Virginia Tech Chang Lu keemiatehnika dotsent. (Foto: Virginia Tech)
Virginia Techi keemiatehnika dotsent ( Virginia Tech) Chang Lu ja tema keemiainseneridest koosnev uurimisrühm on leidnud, kuidas "oluliselt parandada" geneetilise materjali tarnimist rakku. DNA. Nende tööd kirjeldav artikkel avaldati peamises mikrofluidika ajakirjas Labor kiibil, kui ka sisse Loodus .
Dr Lu lõppeesmärk on rakendada nende meetodit geneetiliselt muundatud rakkude loomisel vähi immunoteraapiaks, raviks tüvirakud ja kudede regenereerimine.
Üks enim kasutatavaid füüsilisi meetodeid geenide rakku toimetamiseks on "uskumatult ebaefektiivne, sest ainult väike osa kogu membraanipinnast on läbilaskev," ütleb dr Lu.
Meetodit, mille poole Lu pöördus, nimetatakse elektroporatsioon, mille nimeks on aastakümneid rakkude läbilaskvuse suurendamine, mis on tingitud rakkudele elektrivälja rakendamisest, mis viib nende membraani pisikeste pooride moodustumiseni.
Dr Lu selgitab tema ja ta kolleegide poolt täiustatud elektroporatsioonimeetodi toimemehhanismi järgmiselt: „Traditsioonilised elektroporatsioonimeetodid edastavad DNA-d ainult läbi väga piiratud osa rakupinnast, mille määravad kindlaks füüsikalised nähtused, mis reguleerivad nende vahelist vastasmõju. elektriväli ja rakk. Meie meetod võimaldab saavutada DNA ühtlase kohaletoimetamise kogu rakupinnale, mida meie teadmiste kohaselt on demonstreeritud esimest korda. Tulemuseks on geneetilise materjali ülekande tohutu kasv.
Uus lähenemisviis kasutab "hüdrodünaamilisi efekte, mis ilmnevad ainult siis, kui vedelikuvood liiguvad läbi kõverate kanalite. On teada, et sellistes tingimustes moodustab vool keerised. Sellise vooluga kantud rakud pöörlevad ja suurem osa nende pindalast puutub kokku elektriväljaga. Geeni kohaletoimetamisel vooluga kõverates kanalites on olulised eelised võrreldes traditsioonilise elektroporatsiooniga staatilistes lahustes ja sirgetes kanalites.
"Spiraalkanal annab sirge kanaliga võrreldes kahekordse tõusu ja staatilise lahendusega võrreldes veelgi rohkem," selgitab teadlane.
Fluorestsentsmikroskoopia abil suutsid teadlased "kaardistada" rakupinna elektroporatsiooniga alad ja määrata DNA allaneelamise ulatuse.
Foto on tehtud Lab on a Chipi loal
Tavaline DNA kohaletoimetamine staatilise rakususpensiooniga küveti tüüpi seadmetega toimub ainult rakupinna kitsas ribas. Kui elektroporatsiooni teostatakse spiraalses või kõveras kanalis hõljuvatel rakkudel, on kujutised oluliselt erinevad, mis näitab DNA ülekande ühtlast jaotumist kogu rakupinnal.
Leiutis käsitleb biotehnoloogia valdkonda, täpsemalt meetodit DNA sihipäraseks kohaletoimetamiseks kasvaja- ja tüvirakkudesse, mis ekspresseerivad CXCR4 retseptorit. Käesolevat leiutist saab kasutada geneetiliste konstruktsioonide sihipäraseks kohaletoimetamiseks tüvi- ja pahaloomuliste kasvajarakkudesse, et korrigeerida geenidefekte ja ennetada haigusi. Meetod hõlmab geneetiliste konstruktsioonide kandjate valmistamist, kaasates kandjamolekulide koostisesse signaaljärjestused, milleks on lüsiini kaheksast aminohappejäägist koosnev DNA-d siduv järjestus - KKKKKKKKK. Signaaljärjestuse kinnitamine DNA-d siduva järjestusega viiakse läbi kahest ε-aminoheksaanhappe molekulist koosneva linkeri sektsiooni abil. Pärast seda moodustuvad DNA/kandja kompleksid. Seejärel viiakse transfektsioon läbi in vitro. Kavandatav leiutis võimaldab suurendada huvipakkuva geeni toimetamise efektiivsust kasvaja- ja tüvirakkudesse. 2 w.p. f-ly, 4 ill.
Leiutis käsitleb geenimeditsiini, geeniteraapiat, biotehnoloogiat ja farmaatsiatooteid ning seda saab kasutada geneetiliste konstruktsioonide sihipäraseks kohaletoimetamiseks tüvi- ja pahaloomuliste kasvajarakkudesse, et korrigeerida geenidefekte ja ennetada haigusi. Geenikonstruktsioonide koespetsiifiline kohaletoimetamine on tagatud seda tüüpi rakkudes ekspresseeritava CXCR4 retseptori signaaljärjestuste kasutamisega.
Geeniteraapiat eristab tavameditsiini lähenemisviisidest selle keskendumine haiguse põhjuse, mitte sümptomite ja tagajärgede vastu võitlemisele. Praegu töötatakse välja geeniteraapia lähenemisviise paljude inimeste haiguste raviks või ennetamiseks. Need lähenemisviisid võivad olla rakendatavad in vivo ja ex vivo ravis. In vivo teraapia põhineb geneetiliste konstruktsioonide otsesel sisestamisel otse kehakudedesse. Süstimine võib toimuda intravenoosselt, kasutades aerosooldosaatoreid või süstides konkreetsetesse kudedesse. Ex vivo geeniteraapia põhineb teatud tüüpi rakkude isoleerimisel kehast, "terapeutilise" geenikonstruktsiooni sisestamisel neisse, transfekteeritud rakkude selekteerimisel ja sellele järgneval patsiendile uuesti implanteerimisel.
Praegu väljatöötatud lähenemisviisides geneetiliste konstruktsioonide kohaletoimetamiseks on kolm peamist suunda:
1) kloonimine viirusvektorite osana;
2) füüsiliste transfektsioonimeetodite kasutamine;
3) plasmiidsete ekspressioonivektorite ja mitteviiruse kandjamolekulide komplekside kasutamine.
