Содержимое (Table of Contents)
ОФС.1.8.2.0004.15 Испытание на анти-D антитела в лекарственных препаратах иммуноглобулинах человека
ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ
Вводится впервые
Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод определения анти-D антител в лекарственных препаратах иммуноглобулинов человека. Анти-D антитела определяют методом гемагглютинации «на плоскости» (Метод А) или в геле (Метод В).
Принцип метода состоит в том, что содержащиеся в испытуемом препарате анти-D антитела, являясь иммуноглобулинами класса G, способны вызывать агглютинацию D-положительных эритроцитов.
Проведение испытания
Для контроля специфичности анализа применяют D-отрицательные эритроциты фенотипа 0rr.
Допустимо применение как свежеприготовленной суспензии эритроцитов (при испытаниях методом гемагглютинации «на плоскости», Метод А), так и стандартных эритроцитов, входящих в тест-наборы (Методы А и В). При определении содержания анти-D-антител Методом А используют 3% суспензию эритроцитов, при определении содержания гемагглютининов гелевым методом (Метод В) используют 0,8% суспензию эритроцитов.
Метод гемагглютинации «на плоскости» (Метод А)
В стеклянные пробирки или лунки планшета вносят равное количество соответствующего разведения препарата и 3% суспензии D-положительных эритроцитов человека группы крови I (0) — первый ряд и 3% суспензии D-отрицательных эритроцитов человека группы крови I (0) — второй ряд. К подготовленному разведению стандартного образца также добавляют равное количество 3% суспензии D-положительных эритроцитов человека группы крови 0 (первый ряд) и 3% суспензии D-отрицательных эритроцитов человека группы крови 0 (второй ряд). Пробы осторожно встряхивают (на шейкере) в течение 10 сек, затем центрифугируют в течение 1 мин при 80 об/мин. Пробирки (планшеты) располагают под углом 70° к горизонтальной поверхности и оценивают визуально агглютинацию эритроцитов через 4 – 5 мин (но не более чем через 10 мин).
Метод гемагглютинации в геле (Метод В)
Гелевый метод основан на использовании гелевой карты, представляющей собой пластиковый планшет с микропробирками, наполненными гелевыми колонками. Каждая микропробирка состоит из дозирующей/инкубационной камеры и колонки, содержащей полимеризованные микросферы декстрана в буферном растворе низкой ионной силы (LISS).
В дозирующую/инкубационную камеру микропробирки вносят по 1 капле 0,8 % суспензии стандартных D-положительных эритроцитов человека группы крови 0 (первый ряд) или по 1 капле 0,8% суспензии стандартных D-отрицательных эритроцитов человека группы крови 0 (второй ряд) и по 25,0 мкл соответствующего разведения испытуемого образца. Одновременно готовят пробы положительного и отрицательного стандартных образцов содержания анти-D антител: в дозирующую/инкубационную камеру микропробирки вносят по 1 капле 0,8% суспензии стандартных D-положительных эритроцитов человека группы крови 0 (первый ряд) или по 1 капле 0,8% суспензии стандартных D-отрицательных эритроцитов человека группы крови 0 (второй ряд) и по 25,0 мкл соответствующего разведения стандартного образца. Пробы инкубируют при температуре (37±0,5)°С в течение 30 мин. По окончании инкубации пробы центрифугируют (на специальной центрифуге для гелевых карт) в стандартных условиях (запрограммированный режим) и оценивают агглютинацию. Агглютинированные эритроциты распределяются в толще гелевой колонки или в ее верхней части. Неагглютинированные эритроциты оседают на дно микропробирки.
Критерии приемлемости результатов:
— в пробирках (планшетах, микропробирках), содержащих суспензию D-отрицательных эритроцитов человека, агглютинация должна отсутствовать. Наличие агглютинации в этих пробирках (планшетах, микропробирках) свидетельствует о неспецифической реакции; испытания в этом случае необходимо повторить;
Примечания
- Подготовка испытуемого образца. Испытуемый образец разводят фосфатным буферным раствором (рН 7,4±0,1), содержащим 2 г/л бычьего сывороточного альбумина, до содержания белка в образце 25 г/л. Это разведение испытуемого образца принимают за двукратное разведение (1:2), даже если оно и не соответствует истинной кратности разведения.
Готовят два ряда двукратных разведений испытуемого образца с использованием фосфатного буферного раствора (рН 7,4±0,1), содержащего 2 г/л бычьего сывороточного альбумина (1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64; 1:128; 1:256). При использовании гелевого метода (Метод В) разведения испытуемого образца готовят с использованием 0,9% раствора натрия хлорида или буферного раствора низкой ионной силы (LISS).
- Подготовка стандартных образцов содержания анти- D антител . В качестве стандартных образцов используют 5% раствор иммуноглобулина человека, содержащий 0,0475 МЕ/мл анти-D антител и имеющий номинальный титр в реакции гемагглютинации 1:8 (положительный стандартный образец) и 5% раствор иммуноглобулина человека, содержащий анти-D антитела в разведении не более 1:2 (отрицательный стандартный образец). Содержание анти-D антител в положительном стандартном образце является максимально допустимым для препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения. Подготовку стандартных образцов проводят в соответствии с инструкцией по применению. Анализ проводят с образцами, разведенными фосфатным буферным раствором (рН 7,4±0,1), содержащим 2 г/л бычьего сывороточного альбумина, до содержания белка 25 г/л.
