости и в цитоплазме адипоцитов . Накопление АСО в лимфоидной ткани можно объяснить отчасти фагоцитарной активностью гистиоцитов и других мононуклеарных клеток. Возможно, визуализировать АСО в фаголизосомах гистиоцитов и тканях макрофагов при помощи гематоксилинового окрашивания. Показано, что АСО подвергаются эндоцитозу, локализуются в эндосомах и сохраняются в пределах этих структур. Концентрация АСО в фаголизосомах часто такова, что её возможно определить методом окрашивания гематоксилином (почти как ядерную ДНК). АСО в фаголизосомах вероятно составляет большую часть АСО, накопленных в селезёнке и лимфоидных органах. Кроме того, фагоцитарно активные клетки костей и костного мозга накапливают АСО в этих тканях, что подтверждается наличием базофильных гранул в их клетках.
Мышцы (как скелетные, так и сердечные) не содержат значительного количества АСО. Тем не менее, внимательное изучение мышц с использованием иммуногистохимических или авторадиографических методов показывает содержание АСО в фаголизосомах макрофагов стромы мышц и это накопление может частично отразиться и на измерении концентрации АСО в мышцах и сердце.
Накопление АСО в цитоплазме адипоцитов значимо с терапевтической точки зрения. Особенно потому, что в отличие от большинства накапливаемых в адипоцитах веществ, АСО гидрофильны. Иммуногистохимические методы ясно показывают, что АСО находятся в цитоплазматической фракции адипоцитов, при этом АСО почти нет в жировой вакуоли. Интенсивность окрашивания указывает на значительное накопление вещества в цитоплазме. Например, у обезьян после 13 недель лечения препаратом ISIS 113715 в дозе 10 мг/кг/неделя концентрация в печени составила 301 ± 88,1 мкг/г, но только 37,3 ± 14,4 мкг/г в жировой ткани у тех же животных.
Учитывая, что нежировой компонент составляет 10% от общей жировой массы, коррекция концентрации АСО с учётом этого показателя свидетельствует о сопоставимости его концентрации с таковой в печени. Значительные концентрации АСО в адипоцитах показывают, что их можно использовать для лечения генетических заболеваний клеток этого типа: источников гормонов и цитокинов. Так, установлено, что фармакологически активные концентрации АСО регистрируются в адипоцитах мышей при введении препарата ISIS 113715 в дозе 25 мг/кг дважды в неделю и снижают экспрессию гена-мишени PTP-1B как в печени, так и в адипоцитах . Аналогичные наблюдения были сделаны у обезьян, получавших АСО ISIS 113715. Поскольку биопсию подкожного жира можно провести в клинических условиях и так как активные АСО накапливаются в жире, то можно использовать жир для биопсии и непосредственного измерения фармакологических эффектов (снижение мРНК) и тканевой концентрации препарата в тканях человека.
Фосфотиоатные АСО распределяются и в другие ткани. Иммуногистохимические исследования показывают, что эндотелиальные клетки накапливают АСО в концентрациях, значительных для уменьшения уровня мРНК, делая их потенциальной мишенью для фармакологического воздействия . В некоторых тканях их концентрации не достаточно велики для фармакологического эффекта. Например, зрелые лимфоциты не накапливают АСО, а антисмысловая активность проявляется T-клетками ограниченно.
Костные клетки, особенно фагоцитарно активные остеобласты, могут накапливать АСО и этот эффект может быть использован в терапевтических целях. Кроме того, клетки островков поджелудочной железы также накапливают АСО. АСО как первого, так и второго поколения являются сильно заряженными гидрофильными молекулами, которые не проникают через гемато-энцефалический или гемато-тестикулярный барьеры. Однако, как и в мышцах, в интерстициальном участке яичек локализуются макрофаги, содержащие обнаруживаемые АСО. Яичники не отделены барьером, вследствие этого АСО можно количественно измерить в яичниках и визуализировать иммуногистохимическими методами в строме.