Viiruse poolt vahendatud ülekanne on väga tõhus meetod DNA sihtrakkudesse toimetamiseks, kuna modifitseeritud viirusvektori sisenemine on sarnane protsessiga, mis toimub loomulikult viiruse genoomi kandmisel peremeesrakkudesse. Enim uuritud on retro-, adeno-, adeno-assotsieerunud viiruste baasil loodud vektorid. Viiruste eeliste hulka kuuluvad ennekõike ekspressioonivektori ja kandja omaduste kombinatsioon, spetsiifilise kohaletoimetamise võimalus, võime transfekteerida jagunevaid ja mittejagunevaid rakke, DNA kromosoomi kinnistamise võimalus, et tagada pikaajaline väljendus. Nende eeliste tõttu kasutatakse seda lähenemisviisi geenide kohaletoimetamise uuringutes endiselt laialdaselt, kuigi sellel on mõned puudused. Retro- ja adeno-assotsieerunud viirustel on kloonitud DNA fragmendi suurus piiratud ja viiruse sisestamisel peremeesgenoomi on oht insertsioonimutageneesi tekkeks. Adenoviirusvektorite tõsine puudus on väljendunud immuunvastus suurte annuste ja adenoviiruse konstruktide korduvate süstide korral (Walther W., Stein U. Viirusvektorid geeniülekandeks: ülevaade nende kasutamisest inimeste haiguste ravis // Ravimid. - 2000. - v. 60. - Lk 249-271, RF patent nr 2252255, C12N 15/37, C12N 15/86, C12N 15/861, C12N 15/867, avaldatud 2005.05.20).
Palja plasmiidse DNA konstruktide süstimine oli üks esimesi lähenemisviise geeniteraapia ravistrateegiate väljatöötamisel. Transfektsiooni madal efektiivsus "palja" DNA abil andis tõuke uute meetodite väljatöötamiseks geneetiliste konstruktsioonide kohaletoimetamiseks. DNA keharakkudesse toimetamiseks on uuritud erinevaid füüsilisi meetodeid. Neist populaarseimad on ballistilise transfektsiooni ja elektroporatsiooni meetodid, mida kasutatakse laialdaselt naha- ja lihasrakkude transfektsiooniks. Ballistilise transfektsiooni meetod põhineb kulla või volframi mikroosakestele ladestunud DNA tungimisel rakku. Transfektsioon toimub surugaasi või vedeliku voolu rõhu all. Elektroporatsiooni meetod põhineb rakumembraani elektripotentsiaali lokaalsel muutusel elektrivoolu toimel. Elektrilised impulsid põhjustavad rakumembraanis pooride moodustumist, muutes selle seeläbi biomolekulidele läbilaskvaks. Palja DNA in vivo transfektsiooni madala efektiivsuse ületamiseks kasutatakse ka hüdrodünaamilise šoki meetodit - plasmiidvektori intravenoosset või intraarteriaalset süstimist suures mahus lahuses. Olemasolevate füüsiliste transfektsioonimeetodite peamisteks puudusteks on DNA kohaletoimetamise toime madal efektiivsus ja lokaalsus. Need võimaldavad plasmiidil ületada rakumembraani ja vältida endosoomidesse sattumist, vältides seega ensümaatilist lagunemist, kuid reeglina ei taga sisseviidud geneetiliste konstruktsioonide pikaajalist püsivust (Wells D.J. Geeniteraapia progress ja väljavaated: elektroporatsioon jt. füüsikalised meetodid // Gene Ther. - 2004. - v.11, No. 18. - P.1363-1369; Wang S., Joshi S, Lu S. DNA kohaletoimetamine nahale osakeste pommitamise teel // Methods Mol Biol. - 2004. - v.245. - P.185-196; Herweijer H., Wolff J.A. Edusammud ja väljavaated: palja DNA geeniülekanne ja -teraapia // Geeniteraapia. - 2003. - v.10, nr 6. - P .453-458).
Mitteviiruslikud kandjad on alternatiiviks viiruse poolt vahendatud geneetiliste konstruktsioonide ülekandmisele imetajarakkudesse. Mitteviiruslikud kandjad on kergesti sünteesitavad, nende muutmise lihtsus võimaldab muuta molekulide struktuuri ja koostist, parandades seeläbi kohaletoimetamise vahendeid. Mitteviirusliku söötme kasutamisel ei ole tarnitud ekspressioonivektori suurusele piiranguid. Lisaks on need vähem toksilised, enamikul juhtudel ei põhjusta spetsiifilist immuunvastust ja on ohutum kasutada in vivo kui viirusvektorid. Seetõttu võib mitteviiruse kandjatesse pakendatud geneetilise konstrukti kasutuselevõttu korrata. Mitteviiruslike kandjate uurimine areneb plasmiidse DNA transfektsiooniomaduste parandamise suunas, moodustades DNA komplekse erinevate sünteetiliste ühenditega (lipiidid, oligo- ja polüpeptiidid, polümeerid jne) (näiteks RF patent nr 2336090). , A61K 39/00, A61K 47/00, avaldatud 2008.10.20). Mitteviiruslike manustamisvahendite täiustamine sõltub suuresti DNA keharakkudesse tungimise takistuste üksikasjalikust mõistmisest (Schmidt-Wolf G.D., Schmidt-Wolf I.G. Mitteviiruslikud ja hübriidvektorid inimese geeniteraapias: värskendus // Trends Mol Med. – 2003. – v.9, nr 2 – lk 67-72; Gardlic R, Palffy R, Hodosy J., Turna J., Celec P. Vektorid ja kohaletoimetamissüsteemid geeniteraapias // Med Sci Monit - 2005. - v .11, nr 4. - lk 110-121; Wiethoff C.M., Middaugh C.R. Barriers to non-viral gene transporting // J Pharm Sci. - 2003. - v.92, nr 2. - P .203-217).
Arvatakse, et mitteviiruslikul kandjal peaksid olema järgmised omadused:
1) olema mittetoksiline, kompaktne ja kaitsma plasmiidset DNA-d ensümaatilise lagunemise eest, pärast kasutamist organismist erituda;
2) tagada plasmiidi tungimine rakku spetsiifilise seondumise teel raku plasmamembraaniga:
3) omama võimet vabastada DNA-d endosomaalsest sektsioonist;
tagama DNA dissotsiatsiooni kompleksist plasmiidi edasiseks transpordiks tuuma.
Geeniteraapia eesmärgil on kõige eelistatumaks geneetiliste konstruktsioonide kohaletoimetamise meetodiks nende koespetsiifiline ülekandmine keharakkudesse ja kudedesse.
Esimene komplekside rakusisese läbitungimise takistus on plasmamembraan. Enamik komplekse suhtleb raku pinnaga elektrostaatilisi jõude kasutades. Võimalikuks mehhanismiks komplekside sidumisel rakuga on nende interaktsioon rakupinna valkude, glükoosaminoglükaanidega. Selle komplekside läbitungimise mehhanismiga ei toimu aga geenikonstruktsioonide koespetsiifilist ülekandmist. Samal ajal on geneetiliste konstruktsioonide koespetsiifilise kohaletoimetamise probleem oluline mitmete haiguste geeniteraapias. Spetsiifilise interaktsiooni jaoks rakupinnaga sisaldavad kompleksid rakupinnal olevate retseptorite ligandid. Praeguseks on iseloomustatud mitmeid integriini peptiidligande. Nende hulka kuuluvad eelkõige tripeptiidi fragment RGD (integriinid esinevad paljude rakkude pinnal), transferriin (selle retseptoril on suurenenud ekspressioon prolifereeruvates rakkudes), asialorosomukoid (asialoglükoproteiini retseptoril on spetsiifiline ekspressioon maksa hepatotsüütides).