- Подготовка раствора папаина. Лиофилизат папаина растворяют в соответствии с инструкцией производителя. Инкубируют при температуре (37±0,5) 0 С в течение 10–15 мин. Раствор используют свежеприготовленным. Возможно хранение раствора при температуре(6±2) 0 С в течение 5 сут или при температуре минус (21±1)°С в течение 6 мес. Раствор после оттаивания повторному замораживанию не подлежит.
- Подготовка суспензии стандартных эритроцитов. Свежеприготовленные D-положительные эритроциты (хранившиеся не более 3 сут), полученные не менее чем от 3 доноров, центрифугируют в течение 10 мин при 1500–2000 об/мин при комнатной температуре. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют в десятикратном объеме фосфатного буферного раствора и центрифугируют 10 мин при тех же условиях. Процедуру повторяют не менее 3 раз, до получения прозрачной надосадочной жидкости.
В стеклянную пробирку вносят равные объемы промытых эритроцитов и раствора папаина, инкубируют в течение 15 мин при температуре (37±0,5) 0 С, а затем центрифугируют при 1500–2000 об/мин в течение 10 мин. После удаления надосадочной жидкости осадок ресуспендируют в десятикратном объеме фосфатного буферного раствора и центрифугируют при тех же условиях.
Для приготовления 3% суспензии 1 объем осадка папаинизированных эритроцитов ресуспендируют в 32 объемах фосфатного буферного раствора, содержащего 2 г/л бычего сывороточного альбумина.
Аналогичным образом приготавливают 3% суспензию D-отрицательных эритроцитов, полученных от 1-3 доноров.
- Приготовление фосфатного буферного раствора. В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 8,0 г натрия хлорида, 0,76 г безводного натрия гидрофосфата, 0,2 г калия хлорида, 0,2 калия дигидрофосфата. Добавляют 900 мл воды очищенной. Доводят рН до 7,4±0,1 1М раствором натрия гироксида или 1 М раствором хлористоводородной кислоты, перемешивают, доводят объем раствора до метки водой очищенной и вновь перемешивают.
На тарелку наносят большую каплю реагента (около 0,1 мл). Рядом помещают маленькую каплю (0,01-0,05 мл) исследуемой крови и смешивают кровь с реагентом. Реакция агглютинации начинает развиваться через 10-15 сек, четко выраженная агглютинация наступает через 30-60 сек. (резус положительная, нет агглютинации – резус отрицательная). Результаты реакции учитывают через 3 мин.
Тарелку после смешивания реагента с кровью рекомендуется покачивать не сразу, а через 20-30 сек, что позволяет за это время развиться более полной крупнолепестковой агглютинации.
56. Выполнение пробы на:
- индивидуальную совместимость крови донора и больного.
- пригодность крови: кровезаменителей, других растворов при переливании.
Проба на индивидуальную совместимость
Для пробы на индивидуальную совместимость используют сыворотку (не плазму!) крови реципиента и консервированную кровь (эритроциты, лейкоциты) донора.
Сыворотка больного должна быть свежей, полученной в тот же день или накануне. Для получения сыворотки у больного берут 4-5 мл крови из вены в чистую пробирку без стабилизатора. После свертывания крови от сгустка отделяется сыворотка, которая служит для проведения проб на совместимость.
Первая проба на совместимость по группе системы АВО производится при комнатной температуре. На тарелку наносят 2 капли сыворотки крови больного, туда же добавляют маленькую каплю донорской крови в соотношении 1:10 и перемешивают покачиванием или стеклянной палочкой. При отсутствии агглютинации через 5 минут (не более!) надо считать, что кровь совместима. Если появляется агглютинация, то кровь донора несовместима с кровью больного и не должна быть ему перелита.
После проведения первой пробы необходимо провести пробу на совместимость по Rh-фактору. Для этого существует 2 доступных метода - реакция в сывороточной среде и в желатине.
Первый метод: на чашку Петри наносят 1-2 капли сыворотки больного и маленькую каплю донорской крови, после чего ее на 10 минут ставят в водяную баню (+46~+48 "С). Наличие агглютинации свидетельствует о несовместимости.
Второй метод: на дно пробирки помещают маленькую каплю донорской крови, добавляют 2 капли подогретого 10 % раствора желатина и 2 капли сыворотки крови больного. Через 10 минут инкубирования в водяной бане при. температуре +46-+48 "С в пробирку добавляют 5 мл подогретого изотонического раствора хлорида натрия. "Наличие агглютинации свидетельствует о несовместимости крови донора и реципиента.
Следует отметить, что изоиммунные антитела и антитела других систем выявляются теми же методами, что и антитела анти-Rh, а некоторые - как антитела системы АВО. Поэтому несовместимость крови донора по этим антителам может быть выявлена при выполнении указанных проб на совместимость.
Биологическая проба является завершающей пробой на совместимость. С нее начинается переливание.
Струйно переливают 10-15 мл крови (эритроцитной массы, взвеси, плазмы), затем в течение 3 минут наблюдают за состоянием больного. При отсутствии явлений несовместимости (одышка, гиперемия лица, боли в животе, пояснице, беспокойство) вводят вновь 10-15 мл и опять наблюдают в течение 3 минут. Такую процедуру повторяют трижды. При отсутствии реакции продолжают вливание. В случае несовместимости, помимо описанных выше жалоб больного, становится малым и частым пульс, учащается и делается поверхностным дыхание, кожа лица приобретает сначала цианотично-красную окраску, затем бледнеет. В таких случаях, не дожидаясь развития гемотрансфузионного шока, необходимо на время прекратить переливание крови.