Ограниченное распределение АСО из плазмы крови в клетки мозга и кардиомиоциты делает эти ткани маловероятными мишенями антисмыслового вмешательства, несмотря на то, что селективное ингибирование или экспрессия некоторых белков ионных каналов в головном мозге и мышцах могут быть терапевтически полезны. Тем не менее, ограниченное распределение АСО в этих тканях можно рассматривать как преимущество. Отсутствие значительных концентраций АСО в мозге и сердце уменьшает риск поражения центральной нервной системы (ЦНС) и снижает проявление нежелательных сердечных эффектов. Как отмечалось ранее, прямое введение в структуры ЦНС, в частности, в головной мозг, с помощью интратекальной, внутрижелудочковой инфузии или инъекции вызывает распределение АСО в пределах центральной нервной системы и может быть полезно терапевтически .
При беременности плод достаточно хорошо защищен от воздействия антисмысловых препаратов. Изучение трансплацентарной кинетики АСО не выявило его накопления в плоде, отмечен низкий уровень АСО у грызунов в плаценте . Эти результаты были последовательно воспроизведены при исследовании тератогенности различных АСО второго поколения на мышах, крысах и кроликах. Плацента, несмотря на высокую перфузию, не является органом с высоким накоплением АСО .
В целом, представленные факты показывают, что распределение АСО является одним из ключевых факторов, который определяет выраженность активности АСО. Отличия в распределении АСО, как представляется, связаны в значительной степени с тропностью тканей для этих препаратов и, в меньшей степени, с перфузией.
Метаболизм
Антисмысловые препараты первого и второго поколения метаболизируются нуклеазами, а не системами оксидаз типа цитохрома P450, с помощью которого метаболизируются обычные липофильные низкомолекулярные препараты. АСО не являются ни субстратом изоферментов цитохрома P450, и не индуцируют или ингибируют его активность в клинически значимых концентрациях. Опосредованное экзонуклеазами расщепление АСО, которое является основным путём метаболизма и клиренса фосфотиоатных ОДН первого поколения, вторично для АСО второго поколения. Ограничивают экзонуклеазную активность два фрагмента: один МОЭ на 3"-конце и другой МОЭ на 5"-конце.
Ферменты, ответственные за метаболизм АСО
Специфические ферменты, метаболизирующие АСО второго поколения не известны. Нуклеазы являются повсеместно распределёнными и есть возможность определить расщеплённые метаболиты АСО в большинстве тканей. Печеночный и почечный гомогенаты – оба способны метаболизировать АСО второго поколения in vitro без добавления экзогенных источников энергии, таких как никотинамидадениндинуклеотидфосфат (NADPH) или аденозин-5-трифосфат (АТФ). Начальное расщепление приводит к образованию двух продуктов, каждый из которых характеризуется защищённым MOE концом 5" и 3". Эти метаболиты не связываются с белками, и, таким образом, выводятся из тканей. Поскольку метаболиты удаляются быстрее, чем они образуются, накопление метаболитов в тканях практически не происходит. Таким образом, не представляется возможным использовать определение количества метаболитов в ткани, как индекса метаболизма АСО в тканях.
Поскольку скорость выведения АСО из тканей зависит от их метаболизма, то различия в метаболизме АСО в различных тканях могут быть оценены на основе периода полувыведения этих препаратов из характеризуемых тканей. На основе данных для четырёх АСО второго поколения, заключено, что поведение членов этого класса сходно, однако прослеживаются небольшие различия в периоде их полувыведения из печени и почек обезьян, получавших препарат в течение 4-13 недель. Показано, что период полувыведения препаратов АСО ISIS 104838 и 112989 из печени и почек весьма сходен. Эти данные дают возможность предположить, что для некоторых серий АСО не существует значительных различий в скорости метаболизма в различных органах. Однако различия в тканевом периоде полувыведения выявлены для препаратов ISIS 107248, 113715, а также 301012. Обнаруженные различия в скорости метаболизма препаратов АСО в печени и почках показывают, что в разных тканях могут быть различия в скорости метаболизма, или имеет место более сложная кинетика для некоторых серий препарата, или полученные результаты просто отражают небольшое количество образцов, взятых в течение ограниченного времени.