Geneetilise materjali spetsiifiliseks kohaletoimetamiseks närvirakkudesse tegi Zeng ja kolleegid ettepaneku kasutada kandjat, mis koosneb TrkA retseptori signaalipiirkonnast (80-108 aminohapet närvi kasvufaktorist) ja 10 lüsiini aminohappejäägist koosnevast DNA-d siduvast järjestusest. . See kandja suutis endosomolüütilise aine klorokiini juuresolekul, mis hõlbustab komplekside vabanemist raku endosomaalsest kambrist, koespetsiifiliselt toimetada markergeeni ainult TrkA retseptorit ekspresseerivatesse rakkudesse. Seda kandjat saab kasutada mitmesuguste neuroloogiliste haiguste nagu epilepsia, Parkinsoni ja Alzheimeri tõve geeniteraapias. Kuid see ei sobi geneetilise materjali edastamiseks teistele rakutüüpidele (Zeng J, Too HP, Ma Y, Luo E, Wang S Sünteetiline peptiid, mis sisaldab närvikasvufaktori ahelat 4 sihtgeenide kohaletoimetamiseks // J Gene Med 2004; 6 : 1247-1256).
Inimese tüvirakke peetakse paljutõotavateks aineteks mitmesuguste inimhaiguste raku- ja geeniteraapias. Samal ajal on need ühed kõige raskemini transfekteeritavad rakutüübid. Vähi geeniteraapia ravis on vaja tagada geenide otsene jõudmine kasvajarakkudesse.
CXCR4 on kemokiini SDF-1α tüvirakkude migratsioonifaktori retseptor. CXCR4 ekspresseeritakse hematopoeetilistes rakkudes, veresoonte endoteelis ja lihaste satelliitrakkudes. Selle geeni kõrget ekspressioonitaset täheldati enam kui 20 tüüpi vähi kasvajate puhul (rinnavähk, eesnäärmevähk jne), samuti migreeruvates tüvirakkudes. CXCR4 retseptor on võimeline seonduma ka viiruse kemokiiniga vMIP-II (Kaposi sarkoomiviirus). Seega on CXCR4 retseptoriga seondumise signaaljärjestuste kandjamolekulidesse lisamine paljutõotav viis süsteemide loomiseks geenide sihtotstarbeliseks kohaletoimetamiseks kasvaja- ja tüvirakkudesse.
Geneetilise materjali toimetamiseks CXCR4 retseptorit ekspresseerivatesse rakkudesse kasutasid Le Bon ja kolleegid selle retseptori sünteetilist ligandit AMD3100, mis oli seotud polüetüleen-imiini või katioonsete lipiididega. Geneetilise materjali kompleksid nende ühenditega ei suurendanud oluliselt markergeeni CXCR4+ rakkudesse kohaletoimetamise efektiivsust võrreldes signaalideta ühenditega. Le Boni kasutatud kandjad ei olnud efektiivsed, sest spetsiifiline kohaletoimetamine nende abil on võimalik vaid siis, kui transfektsioonisöötmele on lisatud CXCR4 retseptori internaliseerumist soodustav aine (forboolester). (Le Bon B, Van Craynest N, Daoudi JM, Di Giorgio C, Domb AJ, Vierling P. AMD3100 konjugaadid sihitud mitteviiruslike geenide kohaletoimetamise süsteemide komponentidena: CXCR4 ekspresseerivate rakkude süntees ja in vitro transfektsiooni efektiivsus. // Chem Biocon20004 , 15: 413-423).
Seega on vaja luua geneetiliste konstruktsioonide kandja, mis suudaks tagada spetsiifilise kohaletoimetamise CXCR4(+) rakkudele ega mõjuta lähedalasuvaid kudesid. Selline meetod on antud käesoleva leiutisega.
Leiutis põhineb ülesandel töötada välja meetod geneetiliste konstruktsioonide spetsiifiliseks kohaletoimetamiseks CXCR4 retseptorit ekspresseerivatesse rakkudesse, mille puhul CXCR4 retseptori signaaljärjestusi sisaldavate geneetiliste konstruktsioonide kandjaid kasutades suurendatakse geenide kohaletoimetamise efektiivsust. "huvi" geen saavutatakse. Oluline on märkida, et nõueldud kandjate sünteesi võib läbi viia mis tahes tuntud tahkefaasilise peptiidi sünteesi meetodiga.
Tehnilise probleemi lahenduse annab asjaolu, et DNA sihipärase toimetamise meetodis CXCR4 retseptorit ekspresseerivatesse kasvaja- ja tüvirakkudesse, sealhulgas geneetiliste konstruktsioonide kandjate valmistamisel kandjamolekulide koostisesse kaasamise teel, mis on kaheksast lüsiini aminohappejäägist koosnev DNA-d siduv järjestus - KKKKKKKK, signaaljärjestused, DNA/kandja komplekside moodustumine, transfektsiooni teostamine in vitro, signaaljärjestus valitakse rühmast: 1 kuni 8 aminohappest koosnev fragment SDF-1α valgu N-otsa järjestus - KPVSLSYR; fragment 1 kuni 17 aminohappest SDF-1α valgu N-otsa järjestusest - KPVSLSYRCPCRFFESH, kus 9 ja 11 aminohapet on asendatud seriiniga; või viiruse kemokiini vMIP-II - LGASWHRPDK N-terminaalse järjestuse 1 kuni 10 aminohappest koosnev fragment; signaaljärjestuse kinnitumine DNA-d siduva järjestuse külge viiakse läbi kahe e-aminoheksaanhappe molekuli linkersaidi abil.
Sel juhul võib signaaljärjestus olla SDF-1α-KPVSLSYR valgu N-otsa järjestuse aminohapete 1 kuni 8 fragment.
Alternatiivselt võib signaaljärjestus olla SDF-1α valgu N-terminaalse järjestuse KPVSLSYRCPCRFFESH fragment aminohapetest 1 kuni 17, kus aminohapped 9 ja 11 on asendatud seriiniga.
Signaalpiirkonnana võib kasutada ka fragmenti viiruse kemokiini vMIP-II - LGASWHRPDK N-terminaalse järjestuse aminohapetest 1 kuni 10, mis on sünteesitud D-aminohapetest.
Glütserooli või klorokiini võib kasutada komponendina, mis tagab kandjatest ja geneetilisest materjalist koosnevate komplekside väljumise endosoomidest.
Plasmiidset DNA-d saab kasutada kandjate geneetilise materjalina.