При переливании крови больному под наркозом при оценке биологической пробы должны учитываться объективные показатели (частота и наполнение пульса, артериальное давление, окраска кожного покрова, гемолиз, окраска мочи).
Оценка годности консервированной крови и ее компонентов для переливания . Перед трансфузией определяют пригодность крови для переливания: учитывают целостность упаковки, срок годности, нарушение режима хранения крови (возможное замерзание, перегревание). Наиболее целесообразно переливать кровь со сроком хранения не более 5-7 сут, так как с удлинением срока хранения в крови происходят биохимические и морфологические изменения, которые снижают ее положительные свойства. При макроскопической оценке кровь должна иметь три слоя. На дне расположен красный слой эритроцитов, он покрыт тонким серым слоем лейкоцитов и сверху определяется прозрачная слегка желтоватая плазма. Признаками непригодности крови являются: красное или розовое окрашивание плазмы (гемолиз), появление в плазме хлопьев, помутнения, наличие пленки на поверхности плазмы (признаки инфицирования крови), наличие сгустков (свертывание крови). При срочном переливании неотстоявшейся крови часть ее отливают в пробирку и центрифугируют. Розовое окрашивание плазмы указывает на гемолиз. При переливании замороженных компонентов крови упаковки с кровью быстро подогревают до температуры 38 0С, затем эритроциты отмывают от использованного криокорректора-глицерина для эритроцитов и диметилсульфоксида для лейкоцитов и тромбоцитов.
57. Оценка коагулограммы: время свертывания, длительность кровотечения, толерантного к гепарину, протромбиновый индекс, протромбиновое время, время рекальцификации.
Коагулограмма (гемостазиограмма) - это исследование, проводимое с целью определения свертывающей способности крови и возможных отклонений в ее работе.
При составлении коагулограммы учитывают следующие показатели:
1) время остановки кровотечения;
2) протромбиновое время;
3) тромбиновое время;
4) D-димер;
6) фибриноген;
7) антитромбин III;
8) активированное частичное тромбопластиновое время.
Скорость свертывания крови определяют посредством обычного прокола кожи, после которого засекают время до полной остановки кровотечения. Нормальным показателем считается показатель 2-3 мин. Увеличение времени может свидетельствовать о недостатке тромбоцитов и (или) нарушении их функций, что в свою очередь нередко свидетельствует о заболеваниях крови, почек или печени.
Протромбиновое время показывает, с какой скоростью фермент протромбин переходит в свою активную форму (тромбин). Тромбин способствует образованию кровяного сгустка, который закрывает дефект сосуда и останавливает, таким образом, кровотечение. Увеличение протромбинового времени в сравнении с нормой может свидетельствовать о гиповитаминозе К, а также дефиците факторов свертывания крови (не исключены заболевания печени).
Тромбиновое время отражает скорость перехода фибриногена (растворимого белка крови) в нерастворимый фибрин под влиянием тромбина. Фибрин выпадает в осадок в виде нитей, участвуя таким образом в конечной стадии образования кровяного сгустка. Увеличение данного времени может говорить о дефиците фибриногена, наличия в крови лекарственных препаратов: ингибиторов тромбина и фибриногена, а также гепарина.
Наличие в крови повышенного содержания фибриногена может говорить о воспалительных процессах в организме или возможном приеме женских половых гормонов. Аналогичная ситуация наблюдается у женщин в период беременности. Снижение уровня фибриногена в крови указывает на какие-либо нарушения в процессах его синтеза, а также внутрисосудистом свертывании крови.
D-димер представляет собой продукт распада фибрина и в норме должен присутствовать в крови, что говорит о стабильном образовании и разрушении фибрина. Это наблюдается также при синдроме диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови.
Сам факт присутствия в крови волчаночного фактора, а тем более его повышенного содержания является достаточно неблагоприятным, поскольку может стать причиной развития тромбозов.
Антитромбин III - это ингибитор тромбина, соответственно, его пониженное содержание в крови может стать причиной кровотечений и кровоизлияний.
Показатель активированного частичного тромбопластинового времени необходим для контроля гепаринотерапии у обследуемого и в норме составляет 30-40 с. Увеличение данного промежутка может говорить о недостатке или нарушений факторов свертывания крови, а также развитии гемофилии.
При необходимости проводят дополнительные исследования свертываемости крови.
Протромбиновый индекс отражает соотношение показателей протромбинового времени пациента к нормальному показателю протромбинового времени, выраженное в процентах.
На основании этого можно судить о содержании протромбина в организме. Повышение его уровня может также быть признаком таких заболеваний, как инфаркт миокарда или предынфарктное состояние, тромбоэмболия или злокачественные опухоли. Понижение уровня дает основание предположить его врожденный или приобретенный дефицит, а также гиповитаминоз К.
Время рекальцификации плазмы - это время, которое необходимо для образования сгустка фибрина и отражает процесс свертывания крови в целом. Изменение этого показателя отмечают при тех же заболеваниях, при которых отмечают изменения времени свертывания крови.
Тромботест дает возможность визуально определить содержание фибриногена в крови, поскольку при добавлении к плазме крови хлорида кальция в ходе исследования образуется фибриновый сгусток. Если концентрация фибриногена нормальная, то сгусток займет весь объем пробирки.