Детальное исследование процесса выведения АСО второго поколения показывает наличие разных темпов их выведения из различных типов клеток печени . Поскольку некоторые типы клеток, такие как клетки проксимальных канальцев коркового слоя почки, как правило, содержат АСО в фаголизосомах, этот тип поглощения, вероятно, определяет различия в метаболических скоростях препарата в разных тканях. Кроме того, вполне вероятно, что специфические последовательности в строении скелета АСО могут характеризоваться различной чувствительностью к расщеплению эндонуклеазами.
Бактериальные экзонуклеазы проявляют высокую степень специфичности к последовательности нуклеотидов в скелете АСО предположительно для защиты от вирусов. Большая часть активности нуклеаз в клетках млекопитающих связана с механизмами транскрипции и репарации ДНК, и, таким образом, видовая специфичность млекопитающих может отличаться от таковых бактериальных эндонуклеаз. Не известно, одинаково ли ответственны за катаболизм этих синтетических АСО процессы репликации и действие ферментов, связанных с явлением репарации. При высоких концентрациях оцДНК , АСО могут эффективно конкурировать с природным субстратом. Множество ферментов семейства нуклеаз способны катаболизировать АСО. Определение специфических ферментов, участвующих в метаболизме АСО не критично для развития антисмысловых препаратов, но, более глубокое понимание метаболических путей будет полезно для развития новых технологий.
Метаболиты АСО
Различия в метаболизме АСО первого и второго поколений весьма очевидны при сравнении метаболического профиля с КГЭ. Когда образцы ткани или мочи анализируются в детекторе LC/MS, характер метаболических процессов становится более ясным . Как правило, фосфоротиоатные ОДН первого поколения метаболизируются в каскад метаболитов АСО, каждый из которых отличается на один нуклеотид в результате однонуклеотидных расщеплений экзонуклеазой. Так, после введения 20-mer, то есть состоящего из 20 нуклеотидов, ОДН первого поколения плазма и ткани содержат семейства последовательно сокращенных АСО, начиная с 19-mer и далее вплоть до короткого АСО.
Исходное расщепление в метаболизме АСО второго поколения, опосредованное
эндонуклеазами, приводит к образованию двух АСО, один с 3"-концом MOЭ и другой с 5"-концом MOЭ. Расщепление продуктов с незащищёнными концами, может проводиться либо 5"-экзонуклеазой или 3"-экзонуклеазой. Результаты комбинированной эндо- и экзонуклеазной активности – это каскад цепочечно сокращённых продуктов расщепления, многие, если не все, из которых могут быть выявлены в моче, собранной у обследуемых животных или людей. Моча животных, принимавших препарат, или пациентов, лечившихся АСО второго поколения, может содержать метаболиты, которые варьируются от двух возможных 15-mer до двух возможных MOЭ 5-mer и множественных комбинаций каждого из промежуточных метаболитов .
Метаболиты короче, чем длина концов MOЭ будут присутствовать в тканях, если концы MOЭ сами являются субстратами для нуклеаз. Эти метаболиты обычно не определяются при масс-спектральном анализе, что наводит на мысль, что как правило, нет мононуклеотидов MOЭ, выделяющихся в процессе метаболизма. Тем не менее, некоторые исключения из этого обобщения имеют место. Для ограниченного числа последовательностей нуклеотидов, наблюдаются однонуклеотидные обрезки АСО второго поколения в тканях и плазме – либо КГЭ или LC/MS: метаболиты, по-видимому, были результатом экзонуклеазного расщепления. Эти метаболиты могут наблюдаться в начальном распределении. Предполагается, что они быстро появляются в плазме крови. MOЭ-мононуклеотиды, которые образуются в процессе метаболизма, не являются субстратами для фосфорилирования, и таким образом, вряд ли будут включены в нуклеотидтрифосфаты и, в конечном счёте, в эндогенные нуклеотиды. MOЭ-мононуклеотиды не ингибируют ферменты, ответственные за синтез ДНК. Таким образом, MOЭ-мононуклеотиды, если они образовались, не должны встраиваться в эндогенные нуклеотиды.