Käesolevas leiutises määratletud tehniline tulemus saavutatakse oligolüsiini molekulide - KKKKKKKK (K8) kasutamisega, mis on konjugeeritud SDF-1 või vMIP-II valkude CXCR4 retseptori signaaljärjestustega, nimelt SDF-1 N-terminaalse järjestusega. kemokiin (1 kuni 8 aminohappega) või SDF-1 kemokiini N-otsa järjestus (1 kuni 17 aminohappega, 9 ja 11 aminohappe asendamisega seriiniga) või vMIP-II viiruse N-terminaalne järjestus kemokiin (1 kuni 10 aa D-konformatsioonis). Oligolüsiini KKKKKKKK olemasolu kandja koostises võimaldab konjugaatidel elektrostaatilise interaktsiooni tõttu moodustada komplekse nukleiinhapetega, eriti plasmiidse DNA-ga.
Määratud tehniline tulemus saavutatakse kolme pakutava kandja variandiga.
Täpsustatud tehniline tulemus vastavalt esimesele variandile saavutatakse sellega, et lühikeses CDP kandjas, mis põhineb SDF-1 kemokiini sünteetilistel analoogidel, mis sisaldab katioonset komponenti, milleks on K8 oligolüsiin, mida kasutatakse plasmiidse DNA kondenseerimiseks, ja ligandi komponent interaktsiooniks CXCR4 retseptoriga, vastavalt leiutisele, SDF-1 valgu N-otsa järjestuse fragment (1-8 aa), mille struktuur on KPVSLSYR ja millel on agonisti aktiivsus CXCR4 retseptorist kasutatakse ligandikomponendina ja konjugaadi katioonse komponendi struktuur on KKKKKKKK ja see on ligandi komponendi külge kinnitatud läbi speisseri – kahe molekuli ε-aminoheksaanhappe (Ahx).
Täpsustatud tehniline tulemus vastavalt teisele variandile saavutatakse sellega, et SDF-1 kemokiini sünteetilistel analoogidel põhinevas kandjas (pikk CDP), mis sisaldab katioonset komponenti, milleks on plasmiidse DNA kondenseerimiseks kasutatav oligolüsiin K8 ja ligandkomponent interaktsiooniks CXCR4 retseptoriga vastavalt patendinõudlusele, SDF-1 valgu N-otsa järjestuse fragment (1-17 aa; aa9 ja aa11 asendatud seriiniga), millel on struktuur KPVSLSYRSPSRFFESH ja millel on CXCR4 retseptori agonistide aktiivsus, kasutatakse ligandi komponendina ning konjugaadi katioonse komponendi struktuur on KKKKKKKK ja see on ligandi komponendi külge kinnitatud läbi speisseri - kaks ε-aminoheksaanhappe molekuli.
Täpsustatud tehniline tulemus vastavalt kolmandale variandile saavutatakse sellega, et kandjas (viiruse CDP), mis põhineb Kaposi sarkoomiviiruse valgu sünteetilistel analoogidel vMIP-II, mis sisaldab katioonset komponenti, milleks on oligolüsiin K8. plasmiidse DNA kondenseerimiseks ja ligandikomponenti interaktsiooniks retseptoriga CXCR4 vastavalt patendinõudlusele leiutisele, fragmenti (1-10 Daa - sünteesitud D-aminohapetest) vMIP- N-otsa järjestusest. Ligandkomponendina kasutatakse II valku, mille struktuur on LGASWHRPDK ja millel on CXCR4 retseptori antagonistide aktiivsus, ning konjugaadi katioonse komponendi struktuur on KKKKKKKKK ja see on ligandi komponendi külge kinnitunud speisseri kaudu - kaks ε molekuli. -aminoheksaanhape.
Kõiki kolme väidetava kandja varianti saab sünteesida tuntud peptiidide sünteesimeetoditega, näiteks tahkefaasilise Boc-meetodiga (Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide // Journal of the American Chemical Society). 1963. V.85 (14), lk.2149-2154).
Konkreetsed rakendusnäited
Leiutist illustreeritakse joonisel fig 1, mis näitab etiidiumbromiidi fluorestsentsi intensiivsuse muutust kandja/DNA laengu suhete suurenemisega lühikestes CDP/DNA, pikkades CDP/DNA ja viiruse CDP/DNA kompleksides. Fluorestsentsi intensiivsuse vähenemine näitab moodustunud komplekside tiheduse suurenemist. Fluorestsentskõverate platoo näitab, et kompleksid on saavutanud tiheduse, mis on piisav etiidiumbromiidi fluorestsentsi kustutamiseks.
Joonisel 2 on näidatud lutsiferaasi aktiivsuse sõltuvus HeLa (CXCR4+) rakkudes pärast transfektsiooni lühikese CDP/DNA, pika CDP/DNA ja viirusliku CDP/DNA kompleksiga endosomolüütilise aine glütserooli juuresolekul. Sel juhul kasutati komplekse, mis tekkisid järgmiste kandja/DNA laengu suhetega: 3/1, 6/1, 9/1, 12/1. Intaktne molekul, DNA, PEI/DNA 1/8 kompleksid (katse positiivne kontroll - kaubanduslik kandja hargnenud polüetüleenimiin 25 kDa - PEI) ning DNA-d ja kontrollpeptiidi (CP) sisaldavad kompleksid toimisid katsekontrollina. CP erineb käesoleva leiutise kandjatest selle poolest, et sellel puudub CXCR4 retseptori sidumissignaal ja see on struktuurselt oligolüsiin KKKKKKKK. Lühikese CDP, pika CDP ja viirusliku CDP kandjate markergeeni kohaletoimetamise efektiivsus oli 10–100 korda kõrgem kui kontroll-CP oma.
Joonisel 3 on näidatud lutsiferaasi aktiivsuse sõltuvus A172 (CXCR4+) rakkudes pärast transfektsiooni lühikese CDP/DNA, pika CDP/DNA ja viirusliku CDP/DNA kompleksiga endosomolüütilise aine glütserooli juuresolekul. Siin kasutasime komplekse, mis moodustati järgmiste kandja / DNA laengu suhetega: 9/1, 12/1. Eksperimentaalsete kontrollidena toimisid puutumata DNA molekul, PEI/DNA 1/8 kompleksid ning DNA-d ja CP-peptiidi sisaldavad kompleksid. Markergeeni kohaletoimetamise efektiivsus lühikese CDP, pika CDP ja viirusliku CDP kandjate poolt oli 10 korda kõrgem kui kontroll-CP oma.
Joonisel fig 2 ja fig 3 olevad tulemused toetavad käesoleva leiutise kandjate spetsiifilisust CXCR4 retseptori suhtes.