Изменения содержания фибриногена в крови имеют относительное диагностическое значение. Уменьшение этого показателя отмечается на фоне тяжелых поражений печени, гемолитической анемии и метастазировании злокачественных опухолей в костный мозг. Также пониженный уровень фибриногена наблюдается при тяжелых формах гепаторенального синдрома. Повышение содержания фибриногена в крови возможно при лейкозах, нефрозах, висцеральном сифилисе, непроходимости двенадцатиперстной кишки, гриппе, крупозной пневмонии, генерализации туберкулеза, а также при онкологических заболеваниях.
В норме у человека в крови существует некое динамическое равновесие между образованием фибрина и его растворением. Уменьшение фибринолитической активности говорит о повышенной тенденции к тромбообразованию или наличии некоторых ревматических заболеваний (степень снижения фибринолитической активности находится в прямой зависимости от активности ревматического процесса). Повышение фибринолитической активности крови может быть признаком повышенной опасности возникновения кровотечений. .
Некоторое повышение этого показателя отмечается также после ранений или значительных хирургических вмешательств, что рассматривается как защитнокомпенсаторная реакция организма. Достаточно продолжительное угнетение процесса фибринолиза может стать причиной возникновения долго незаживающих ран и трофических язв.
Толерантность плазмы к гепарину зависит от времени рекальцификации плазмы после добавления к ней некоторого количества гепарина. Снижение этого показателя может свидетельствовать о дефиците V, VIII, X, XI, XII факторов свертывания и отмечается на фоне таких серьезных заболеваний печени, как цирроз и гепатит.
Повышение толерантности плазмы к гепарину свидетельствует о сердечной недостаточности, злокачественных опухолях, а также предтромботических состояниях. Аналогичная ситуация может отмечаться у женщин в последние месяцы беременности.
Время свертывания крови по Ли-Уайту определяет скорость образования сгустка в венозной крови. Как правило, данный метод применяют для экспресс-диагностики наиболее тяжелых нарушений свертываемости крови. Увеличение нормального временного промежутка между забором крови и образованием сгустка может быть физиологическим (при беременности) и патологическим (на фоне тромбоцитопатий, постгеморрагических анемий, болезни Виллебранда, при отравлении ядами, вызывающими удушье, а также при долгом применении некоторых лекарственных средств). Уменьшение времени свертывания крови по Ли-Уайту свидетельствует о гемофилии или апластической анемии.
Продолжительность кровотечения по Дуке отражает степень эластичности кровеносных сосудов и их способность к сокращению при повреждении, а также возможные патологии тромбоцитарной системы. Увеличение времени позволяет заподозрить такие заболевания, как тромбопеническая и атромбопеническая пурпуры, лейкоз, геморрагический диатез, цирроз печени, сопровождающийся увеличением селезенки, пороки развития кровеносных сосудов, нарушение сократительной способности капилляров. Также время кровотечения увеличивается на фоне отравления фосфором и длительном приеме некоторых лекарственных препаратов. Уменьшение данного времени может говорить либо о повышенной спастической способности капилляров, либо о технической ошибке в ходе проведения теста.
Ретракция кровяного сгустка отражает физикохимические свойства крови, которые, в свою очередь, зависят от числа и качества содержащихся в ней тромбоцитов и концентрации солей. Этот показатель имеет диагностическое значение при выявлении геморрагических диатезов, но только в совокупности с другими симптомами данного заболевания.
1) протромбиновый индекс - более 80 %;
2) время рекальцификации плазмы - 60-120 с;
3) тромботест - IV-V степень;
4) фибриноген - 5,9-11,7 мкмоль/л;
5) фибриноген В - не определяется;
6) фибринолитическая активность - 183-263 мин.;
7) толерантность плазмы к гепарину - 3-6 (7-11) мин.;
8) время свертывания крови по Ли-Уайту - 5-10 мин.;
9) продолжительность кровотечения по Дьюку (Дуке) - до 4 мин.;
10) ретракция кровяного сгустка - 44-65 %.
58. Оценка результатов инструментальных методов исследования: УЗИ, гистероскопического, рентгенологического, лапароскопического.
См. вопросы 44 (УЗИ), 72 (гистероскопия), 69 (гистерография).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ С ПОМОЩЬЮ СТАНДАРТНЫХ СЫВОРОТОКОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ С ПОМОЩЬЮ СТАНДАРТНЫХ СЫВОРОТОК
Понятие резус-фактор - слишком общее (и устаревшее). Система резус антигенов многообразна. Современные методы исследования позволяют делать тесты индивидуально по резусу D, С, с, Е, е. Кроме этого, необходимо выявлять случаи со слабым D-антигеном или вариабильным D-антигеном. Вся эта информация тоже крайне важна при подборе донора в случае необходимости.
Ход работы . Определение резус-принадлежности крови проводится с помощью стандартной универсальной сыворотки «антирезус» для всех групп крови. В пробирку вводят одну каплю (0,05 мл) исследуемой крови или эритроцитов и добавляют 1-2 капли стандартного универсального реагента «антирезус» той же группы крови. Перешивают содержимое путем встряхивания пробирки и помещают ее на водяную баню на 5 минут при температуре 370С, так как иммунная реакция с антигеном требует оптимальной температуры. Как правило, агглютинация наступает в течение 3-5 мин. По истечении этого времени для исключения неспецифической агрегации эритроцитов в пробирку добавляют 2-3 мл изотонического раствора хлорида натрия и перемешивают (но взбалтывая!), 2-3 раза переворачивая пробирку.