Центральная часть дезоксинуклеотидов АСО второго поколения подлежит экзонуклеазному расщеплению, что приводит к высвобождению одного нуклеотида. Монодезоксинуклеотиды, которые получаются путём экзонуклеазного расщепления, идентичны эндогенным нуклеотидам, за исключением тиофосфатной группы, которая может теоретически присутствовать. Тем не менее, тиофосфатная группа лабильна к окислению и к утрате серы, что делает группу концевого фосфата идентичной эндогенным нуклеотидам. Поэтому, в отличие от MOЭ-мононуклеотидов, любой высвобождённый дезоксинуклеотид будет естественно включён во внутриклеточное депо эндогенных нуклеотидов. Нуклеотиды, которые сохраняют тиофосфатные группы, будут субстратами для добавления одной или двух фосфатных групп, в результате чего получаются смешанные тиофосфатные ди- или трифосфаты нуклеотида. Фосфорилирование возможно, но присутствие альфа тиофосфата делает реакции термодинамически неблагоприятными .
Заключение
Очевидна актуальность исследования фармакокинетики данных и схожих с описанными препаратов, а так же создание моделей на различных видов животных для полного понимания процессов протекающих в организме после приема препаратов. В России так же ведутся исследования подобных препаратов.
Литература
1. Adjei A.A., Dy G.K., Erlichman C. et al. A phase I trial of ISIS 2503, an antisense inhibitor of H-ras, in combination with gemcitabine in patients with advanced cancer. // Clin. Cancer Res. 2003. Vol. 9, №1. P. 115.
2. Benimetskaya L., Loike J.D., Loike G. et al. Mac-1 (CD11b/CD18) is an ODN-binding protein. // Nat. Med. 1997. Vol. 3, №4. P. 414.
3. Benimetskaya L., Tonkinson J.L., Koziolkiewicz M. et al. Binding of phosphorothioate ODNs to basic fibroblast growth factor, recombinant soluble CD4, laminin and fibronectin in P-chirality independent. // Nucl. Acids Res. 1995. Vol. 23, №21. P. 4239.
4. Bijsterbosch M.K., Manoharan M., Rump E.T. et al. In vitro fate of phosphorothioate antisense ODNs: predominant uptake by scavenger receptors on endothelial cells. // Nucl. Acids Res. 1997. Vol. 25, №16. P. 3290.
5. Bijsterbosch M.K., Rump E.T., De Vrueh R.L. et al. Modulation of plasma protein binding and in vitro liver cell uptake of phosphorothioate ODNs by cholesterol conjugation. // Nucl. Acids Res. 2000. Vol. 28, № 14. P. 2717.
6. Brown D.A., Kang S.H., Gryaznov S.M. et al. Effect of phosphorothioate modification of ODNs on specific protein binding. // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269, №43. Р. 26801.
7. Butler M., Crooke R.M., Graham M.J. et al. Phosphorothioate ODNs distribute similarly in class A scavenger receptor knockout and wild-type mice. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2000. Vol. 292, №2. P. 489.
8. Butler M., Hayes C.S., Chappell A., Murray S.F., Yaksh T.L., Hua X.Y. Spinal distribution and metabolism of 2_-O-(2-methoxyethyl)-modified ASOs after intrathecal administration in rats. // Neuroscience. 2005. Vol. 131, №3. P. 705.