Joonisel 4 on näidatud lutsiferaasi aktiivsuse sõltuvus CHO (CXCR4-) rakkudes pärast transfektsiooni lühikese CDP/DNA, pika CDP/DNA ja viirusliku CDP/DNA kompleksiga endosomolüütilise aine glütserooli juuresolekul. Kasutati järgmiste kandja/DNA laengu suhetega moodustunud komplekse: 9/1, 12/1. Eksperimentaalsete kontrollidena toimisid puutumata DNA molekul, PEI/DNA 1/8 kompleksid ning DNA-d ja CP-peptiidi sisaldavad kompleksid. Markergeeni kohaletoimetamise efektiivsus lühikeste CDP, pikkade CDP ja viiruslike CDP kandjate abil oli peaaegu sama kui kontroll-CP kasutamisel.
Signaaliga kandjad ei suuda tagada retseptori ekspressioonita rakkudes oluliselt kõrgemat geneetilise materjali kohaletoimetamise taset võrreldes kontrolliga.
Leiutise teostust saab selgitada järgmiselt. Käesoleva leiutise eesmärgiks on pakkuda geneetiliste konstruktsioonide sihipärast kohaletoimetamist rakkudesse, mis ekspresseerivad CXCR4 retseptorit, kasutades geneetilise materjali kandjaid, mis sisaldavad selle retseptori signaaljärjestusi.
Esimeses etapis moodustatakse kandja ühe teostuse kompleksid "huvigeeni" sisaldava geneetilise konstruktiga. Moodustunud komplekse kasutatakse geneetilise materjali viimiseks sobivatesse sihtrakkudesse. Rakkude läbitungimise efektiivsuse analüüsi hinnatakse ensümaatiliste või immunohistokeemiliste meetoditega.
Komplekside moodustumine toimub isotoonilises lahuses. Eelistatud on soolavaba puhver HBM (Hepes-puhverdatud mannitool). Saadud komplekside suurus on 170–230 nm.
Geneetilised konstruktsioonid ühes plasmiidset DNA-d kasutavas teostuses.
Plasmiidne DNA sisaldab markerit (luc, lacZ) või terapeutilist geeni (olenevalt haigusest), mis on vastavate promootorite ja võimendajate (CMV, SV40 jne) kontrolli all ning muid elemente, mis on vajalikud näiteks peremeesorganismis replikatsiooniks. rakk või integratsioon genoomi. Vähi geeniteraapias saab kasutada HLA-B7, IL-2, IL-4, TNF, IFN, P53, tümidiini kinaasi jt geene.
Järgmises teostuses kasutatakse oligonukleotiide, mis koosnevad väikesest DNA-st või RNA-st, mis on komplementaarne mRNA või selle prekursori spetsiifilise järjestusega, geneetilise konstruktsioonina, et supresseerida valguprodukti sünteesi või kõrvaldada mRNA-st mutatsiooni kandev ekson. Moodustunud komplekse kasutatakse geneetilise materjali viimiseks rakkudesse, mis ekspresseerivad CXCR4 retseptorit. Käesoleva leiutise kandekomplekside tungimine toimub valdavalt retseptori poolt vahendatud transpordi kaudu, seondudes CXCR4 retseptori rakuväliste domeenidega ja sellele järgneva retseptori internaliseerimisega.
Kandjate ja geneetilise materjali annus määratakse individuaalselt ja see sõltub rakkude tüübist, CXCR4 retseptori kogusest nende pinnal ja nende rakkude transfekteerimise keerukusest.
Nende kandjate efektiivsuse suurendamiseks viiakse rakkude transfektsioon eelistatavalt läbi endosomolüütilise ainega. Nende hulka kuuluvad glütserool, klorokviin jt.Need ained lisatakse transfektsioonikeskkonda vahetult enne komplekside lisamist rakkudesse. Need jäävad kompleksidega sidumata ega mõjuta seetõttu nende struktuuri.
Kandja DNA-d siduva osana võib kasutada peptiide, teisi polümeerseid ühendeid, liposoome, mis on võimelised nukleiinhappeid tihendama. Lisaks võivad neil olla endosomolüütilised omadused (pole vaja kasutada täiendavat endosomolüütilist ainet) ja vajaduse korral (näiteks terapeutiliste või markergeenide kohaletoimetamiseks) viia geneetilist materjali tuuma.
Transfektsioonitingimuste valimisel on need loodud nii, et see tagaks kõrgeima kohaletoimetamise efektiivsuse. Eelistatav on inkubeerida komplekse rakkudega 4 tundi. Seda aega saate aga muuta 3-6 tunni võrra. Pärast inkubatsiooniaja möödumist vahetatakse sööde ja rakud jäetakse 24-48 tunniks (olenevalt rakutüübist ja geneetilisest materjalist) huvipakkuva geeniga sisestatud konstruktide ekspressiooniks või terapeutilise toime avaldumiseks. oligonukleotiididest.
Manustamise efektiivsuse analüüs viiakse läbi ensümaatiliste või immunohistokeemiliste meetoditega, sõltuvalt sisestatud geenikonstruktsiooni tüübist.
Näide 1 DNA/kandja komplekside moodustumine ja komplekseerimisprotsessi uurimine.
PCLUC4 plasmiidi, mis sisaldas tsütomegaloviiruse promootori kontrolli all olevat firefly lutsiferaasi geeni, kasutati geneetilise materjalina geenide sihipäraseks rakkudesse toimetamiseks. Kasutati üht kanduri teostust.
1 μg DNA lahused 40 μl 1X HBM puhvris (5% w/v mannitool, 5 mM Hepes, pH 7,5) ja erinevatele DNA/kandja laengu suhetele vastavad kandjalahused valmistati võrdses mahus puhvris. Kandjalahus lisati järk-järgult Eppendorfi tuubi koos DNA lahusega ja segati intensiivselt 20 sekundit. Saadud segu jäeti 30 minutiks toatemperatuurile, et lõpetada komplekside moodustumine.
Kompleksi moodustumise tulemusi analüüsitakse etiidiumbromiidi väljatõrjumise meetodil. Etiidiumbromiidi fluorestsentsi mõõdetakse Varioscan Flash spektraalse skaneeriva mitmerežiimilise lugejaga (Thermo, Soome). Etiidiumbromiidi nihkumist täheldati 590 nm juures (ergastus lainepikkusel 544 nm) pärast kandja lisamist DNA-le (20 μg/ml), mida oli eelinkubeeritud interkalatsiooniaine etiidiumbromiidiga (400 ng/ml). Nihe arvutati valemiga (F-Ff)/(Fb-Ff), kus Ff ja Fb on etiidiumbromiidi fluorestsentsi intensiivsused vastavalt DNA puudumisel ja juuresolekul.
Näide 2 In vitro transfektsiooni läbiviimine.