В некоторых случаях не представляется возможным определение резус-принадлежности реципиента, тогда пользуются индивидуальной пробой на резус-совместимость крови донора и реципиента.
На чашку Петри наносят 2 капли сыворотки крови больного и маленькую каплю переливаемой крови, их смешивают и ставят на водяную баню (42-45 °С) на 10 мин. Если наступила агглютинация, то кровь донора несовместима с кровью реципиента и ее переливать нельзя.
Трактовка результатов . Пробирки просматривают на свет невооруженным глазом. При положительном результате агглютинация выражается в появлении хлопьев из склеенных эритроцитов на фоне просветленной жидкости. При отрицательном результате жидкость в пробирке остается равномерно окрашенной, без признаков агглютинации эритроцитов. Результат учитывают как истинный после проверки контрольных, образцов, т. е. при положительном результате со стандартными резус-отрицательными эритроцитами, одногруппными с исследуемой кровью.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЗУС ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ С ПОМОЩЬЮ ЦОЛИКЛОНОВ
Цоликлоны изготавливаются из асцитной жидкости мышей – носителей анти-D и анти-С гибридом. Цоликлоны Анти-D, Анти-С, Анти-с предназначены для определения резус принадлежности крови.
Ход определения . На планшет индивидуальными пипетками наносятся цоликлоны Анти-D, Анти-С, Анти-с по одной большой капле (0,1мл). Рядом с каплями антител наносится по одной маленькой капле исследуемой крови (0,01 мл). Кровь смешивается с реагентом. Наблюдается ход реакции с цоликлонами визуально при легком покачивании планшета в течение трех минут. Агглютинация эритроцитов с цоликлонами обычно наступает в первые 3-5 сек., но наблюдение следует вести 3 минуты ввиду более позднего появления агглютинации с эритроцитами, содержащими слабые разновидности резус-антигена. При использовании цоликлонов термостатировать не требуется,
Цоликлоны – моноклинальные антитела, которые были получены из крови мышей с помощью генной инженерии и используются для определения группы крови системы АВО и резус-фактора.
Цоликлоны, в противовес стандартным сывороткам, отличаются высокой активностью и авидностью (временем наступления, а также выраженностью склеивания (реакции агглютинации).
Основные цоликлоны:
- Анти-A;
- Анти-B;
- Анти-AB;
- Анти-0 и т.д.
По цоликлонам определяют резус-фактор и группы крови.
Техника определения групп с помощью цоликлонов
Определение данным методом производится в лабораторных условиях. Температура воздуха должна находиться в пределах +15 – + 25 градусов по Цельсию. Исследование должно проводиться при достаточно хорошем освещении.
Реагенты необходимо хранить плотно закрытыми, так как при высыхании значительно снижается активность антител. Нельзя использовать содержащие хлопья и мутные реагенты. Для каждого из реагентов требуется отдельная пипетка.
Анализ проводится на белой тарелке или планшете с хорошо смачиваемой поверхностью. Благодаря высокой активности и авидности цоликлонов, есть возможно применение по серии реагентов анти-A и анти-B.
На планшете нужно сделать надписи с названиям антигенов анти-A/анти-B. Далее снизу от соответствующих надписей капают примерно 0,1 миллилитр цоликлонов. У реагента анти-A цвет желтовато-розовый, у анти-B – синий.
Возле моноклональных антител капают по одной капле крови, смешивают ее уголком предметного стекла или стеклянной палочкой с реагентами. Перед дальнейшим смешиванием пар капель необходимо тщательно промыть и насухо вытереть стекло или палочку.
Наблюдение за процессом агглютинацией ведут в течение 2,5 минут, при этом тарелку или планшет нужно слегка покачивать . По истечении времени оценивают результат. Стоит отметить, что наблюдения за агглютинацией не требуют каких-либо специальных приспособлений.
Агглютинаты достаточно хорошо видны даже невооруженным глазом, быстро сливаясь и образуя большие хлопья. В случае, если не происходит склеивания, капля реагента приобретает равномерную окраску красного цвета.
Таблица сопоставления группы крови и цоликлона позволяет разобраться в результатах.
| Цоликлон | I положительная | I отрицательная | II положительная | II отрицательная | III положительная | III отрицательная | IV положительная | IV отрицательная |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Анти-А | + | + | + | + | ||||
| Анти-В | + | + | + | + | ||||
| Анти-D | + | + | + | + |
- Если отсутствует агглютинация (с анти-A и анти-B), эритроциты не содержат антигенов A и Б. Это I группа крови;
- Если есть агглютинация только с анти-A, эритроциты содержат лишь антиген A, что характеризует II группу крови;
- Если агглютинация только с анти-B, красные клетки содержат антиген B, что характеризует III группу;
- Если наблюдается агглютинация c обоими цоликлонамми анти-A и анти-B, эритроциты содержат оба антигена. С целью исключения аутоагглютинации необходимо провести контрольную процедуру: в этом случае смешивают 0,1 миллилитр изотонического раствора хлорида натрия и 0,01 миллилитр исследуемой крови. Если реакция агглютинации отсутствует, определяется IV группа.