9. Butler M., Stecker K., Bennett C.F. Cellular distribution of phosphorothioate ODNs in normal rodent tissues. // Lab. Invest. 1997. Vol. 77, №4. P. 379.
10. Cossum P.A., Sasmor H., Dellinger D. et al. Disposition of the 14C-labeled phosphorothioate ASO ISIS 2105 after intravenous administration to rats. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1993. Vol. 267, №3. P. 1181.
11. Cossum P.A., Troung L., Owens S.R. et al. Pharmacokinetics of a 14C-labeled phosphorothioate ASO, ISIS 2105, after intradermal administration to rats. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1994. Vol. 269, №1. P. 89.
12. Crooke S.T., Graham M.J., Zuckerman J.E. et al. Pharmacokinetic properties of several novel ASO analogs in mice. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1996. Vol. 277, №2. P. 923.
13. Driver S.E., Robinson G.S., Flanagan J., Shen W., Smith L.E.H., Thomas D.W., Roberts P.C. ASO-based inhibition of embryonic gene expression. // Nat. Biotechnol. 1999. Vol. 17. P. 1184.
14. Eckstein F. Phosphorothioate ODNs: what is their origin and what is unique about them? //Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 2000. Vol. 10, №2. Р. 117.
15. Gaus H.J., Owens S.R., Winniman M., Cooper S., Cummins L.L. On-line HPLC electrospray mass spectrometry of phosphorothioate ASO metabolites. // Anal. Chem. 1997. Vol. 69, №3. P. 313.
16. Geary R.S. Current assessment of PK/PD relationships for antisense therapeutics. // World Congress of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Nice, France, 2002.
17. Geary R.S., Bradley J.D., Watanabe T. et al. Lack of pharmacokinetic interaction for ISIS 113715, a 2_-O-methoxyethyl modified antisense oligonucleotide targeting protein tyrosine phosphatase 1B messenger RNA, with oral antidiabetic compounds metformin, glipizide or rosiglitazone. // Clin. Pharmacokinet. 2006. Vol. 45, №8. P. 789.
18. Geary R.S., Leeds J.M., Fitchett J. et al. Pharmacokinetics and metabolism in mice of a phosphorothioate ASO antisense inhibitor of C-raf-1 kinase expression.// Drug Metab. Dispos. 1997. Vol. 25, №11. Р. 1272.
19. Geary R.S., Leeds J.M., Henry S.P., Monteith D.K., Levin A.A. Antisense oligonucleotide inhibitors for the treatment of cancer: 1. Pharmacokinetic properties of phosphorothioate ODNs. // Anticancer Drug Des. 1997. Vol. 12, №5. Р. 383.
20. Geary R.S., Leeds J.M., Shanahan W. et al. Sequence independent plasma and tissue pharmacokinetics for 3 antisense phosphorothioate ASOs: mouse to man. // in American Association of Pharmaceutical Scientists, Pharm. Research, Plenum Press, Seattle, Washington. 1996. Р. S.
21. Geary R.S., Teng C.L., Truong L. et al. First pass hepatic extraction of a partially modified chimeric antisense oligonucleotides in Beagle dogs. // in Annual Meeting of the American Association of Pharmaceutical Scientists, Indianapolis, IN, 2000. P. 216.
22. Geary R.S., Ushiro-Watanabe T., Truong L et al. Pharmacokinetic properties of 2_-O-(2-methoxyethyl)-modified ASO analogs in rats. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001. Vol. 296, №3. Р. 890.
23. Geary R.S., Yu R.Z., Levin A.A. Pharmacokinetics of phosphorothioate antisense ODNs. // Curr. Opin. Invest. Drugs. 2001. Vol. 2, №4. Р. 562.