HeLa, A172 ja CHO rakud plaaditi 48 süvendiga kultuuriplaatidele (Nunc) 24 tundi enne transfektsiooni tihedusega 50 000 rakku süvendi kohta, mis sisaldas 500 µl standardset kultiveerimissegu, mis koosnes DMEM kultuurisöötmest (GIBCO) ja 10% veise loote seerumist. (GIBCO), 2 mM glutamiini, millele on lisatud penitsilliini (50 U/ml), streptomütsiini (50 µg/ml) ja 1 mM naatriumpüruvaadi. Komplekside suspensioon valmistati vastavalt näites 1 kirjeldatud meetodile kiirusega 2 µg DNA-d kultiveerimisplaadi süvendi kohta. 10 minutit enne DNA/kandja komplekside suspensiooni lisamist pesti rakke mitu korda DMEM-ga ja igasse süvendisse lisati 500 ui söödet, mis sisaldas 15% glütserooli ja 1,5% etanooli. Transfektsioon viidi läbi, lisades söötmele DNA/kandja komplekside suspensiooni. Pärast komplekside valmistamist asetati plaadid rakkudega 4 tunniks termostaati, mille temperatuur oli 37°C ja 5% CO2. Pärast inkubatsiooniaega pesti rakke DMEM söötmega ja igasse süvendisse lisati 500 ui standardset kultuurisegu. Kultuuriplaati inkubeeriti termostaadis temperatuuril 37 °C ja 5% CO2 atmosfääris 48 tundi, misjärel tuvastati markergeeni ekspressioon.
Näide 3 Lutsiferaasi geeni ekspressiooni tuvastamine pärast transfektsiooni in vitro.
Sööde eemaldati kultiveerimisplaatidelt, rakke pesti 1x PBS-s (pH 7,2). Igasse süvendisse lisati 80 µl lüüsipuhvrit (25 M Gly-Gly, 15 mM MgS04, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF; pH 7,8). 50 μl lüsaati kanti lutsiferaasi aktiivsuse mõõtmiseks läbipaistmatute seintega polüstüreenplaatidele. Mõõtmine viidi läbi spektraalse skaneerimisega mitmerežiimilise lugejaga Varioscan Flash (Thermo, Soome). Mõõtmiseks kasutati lutsiferaasi kiirsegu lahust (20 mM tritsiin, 1,07 mM (MgCO 3) 4 Mg(OH) 2 × 5 H2O, 2,67 mM MgSO 4, 0 1 mM EDTA, 33,3 mM DTT, 530 μM ATP , 270 μM atsetüülkoensüüm A, 470 μM lutsiferiin). Iga mõõtmine viidi läbi 10 sekundit. Instrumendi näidud saadi suhtelistes valgusühikutes (RLU). Katse tulemusi hinnati suhtelistes valgusühikutes 1 mg rakuekstraktide koguvalgu kohta kultiveerimisplaadi süvendis. Valgu üldkogust igas süvendis mõõdeti valguanalüüsi komplekti (Bio-Rad) abil veise seerumi albumiini standardkõvera suhtes. Tulemused on toodud joonistel 2, 3, 4.
Geenide otsese sisestamise viisid rakku
Geeni otsene sisestamine rakku toimub mitmel viisil:
Transfektsioon
mikrosüst
elektroporatsioon
Minirakkude meetod
Pakend liposoomidesse
elektronpüstol
Kell transfektsioon DNA adsorbeeritakse kaltsiumfosfaadi kristallidele (Graham van der Eb, 1973). Moodustuvad kaltsiumi sademe osakesed. Neid omastab rakk fagotsütoosi teel.
Transformatsiooni efektiivsuse suurendamiseks lisatakse spetsiifilisele DNA-le, mis sisaldab geeni, mille jaoks selektsioon tehakse, mittespetsiifiline kandja-DNA. Tavaliselt võetakse selleks DNA vasika harknäärest või lõhe spermast. Osa DNA-st seondub membraaniga ega sisene rakkudesse. DNA-d aktsepteerib 15–90% rakkudest. Mõni päev pärast manustamist on väike osa rakkudest võimelised ekspresseerima võõraid geene, kuid siis ekspressioonitase langeb ja 10 -3 - 10 -5 rakku läbivad enam-vähem stabiilse transformatsiooni.
Transfektsiooniks kasutatakse ka DNA-d adsorbeerivat polümeeri DEAE-dekstraani. Rakkude sisenemise efekt ja ekspressiooniaeg on kõrged, kuid stabiilse transformatsiooni sagedus on madalam kui kaltsiumi sademe kasutamisel. Transfektsiooni sagedust suurendab glütseroolšokk (4 minutit 15% glütseroolis HEPES-puhvris).
Mis tahes geeni saab rakkudesse sisestada, kui see ligeeritakse eelnevalt kloonitud selektsioonimarkeriga. Täiendavad uuringud on aga näidanud, et ligeerimine väljaspool rakku ei ole vajalik. Rakud, mis absorbeerivad selektiivset geeni, absorbeerivad koos sellega ka muud kaltsiumsademes sisalduvat DNA-d. Seega, kasutades meetodit kaasmuutused, võib kultiveeritud eukarüootsetesse rakkudesse sisestada peaaegu iga kloonitud DNA segmenti, kui see DNA koos selektsioonimarkeriga sisaldub segu koostises kaltsiumi sademe moodustamiseks.
Transfektsiooniks võib kasutada kromosoome või kromosoomide fragmente. Doonorrakud blokeeritakse mitoosi staadiumis. Mitootilised kromosoomid vabanevad osmootse šoki ja homogeniseerimise mõjul. Neid puhastatakse diferentsiaaltsentrifuugimisega. Kromosoomid ladestuvad rakkude pinnale kaltsiumkloriidiga ja mõne tunni pärast töödeldakse neid reagendiga, mis on võimeline membraane perforeerima (näiteks glütserool).
Retsipientrakkude töötlemiseks kasutatakse kromosoomide jämedalt puhastatud preparaate, kuna sel juhul hävivad kromosoomid kõige vähem. Kromosoomide arv 1 raku töötlemiseks on piiratud. Parem on kasutada mitte rohkem kui 20 kromosoomi 1 retsipientraku kohta, kuna suspensioonis olevate kromosoomide kõrge kontsentratsiooni korral need aglutineeruvad. Retsipientrakk sisaldab doonorkromosoomide fragmente, mida saab integreerida genoomi ja mis võivad iseseisvalt paljuneda. Sisestatud fragmentides on sageli täheldatud deletsioone.
Mitte kõik rakud ei ole võimelised genoomset DNA-d suure sagedusega transformeerima. Inimese fibroblastid sisaldavad tõhusalt plasmiidset DNA-d ja peaaegu üldse mitte genoomset DNA-d.
DNA mikroinjektsioon imetajarakkudesse sai võimalikuks 0,1-0,5 mikronise läbimõõduga mikropipettide valmistamise seadme ja mikromanipulaatori tulekuga (joonis 45). Seega süstiti TK - rakkudesse herpesviiruse fragmenti koos tümidiini kinaasi (TK) geeniga ja pBR322 plasmiidi sisaldavad plasmiidid ning näidati, et TK - geen tungis tuumadesse ja paljuneb neis normaalselt. Mikroinjektsioonimeetodi DNA sisestamiseks töötasid välja 1970. aastate alguses Anderson ja Diakoumakos. Põhimõtteliselt saab hea aparatuuriga 1 tunniga süstida 500-1000 rakku ning parimates katsetes täheldatakse süstitud geenide stabiilset integreerumist ja ekspressiooni 50% rakkudest. Kirjeldatud meetodi eeliseks on ka see, et see võimaldab sisestada mis tahes DNA-d mis tahes rakkudesse ning sisestatud geeni säilitamiseks rakkudes pole vaja selektiivset survet.