Для определения резус-фактора наносят на планшет большую каплю анти-D-супе, возле нее – маленькую каплю (меньше в десять раз) исследуемой крови. Производят смешивание и оценивают полученный результат. Если реакция агглютинации началась, данная методика определяет кровь как резус-положительную, если резус-фактор отрицательный – агглютинации нет.
Препараты цоликлонов
Выделяют эритротест-цоликлон анти-D.
Существуют три разновидности:
Отличие других растворов состоит в названии, поскольку входящие в их состав антитела – иммуноглобулины М и G – предоставляют возможность только произвести типизацию крови по антигенам АВ0. Различие заключается исключительно в механизме слипания эритроцитов (агглютинация прямая/непрямая).
У каждого из этих препаратов есть свои собственные особенности использования и срок годности. Однако наибольшей популярностью в лабораторной клинической диагностике пользуются только 3 вышеуказанных препарата (анти-А, анти-В, анти-D).
Как определить группу в случае неверной трактовки результатов анализа
Иногда возможно получение недостоверных, ложных результатов. К примеру, если при добавлении к препарату крови изменился их цвет или если агглютинация наблюдается во всех ячейках планшетки.
Чтобы предотвратить такие результаты, если выполняется определение группы цоликлонами, алгоритм действий предусматривает определенные правила. Сначала следует посмотреть на срок обращения цоликлонов. Недопустимо использовать реагенты, у которых истек срок годности.
Обязательно нужно соблюдать и все условия правильного проведения процедуры. Помещение должно иметь хорошо оборудованное рабочее место с температурным режимом и достаточным освещением.
Если инструкция к препарату содержит указания и касательно требуемой влажности, следует учитывать и данный фактор.
Немалое значение имеет и чистота планшетки, так как ее загрязнение может привести к возникновению ошибок в исследовании и, как следствие, к получению неверных результатов.
Где можно провести анализ?
Определение группы цоликлонами постепенно приобретает все большую популярность. Если раньше эта процедура проводилась исключительно в специализированных стационарах (к примеру, только в отделениях гематологии и хирургии), то сейчас процедура доступна почти в любой достаточно оборудованной лаборатории.
Методика цоликлонов находит применение и в поликлиниках. Там ее включают различные методы экспресс-определения группы крови, проводимые с целью скорейшего выставления пациенту диагноза.
На платной основе проведение этой услуги предлагают и многие центры косметологии и частной медицины. Бесплатно данная процедура, как было сказано выше, проводится по направлению терапевта или лечащего врача.
Если отсутствует возможность обратиться за анализом крови в поликлинику, исследование можно провести и самостоятельно при наличии набора препаратов и специальной планшетки. Однако необходимо помнить, что для получения достоверных результатов требуется соблюдать условия процедуры, в особенности это касается стерильности.
Видео
ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ
Наиболее иммуногенным из 5 основных антигенов группы крови системы резус (табл. 18.3) является антиген D. Распространенность антигена D у населения Российской Федерации - 86% (доля резус-отрицательных лиц, соответственно, около 14%). Иммуногенность других (минорных) антигенов системы резус существенно ниже и убывает в следующем ряду: с > Е > С > е.
Иммунная система резус-отрицательных лиц при контакте с антигеном D синтезирует анти-D-антитела, что клинически важно при аллогенных гемотрансфузиях и беременности резус-отрицательной женщины резус-положительным плодом (посттрансфузионные гемолитические реакции и гемолитическая болезнь новорожденных, соответственно). В зависимости от гаплотипа на мембране эритроцитов обычно экспрессировано 10000-30000 молекул D, а в некоторых случаях и более.
Существует две особые категории D-позитивных лиц, способных образовывать анти-D-антитела.
- Первая - лица, эритроциты которых характеризуются значительно сниженной экспрессией нормального D на мембране, порядка 100-500 молекул на клетку, "слабый" D (D weak). Референтным методом выявления слабого D является непрямой антиглобулиновый тест.
- Вторая - лица, эритроциты которых характеризуются экспрессией измененного D (частичный D, D partial). Предполагается, что белковая молекула D имеет четыре частично перекрывающихся эпитопа: W, X, Y и Z. В редких случаях имеет место недостаток одного или нескольких эпитопов, соответственно, иммунная система лиц с частичным D способна вырабатывать антитела к отсутствующим эпитопам.
По современной классификации, лица с частичным D, способные вырабатывать анти-D-антитела, подразделяются на семь категорий. Наибольшую частоту встречаемости и практическое значение имеет категория VI, эритроциты которой несут только эпитоп Z. Лица категории VI могут вырабатывать антитела к неизмененному D и частичному D всех остальных категорий. Современный подход к выявлению частичного D категории VI предполагает исследование резус-принадлежности с использованием двух реагентов: моноклональных анти-D-антител класса IgМ и поликлональных анти-D-антител класса IgG (либо моноклональных анти-D-антител класса IgG).
Для удобства в повседневной работе иммуногематологических лабораторий слабые варианты антигена D объединяют в группу D u , частота которой составляет около 1%. Эти эритроциты слабо или вообще не агглютинируются полными анти-резус антителами в реакции прямой агглютинации.
Регламентированным является способ определения резус-принадлежности с использованием стандартного универсального реагента антирезус Rh0(D), первично отрицательные образцы дополнительно исследуются с использованием стандартного универсального реагента анти-Rh0" (DС) и со стандартной сывороткой Rh0-(DСЕ). Резус-отрицательными считают доноров, кровь которых не содержит ни одного из этих трех антигенов (D, С, Е). Указанный способ эффективно и широко использовался до разработки диагностикумов на основе моноклональных антител.