24. Geary R.S., Yu R.Z., Watanabe T. et al. Pharmacokinetics of a tumor necrosis factor-alpha phosphorothioate 2_-O-(2-methoxyethyl) modified antisense oligonucleotides: comparison across species. // Drug Metab. Dispos. 2003. Vol. 31, №11. P. 1419.
25. Giacomini K.M., Sugiyama Y. Membrane transporters and drug response, in Goodman & Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 11th ed., Brunton, L.L., ed., McGraw-Hill, New York, 2006. P. 41.
26. Gleave M., Chi K.N. Knock-down of the cytoprotective gene, clusterin, to enhance hormone and chemosensitivity in prostate and other cancers. // Ann. NY Acad. Sci. 2005. Vol.1058. P. 1.
27. Gleave M., Miyake H. Use of antisense oligonucleotides targeting the cytoprotective gene, clusterin, to enhance androgen- and chemo-sensitivity in prostate cancer. // World J. Urol. 23. 2005. №1. P. 38.
28. Glover J.M., Leeds J.M., Mant T.G. et al. Phase I safety and pharmacokinetic profile of an intercellular adhesion molecule-1 antisense ODN (ISIS 2302). // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997. Vol. 282, №3. Р. 1173.
29. Graham M.J., Crooke S.T., Monteith D.K. et al. In vitro distribution and metabolism of a phosphorothioate ASOwithin rat liver after intravenous administration. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1998. Vol. 286, №1. P. 447.
30. Guvakova M.A., Yakubov L.A., Vlodavsky I., Tonkinson J.L., Stein C.A. Phosphorothioate ODNs bind to basic fibroblast growth factor, inhibit its binding to cell surface receptors, and remove it from low affinity binding sites on extracellular matrix. // J. Biol. Chem. 1995. Vol. 270. P.2620.
31. Henry S.P., Denny K.H., Templin M.V., Yu R.Z., Levin A.A. Effects of human and murine antisense oligonucleotide inhibitors of ICAM-1 on reproductive performance, fetal development, and post-natal development in mice. // Birth Defects Res. B Dev. Reprod. Toxicol. 2004. Vol. 71, №6. P. 359.
32. Hua X.Y., Moore A., Malkmus S. et al. Inhibition of spinal protein kinase C alpha expression by an antisense oligonucleotide attenuates morphine infusion-induced tolerance. // Neuroscience. 2002. Vol. 113, №1. P. 99.
33. Jackson J.K., Gleave M.E., Gleave J., Burt H.M. The inhibition of angiogenesis by antisense oligonucleotides to clusterin. // Angiogenesis. 2005. Vol. 8, №3. P. 229.
34. Kastelein J.J.P., Wedel M.K., Baker B.F. et al. Potent reduction of apolipoprotein B and Low-density lipoprotein cholesterol by short-term administration of an antisense inhibitor of apolipoprotein B. // Circulation. 2006. Vol. 114, №16. P. 1729.
35. Koziolkiewicz M., Krakoviak A., Kwinkowski M., Boczkowska M., Stec W.J. Stereodifferntiation – the effect of P chirality of oligo(nucleoside phosphorothioates) on the activity of bacterial RNase H. // Nucl. Acids Res. 1995. Vol.23, №24. Р. 5000.
36. Leeds J.M., Geary R.S. Pharmacokinetic properties of phosphorothioate ASOs in humans, in Antisense Research and Applications, 1st ed., Crooke, S. T., ed., Springer, Heidelberg, 1998. P. 217.
37. Leeds J.M., Henry S.P., Geary R.S., Burckin T.A., Levin A.A. Comparison of the pharmacokinetics of subcutaneous and intravenous administration of a phosphorothioate oligodeoxynucleotide in cynomolgus monkeys. // Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 2000. Vol.10, №6. Р. 435.
38. Levin A.A. A review of issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides. // Biochim. Biophys. Acta. 1999. Vol.1489, №1. Р. 69.