Riis. 45. DNA sisestamine mikrosüstiga
elektroporatsioon põhineb asjaolul, et kõrgepingeimpulsid suurendavad pöörduvalt biomembraanide läbilaskvust. Elektroporatsiooni söötmele lisatakse rakud ja DNA fragmendid, mis tuleb rakkudesse viia (joonis 46). Kõrgepingeimpulsse (pinge 200 - 350 V, impulsi kestus 54 ms) lastakse läbi söötme, mille tulemusena tekivad tsütoplasmaatilises membraanis poorid (elektriline lagunemine), mille eluiga ja suurus on piisav makromolekulide nagu DNA jaoks. osmootsete jõudude toimel väliskeskkonnast rakku siseneda. Samal ajal suureneb raku maht.
Elektrivälja tugevus ja selle toime kestus, transformeeriva DNA ja retsipientrakkude kontsentratsioon iga rakusüsteemi jaoks valitakse eksperimentaalselt, et saavutada ellujäänud rakkude suur DNA omastamise protsent. On näidatud, et optimaalsete elektroporatsioonitingimuste korral võib transformantide arv ulatuda 80%-ni ellujäänud rakkudest.
Elektroporatsioon on pigem füüsikaline kui biokeemiline meetod ja see näib olevat selle laialdase kasutamise põhjus. Arvukad uuringud on näidanud, et elektroporatsiooni saab edukalt kasutada DNA molekulide viimiseks erinevatesse rakutüüpidesse, nagu kultiveeritud loomarakud, algloomad, pärm, bakterid ja taimede protoplastid. Kõrgepingelahenduse elektroporatiivne toime kahekihilisele lipiidmembraanile sõltub ilmselt selle kõverusraadiusest. Seetõttu neelavad väikesed bakterirakud tõhusalt DNA-d palju suurema väljatugevusega (10 kV/cm ja rohkem) kui suured looma- ja taimerakud, mis neelavad tõhusalt DNA-d väljatugevuse 1–2 kV/cm juures.
Elektroporatsioon on kõige lihtsam, tõhusam ja reprodutseeritavam meetod DNA molekulide rakkudesse viimiseks. Kuid kuni viimase ajani kasutati seda meetodit piiratud arvus laborites jadaseadmete - elektroporaatorite - puudumise tõttu. Selliste seadmete ilmumine ja täiustamine lähiaastatel toob kaasa selle lähenemisviisi laialdase kasutamise erinevate rakutüüpide geenitehnoloogias.
Riis. 46. Elektroporatsiooni meetod
"Mini rakud" mis saadakse mitootiliste doonorrakkude blokeerimisel koltsemiidiga. Rakkude pikaajalisel töötlemisel koltsemiidiga moodustub iga kromosoomi ümber uus tuumamembraan. Tsütokalasiin B-ga töötlemine ja tsentrifuugimine viib minirakkude moodustumiseni, mis on tsütoplasma membraani kapseldatud mikrotuumad.
Saadud minirakud on väga tundlikud erinevatele mõjudele, seetõttu valitakse sulandamiseks spetsiaalsed kerged tingimused. Meetod on raske, kapriisne, efektiivsus madal - 10 -6 - 10 -7.
Pakend liposoomidesse kasutatakse eksogeense geneetilise materjali kaitsmiseks restriktaaside hävitava toime eest.
Liposoomid on sfäärilised kestad, mis koosnevad fosfolipiididest. Need saadakse vesilahuse ja lipiidide segu järsul loksutamisel või fosfolipiidide vesiemulsioonide ultraheliga töötlemisel. DNA viimiseks looma- ja taimerakkudesse sobivad kõige paremini fosfatidüülseriinist ja kolesteroolist koosnevad liposoomid. Liposoomide abiga transpordisüsteemid on rakkudele vähetoksilised.
Bioloogilise ballistika meetod (biolistika) on tänapäeval üks tõhusamaid taimede, eriti üheiduleheliste ümberkujundamise meetodeid.
Meetodi olemus seisneb selles, et väikseimad volframiosakesed, läbimõõduga 0,6-1,2 mikronit, pihustatakse transformatsiooniks vajalikku geenikonstrukti sisaldava vektori DNA-ga. DNA-d kandvad volframiosakesed ladestatakse tsellofaani substraadile ja asetatakse biolistilise püstoli sisse. Kallus või rakususpensioon kantakse agarisöötmega Petri tassile ja asetatakse 10-15 cm kaugusele biolistilise püstoli alla.Rõhk püstolis vähendatakse vaakumpumba abil 0,1 atm-ni. Rõhu vabanemise hetkel väljutatakse biolistilisest püstolist suure kiirusega volframiosakesed, mis rakuseinu rebides satuvad tsütoplasmasse ja rakkude tuuma.
Tavaliselt surevad otse keskel asuvad rakud volframiosakeste tohutu hulga ja rõhu tõttu, samas kui kõige edukamalt protransformeerunud rakud asuvad tsoonis 0,6-1 cm kaugusel keskusest. Järgmisena kantakse rakud edasiseks kultiveerimiseks ja regenereerimiseks ettevaatlikult söötmesse.
Üheidulehelisi taimi, nagu mais, riis, nisu ja oder, muudeti biolistliku püstoliga. Sel juhul saadi stabiilsed transformanttaimed. Lisaks edule transgeensete üheiduiduliste saamisel kasutatakse biolistlikku transformatsiooni DNA otseseks ülekandmiseks embrüogeensesse õietolmu ja edasiseks kiireks transgeensete dihaploidsete taimede tootmiseks, mis on aretustöös oluline samm. Praegu on tubakataimed selle meetodiga transformeeritud ja pärast haploidsete taimede regenereerimist on saadud stabiilsed transformandid.
8860 0
Praegu on teada umbes 40 erinevat rekombinantse DNA rakkudesse viimise meetodit, mis lahendavad plasmamembraani läbimise probleemi erineval viisil. Seni puudub rekombinantse DNA rakkudesse viimise meetodite ühtne klassifikatsioon. Iga arvustuste autor klassifitseerib omal moel, võib-olla seetõttu, et paljude empiiriliselt leitud meetodite puhul pole membraani ületamise mehhanism ikka veel selge, näiteks transformatsiooniks. Ebakindlust on ka terminoloogiaga, mis kiiresti areneva uue teadus- ja praktikavaldkonna puhul pole üllatav.