Более обоснованным представляется двух-этапный способ определения резус-принадлежности крови. На первом этапе используют цоликлон "Анти-D-супер" (моноклональные анти-D-антитела класса IgМ). На втором этапе резус-принадлежность определяют в пробирке, применяя стандартный универсальный реагент для определения резус-фактора Rh0(D), либо в желатиновом тесте с использованием цоликлона "Анти-D" (моноклональные анти-D-антитела класса IgG). Сочетание отрицательного результата на первом этапе и положительного - на втором является признаком частичного D, наиболее вероятно - категории VI.
В большинстве (порядка 90%) случаев для частичного D категории VI характерен генотип СсDее. С помощью высокоспецифичных моноклональных антител устанавливается гетерогенность частичного D категории VI.
Реципиенты, содержащие антиген D u , должны быть отнесены к резус-отрицательным и им должна быть перелита только резус-отрицательная кровь, так как нормальный антиген D может вызвать у таких лиц иммунный ответ.
Лица с антигеном D u квалифицируются как резус-положительные доноры, так как переливание их крови может вызвать иммунный ответ у резус-отрицательных реципиентов, а в случае предшествующей сенсибилизации к антигену D - тяжелые трансфузионные реакции. Поэтому кровь доноров следует обязательно тестировать на присутствие D u .
Беременным женщинам с частичным D категории VI, когда ожидается рождение ребенка с полным D, целесообразно назначение антирезусного иммуноглобулина.
Резус-принадлежность крови больных устанавливают по наличию или отсутствию антигена D. Во избежание ошибки процедуру взятия крови и определение резус-принадлежности проводят дважды. Определение минорных антигенов системы резус, как правило, производится при необходимости многократных трансфузий в тех случаях, когда в сыворотке реципиента обнаружены антитела к антигенам системы резус, а также у беременных женщин.
Результат определения резус-принадлежности крови больных регистрируется в специальном журнале и на бланке с указанием даты и за подписью врача, проводившего определение. Этот бланк вклеивается в историю болезни с указанием даты и подписью лечащего врача.
Результат определения резус-принадлежности крови доноров регистрируется в специальном журнале и в донорской карте с указанием даты и за подписью врача, проводившего определение.
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕЗУС-ПРИНАДЛЕЖНОСТИ КРОВИ
Реакция гемагглютинации на плоскости с помощью анти-D IgМ (полные антитела) моноклонального реагента
Определение производят в нативной крови, стабилизированной с помощью консервантов; в крови без антикоагулянта, в т. ч. взятой из пальца. Наиболее четкая реакция агглютинации наблюдается при использовании высокой концентрации эритроцитов и температуре около +37°С, поэтому желательно использовать подогретую пластинку.
Ход определения:
- на пластинку со смачиваемой поверхностью наносят большую каплю (около 0,1 мл) реагента;
- рядом помещают маленькую каплю (0,01-0,05 мл) исследуемой крови;
- смешивают кровь с реагентом стеклянной палочкой;
- через 10-15 с покачивают пластинку в течение 20-30 с;
- реакция агглютинации начинает развиваться через 10-15 с, четко выраженная крупнолепестковая агглютинация наступает через 30-60 с. Результат агглютинации следует учитывать
через 3 мин, поскольку с эритроцитами, несущими антиген D u , реакция агглютинации происходит медленнее.
Наличие агглютинации свидетельствует о присутствии в исследуемых эритроцитах антигена D (кровь - резус-положительная). Отсутствие агглютинации свидетельствует о том, что исследуемые эритроциты не содержат антигена D (кровь - резус-отрицательная). В случае слабой агглютинации делают предположение о наличии на эритроцитах слабого антигена D и проводят исследование фенотипа эритроцитов в непрямом антиглобулиновом тесте (непрямой пробе Кумбса) с использованием IgG (неполных) анти-D-антител.
- сразу же после определения записывают результаты реакции.
Определение слабых форм антигена D (D u) на втором этапе исследования реакцией конглютинации с желатином в пробирочном тесте с помощью анти-D IgG (неполные антитела) моноклонального реагента
Параллельно с исследованием осуществляют постановку трех контрольных проб:
- а) со стандартными резус-положительными эритроцитами;
- б) со стандартными резус-отрицательными эритроцитами;
- в) с исследуемыми эритроцитами и раствором желатина, но без анти-D-антител.
Ход определения:
- в пробирку вносят одну каплю (0,05 мл) свободных эритроцитов из сгустка свернувшейся крови или эритроцитов, отмытых от консерванта;
- добавляют 2 капли (0,1 мл) 10% желатина, предварительно прогретого при 45-50°С до разжижения;
- добавляют одну каплю реагента анти-В;
- перемешивают суспензию;
- инкубируют 10-15 мин в водяной бане или 30 мин в термостате при 48°С;
- прибавляют 5-6 мл физиологического раствора;
- осторожно переворачивают пробирку 1 - 2 раза;
- визуально (невооруженным глазом или используя лупу) определяют наличие агглютинатов.
Агглютинация эритроцитов свидетельствует о присутствии в них антигена D. В случае четкой агглютинации в образце крови, резус-отрицательной по результатам исследования с помощью анти-D IgМ моноклональных антител, делают заключение о наличии антигена D u . В случае нечеткой мелкопесочной агглютинации кровь необходимо тестировать в непрямом антиглобулиновом тесте.