39. Levin A.A., Geary R.S., Leeds J.M. et al. The pharmacokinetics and toxicity of phosphorothioate ASOs, in Biotechnology and Safety Assessment, 2nd ed., Thomas, J. A., ed., Taylor & Francis, Philadelphia, PA, 1998. Р. 151.
40. Levin A.A., Henry S.P., Bennett C.F. et al. Preclinical development of antisense therapeutics, in Novel Therapeutics from Modern Biotechnology: From Laboratory to Human Testing, 1st ed., Oxender D.L. and Post L.E., eds., Springer-Verlag, Heidelberg, Germany, 1998. Р. 131.
41. Levin A.A., Henry S.P., Monteith D., Templin M. Toxicity of antisense oligonucleotides. // in Antisense Drug Technology, Crooke, S. T., ed., Marcel Dekker, New York, 2001. P. 201.
42. Loke S.L., Stein C.A., Zhang X.H. et al. Characterization of ASO transport into living cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. Vol. 86. P. 3474.
43. Lorenz P., Misteli T., Baker B.F., Bennett C.F., Spector D.L. Nucleocytoplasmic shuttling: a novel in vitro property of antisense phosphorothioate ODNs. // Nucl. Acids Res. 2000. Vol. 28, №2. P. 582.
44. Miner P.B., Geary R.S., Matson J. et al. Bioavailability and therapeutic activity of alicaforsen (ISIS 2302) administered as a rectal retention enema to subjects with active ulcerative colitis. // Ailment Pharmacol. Ther. 2006. Vol. 23, №10. Р. 1427.
45. Mou T.C., Gray D.M. The high binding affinity of phosphorothioate-modified oligomers for Ff gene 5 protein is moderated by the addition of C-5 propyne or 2_-O-methyl modifications. // Nucl. Acids Res. 2002. Vol. 30, №3. Р. 749.
46. Nicklin P.L., Craig S.J., Phillips J.A. Pharmacokinetic properties of phosphorothioates in animals-absorption, distribution, metabolism and elimination, in Antisense Research and Applications, 1st ed., Crooke, S. T., ed., Springer, Berlin, 1998. P. 141.
47. Peng B., Andrews J., Nestorov I. et al. Tissue distribution and physiologically based pharmacokinetics of antisense phosphorothioate ASO ISIS 1082 in rat. // Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 2001. Vol. 11, №1. P. 15.
48. Phillips J.A., Craig S.J., Bayley D. et al. Pharmacokinetics, metabolism and elimination of a 20-mer phosphorothioate ODN (CGP 69846A) after intravenous and subcutaneous administration. // Biochem. Pharmacol. 1997. Vol. 54, №6. Р. 657.
49. Sawai K., Mahato R.I., Oka Y., Takakura Y., Hashida M. Disposition of ASOs in isolated perfused rat kidney: involvement of scavenger receptors in their renal uptake. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 1996. Vol. 279, №1. P. 284.
50. Sewell L.K., Geary R.S., Baker B.F. et al. Phase I trial of ISIS 104838, a 2_-methoxyethyl modified antisense oligonucleotides targeting tumor necrosis factor-alpha. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2002. Vol. 303, №3. Р. 1334.
51. Slim G., Gait M.J. Configurationally defined phosphorothioate-containing oligoribonucleotides in the study of the mechanism of cleavage of hammerhead ribozymes. // Nucl. Acids Res. 1991. Vol. 19, №6. Р. 1183.
52. Snyder R.M., Mirabelli C.K., Crooke S.T. Cellular association, intracellular distribution, and efflux of auranofin via sequential ligand exchange reactions. // Biochem. Pharmacol. 1986. Vol. 35, №6. P. 923.
53. Soucy N.V., Riley J.P., Templin M.V. et al. Maternal and fetal distribution of a phosphorothioate ASO in rats after intravenous infusion. // Birth Defects Res. B Dev. Reprod. Toxicol. 2006. Vol. 77, №1. P. 22.
54. Spitzer S., Eckstein F. Inhibition of deoxyribonucleases by phosphorothioate groups in oligodeoxyribonucleotides. // Nucl. Acids Res. 1988. Vol. 16, №24. Р. 11691.
55. Stavchansky S., Geary R.S., Cho M. Pharmacokinetics and hepatic first pass effect of an antisense oligonucleotide (ISIS 2302) in rats. // in Annual Meeting of the American Association of Pharmaceutical Scientists, Indianapolis, IN, 2000. P. 216.
56. Templin M.V., Levin A.A., Graham M.J. et al. Pharmacokinetic and toxicity profile of a phosphorothioate ASO following inhalation delivery to lung in mice. // Antisense Nucl. Acid Drug Dev. 2000. Vol. 10, №5. Р. 359.
57. Teplova M., Minasov G., Tereshko V. et al. Crystal structure and improved antisense properties of 2_-O-(2-methoxyethyl)-RNA. // Nat. Struct. Biol. 1999. Vol.6, №6. Р.535.
58. Villalona-Calero M.A., Ritch P., Figueroa J.A. et al. A phase I/II study of LY900003, an antisense inhibitor of protein kinase C-alpha, in combination with cisplatin and gemcitabine in patients with advanced non-small cell lung cancer. // Clin. Cancer Res. 2004. Vol. 10, №18 Pt 1. P. 6086.
59. Watanabe T.A., Geary R.S., Levin A.A. Plasma protein binding of an antisense oligonucleotide targeting human ICAM-1 (ISIS 2302). // ASOs. 2006. Vol. 16, №2. P. 169.
60. White A.P., Reeves K.K., Snyder E. et al. Hydration of single-stranded phosphodiester and phosphorothioate oligodeoxyribonucleotides. // Nucl. Acids Res. 1996. Vol. 24, №16. Р. 3261.
61. Wilson D.M. 3rd, Ape1 abasic endonuclease activity is regulated by magnesium and potassium concentrations and is robust on alternative DNA structures. // J. Mol. Biol. 2005. Vol. 345, №5. P. 1003.
62. Yu D., Kandimalla E.R., Roskey A. et al. Stereo-enriched phosphorothioate ODNs: synthesis, biophysical and biological properties. // Bioorg. Med. Chem. 2000. Vol.8, №1. Р. 275.
63. Yu R.Z., Baer B., Chappel A. et al. Development of an ultrasensitive noncompetitive hybridization-ligation enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of phosphorothioate ODN in plasma. // Anal. Biochem. 2002. Vol. 304, №1. P. 19.
64. Yu R.Z., Geary R.S., Leeds J.M. et al. Comparison of pharmacokinetics and tissue disposition of an antisense phosphorothioate ASO targeting human Ha-ras mRNA in mouse and monkey. // J. Pharm. Sci. 2001. Vol. 90, №2. P. 182.
65. Yu R.Z., Geary R.S., Levin A.A. Application of novel quantitative bioanalytical methods for pharmacokinetic and pharmacokinetic/pharmacodynamic assessments of antisense oligonucleotides. // Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 2004. Vol. 7, №2. Р. 195.
66. Yu R.Z., Kim T.W., Hong A. et al. Cross species pharmacokinetic comparison from mouse to man of a second generation antisense oligonucleotide ISIS 301012, targeting human apolipoprotein B-100. // Drug Metab. Dispos. 2007. Vol. 35. P. 460.
67. Yu R.Z., Zhang H., Geary R.S. et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of an antisense phosphorothioate ASO targeting Fas mRNA in mice. // J. Pharmacol. Exp. Ther. 2001. Vol. 296, №2. P. 388.
68. Zinker B.A., Rondinone C.M., Trevillyan J.M. et al. PTP1B antisense oligonucleotide lowers PTP1B protein, normalizes blood glucose, and improves insulin sensitivity in diabetic mice. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002. Vol. 99, №17. P. 1137.