Аналогичным образом наряду с моноклональными реагентами можно использовать стандартные аллоиммунные сыворотки с неполными анти-D-антителами.
При наличии неадекватных результатов контрольных проб определение резус-принадлежности следует повторить с использованием других реагентов или образца желатина. При агглютинации исследуемых эритроцитов желатином в отсутствие анти-D-антител можно предположить наличие на эритроцитах адсорбированных антиэритроцитарных антител анти-резус или иной специфичности.
Определение резус-антигенов с помощью универсальных реагентов
Стандартный реагент антирезус Rh0(О) содержит поликлональные неполные анти-D-антитела. Одновременно с исследованием крови доноров производится контрольное исследование стандартных резус-положительных эритроцитов той же группы или группы 0(I) и стандартных резус-отрицательных эритроцитов обязательно одногруппных с исследуемой кровью.
Ход определения:
- на дно пробирки вносят 1 каплю стандартного реагента антнрезус;
- добавляют каплю исследуемой крови (или эритроцитов);
- содержимое пробирки перемешивают встряхиванием;
- медленно поворачивают пробирку, наклоняя ее почти до горизонтали таким образом, чтобы содержимое растекалось по стенкам. Такое распределение крови по стенкам пробирки делает реакцию более выраженной;
- агглютинация наступает в течение первой минуты, но для образования устойчивого комплекса антиген-антитело и четко выраженной агглютинации, а также ввиду возможности замедленной реакции при наличии антигена D u , контакт эритроцитов с реагентом при перевертывании следует проводить не менее 3 мин;
- для исключении неспецифической агрегации эритроцитов в пробирку добавляют 2-3 мл физиологического раствора и перемешивают, не взбалтывая, путем 2-3 -кратного перевертывания пробирки;
- оценку производят визуально.
Наличие агглютинации в виде крупных хлопьев из эритроцитов на фоне просветленной жидкости свидетельствует о резус-положительной принадлежности исследуемой крови.
Отсутствие агглютинации (в пробирке гомогенно окрашенная жидкость) - признак резус-отрицательной принадлежности исследуемой крови.
Результат учитывается как истинный после проверки контрольных образцов, то есть при положительном результате со стандартными резус-положительными эритроцитами и отсутствии агглютинации со стандартными резус-отрицательными эритроцитами, одногруппными с исследуемой кровью по системе АВО.
Непрямой антиглобулиновый тест (непрямая проба Кумбса) с помощью (неполных) анти-D-антител
Параллельно с исследованием образцов тестируемой крови проводят контрольное исследование со стандартными резус-отрицательными эритроцитами.
Ход определения:
- из исследуемой крови готовят 2-5% взвесь отмытых эритроцитов. С этой целью вносят в пробирку 5 капель (около 0,25 мл) исследуемой крови, три раза отмывают в 5-10 мл физиологического раствора; ресуспендируют осадок эритроцитов в 2-3 мл физиологического раствора или, что предпочтительнее, в 2-3 мл раствора низкой ионной силы - РНИС (в этом случае произойдет более прочная и быстрая фиксация антител на эритроцитах);
- маркируют чистую пробирку;
- вносят в нее 1 каплю реагента анти-D;
- добавляют 1 каплю 2-5% взвеси исследуемых эритроцитов;
- если эритроциты суспендированы в физиологическом растворе - инкубируют смесь при 37°С в течение 30-45 мин; если используют эритроциты в РНИС - 10-15 мин;
- отмывают эритроциты, используя 5-10 мл физиологического раствора: при использовании моноклональных анти-D-антител - однократное отмывание, а при использовании поликлональных анти-D-антител - трехкратное. Следует иметь в виду, что сыворотка крови в разведении 1:4000 инактивирует равный объем антиглобулинового реагента, следовательно недостаточное отмывание может привести к инактивации антиглобулинового реагента и ложноотрицательному результату теста;
- удаляют физиологический раствор;
- добавляют 1 каплю антиглобулинового реагента к осадку эритроцитов и тщательно перемешивают;
- центрифугируют 15-20 с при 2000-3000 об./мин (900-1000 g);
- аккуратно ресуспендируют осадок эритроцитов и визуально определяют наличие или отсутствие агглютинации. При наличии агглютинации кровь является резус-положительной. При отсутствии агглютинации - резус-отрицательной. Слабая агглютинация возможна при экспрессии антигена D u ;
- записывают результаты исследования.
Агглютинация эритроцитов, обработанных протеолитическими ферментами, IgG (неполными) анти-D-антителами
Для усиления прямой агглютинации эритроцитов в солевой среде используют предварительную обработку эритроцитов протеазами (протеолитическими ферментами): бромелином, папайном, трипсином и др. При этом повышается чувствительность метода, в том числе и в отношении слабых форм антигена D. Метод используется в системах автоматизированного определения групп крови. Особенностью этого теста, затрудняющей его применение для рутинного фенотипирования эритроцитов, является феномен прозоны - ингибирование агглютинации избыточным количеством антител. Для избежания феномена прозоны необходимо обеспечить стандартность обработки эритроцитов ферментами и строго соблюдать концентрацию анти-D-антител,- рекомендованную производителем.
| Страница
3
Источник : Медицинская лабораторная диагностика, программы и алгоритмы. Под ред. проф. Карпищенко А.И., СПб, Интермедика, 2001 |