Igal meetodil võõr-DNA rakkudesse toimetamiseks on oma omadused, eelised ja puudused rakkude ellujäämise, manustamise tõhususe, mitmekülgsuse ja tehniliste rakendusvõimaluste osas. Meetodi valik sõltub peremeesrakkude tüübist ja kasutatava vektori tüübist, samuti eksperimenteerija isiklikest eelistustest ja võimalustest. Allpool käsitletakse üksikasjalikult mõningaid kõige tuntumaid DNA sihtrakkudesse viimise meetodeid.
Transformatsioon selle kõige üldisemas tähenduses on vaba DNA rakku viimise protsess. Kitsamas tähenduses kasutatakse seda terminit peamiselt seoses bakteritega, mis tähistab rekombinantse DNA imendumise protsessi kompetentsete rakkude poolt, mis on indutseeritud rakumembraani temperatuurifaasi üleminekuga. E. coli on rekombinantse DNA-ga töötamisel kõige levinum organism ning plasmiidse DNA rakkudesse viimise tagamiseks hoitakse rakke jääkülma CaCl2 ja DNA lahusega ning seejärel allutatakse 42 °C kuumašokile. ~1 min.
Ilmselt toimub sellise ravi tulemusena rakuseina lokaalne hävimine. Transformatsiooni efektiivsus, mis on määratletud kui transformantide arv 1 µg lisatud DNA kohta,
samas kui see on ligikaudu 10000–10000000. Selle meetodi efektiivsus on madal, transformeeritakse ligikaudu vähem kui 0,1% rakkudest, kuid see puudus kompenseeritakse selektsiooniskeemide kasutamisega, mis võimaldavad teil soovitud kloonid kiiresti tuvastada.
Rakke, mis on võimelised absorbeerima võõr-DNA-d, nimetatakse kompetentseteks. Nende rakkude osakaal populatsioonis on tavaliselt väga väike, kuid seda saab suurendada spetsiaalse toitekeskkonna, kultiveerimistingimuste ja keemilise pädevuse indutseerijate abil (valitud reeglina empiiriliselt). Pädevate rakkude valmistamisel sageli kasutatav etapp on sferoplastide tootmine – rakud, millel on osaliselt või täielikult (protoplastid), millel puudub välimine jäik rakuseina.
Näiteks on see ainus viis, kuidas tõhusalt transformeerida paljusid grampositiivseid baktereid perekondadest Bacillus, Listeria, Streptommyces jne. Mõned pärmi transformatsioonimeetodid hõlmavad ka pärmi rakuseina ensümaatilise eemaldamise etappe glükosidaaside abil. Organismide jaoks, mis on resistentsed keemiliste indutseerijate suhtes või millel puudub loomulik pädevus, kasutatakse muid DNA kohaletoimetamise süsteeme.
Konjugatsioon. On olemas bakteriaalsed plasmiidid (konjugatiivsed plasmiidid), millel on võime luua rakkudevahelisi kontakte, mille kaudu nad liiguvad ühest rakust teise. Kontaktide tekkimise doonor- ja retsipientrakkude vahel tagavad plasmiidide konjugatiivsed omadused ning DNA ülekande enda mobilisatsiooniomadused. Sel juhul võib konjugatiivne plasmiid kanda tavalist plasmiidvektorit, mis asub samas rakus.
Seega on võimalik muul viisil transformeerida retsipientrakke, mida on raske muundada. Näiteks on näidatud laia peremeesorganismi leviala süstikvektori pAT187 mobilisatsiooni ülekandmist E. coli-st erinevatele grampositiivsetele bakteritele (perekonnad Bacillus, Enterococcus, Staphylococcus jne), kuigi palju väiksema efektiivsusega kui ülekandel erinevate vahel. E. coli tüved.
Lisaks on hiljuti demonstreeritud DNA konjugatiivse ülekandmise võimalust bakterirakkudest kultiveeritud loomarakkudesse. Konjugeerimise käigus kantakse üle ainult üks doonorplasmiidi ahel, millel seejärel sünteesitakse teine ahel. Selle tulemuseks on see, et peremeesrestriktsiooniensüümid ei rünnata konjugatiivselt ülekantud plasmiidi. Selle meetodi efektiivsus bakterite puhul on võrreldav transformatsiooni omaga.
Viirusnakkus. Viirustel põhinevate vektorite sisestamiseks kasutatakse laialdaselt peremeesraku loomulikku nakkusteed, mis sõltuvad viiruse tüübist.
perforatsiooni meetodid. Üks populaarsemaid meetodeid nukleiinhapete sihtrakkudesse viimiseks on elektroporatsioon – ajutine pooride loomine lipiidide kahekihilises membraanis lühiajalisel kokkupuutel elektriväljaga. See on universaalne füüsiline transformatsioonimeetod, mille tehnika on välja töötatud peaaegu igat tüüpi raku jaoks.
E. coli-ga töötamisel asetatakse valmistatud rakususpensioon (~50 µl) ja DNA elektroodide vahele ning rakendatakse üks vooluimpulss kestusega ~4,5 ms pingel 1,8 kV, elektroodide vaheline kaugus on 1 mm. Pärast sellist töötlemist tõuseb transformatsiooni efektiivsus väikeste plasmiidide (~3-6 kb) puhul 109-1011-ni ja suurte (~135 kb) puhul kuni 106-ni. Sarnaseid tingimusi kasutatakse BAC vektori sisestamiseks E. colisse.
Kõrgepingelahenduse elektroporatiivne toime kahekihilisele lipiidmembraanile sõltub ilmselt selle kõverusraadiusest. Seetõttu neelavad väikesed bakterirakud tõhusalt DNA-d palju suurema väljatugevusega (12–18 kV/cm) kui suured looma- ja taimerakud, mis neelavad tõhusalt DNA-d väljatugevuse 1–2 kV/cm juures. Elektroporatsioon on kõige lihtsam, tõhusam ja reprodutseeritav meetod DNA molekulide viimiseks rakkudesse, mis aga nõuab spetsiaalset elektroporaatorit.
Muud perforatsioonimeetodid DNA viimiseks rakku: rakkude töötlemine ultraheliga, rakkude kraapimine substraadilt eksogeense materjali juuresolekul, rakkude tsentrifuugimine söötmes DNA-ga koos elektroporatsiooniga, plasmamembraani osmootne perforatsioon, rakusond laser-mikrokiirega, poore moodustava streptolüsiin-O toksiini kasutamine.
Transfektsioon. Algselt tähendas see termin viiruse DNA viimist rakkudesse, nüüd on selle tähendus laienenud ja tähendab mis tahes võõr-DNA viimist eukarüootsetesse rakkudesse. Termin "transformatsioon", mis tähistab prokarüootide ja pärmseente jaoks DNA rakku sisestamise protsessi, osutus ebamugavaks, kuna loomarakkude puhul on transformatsioon normaalsete rakkude muundumine vähirakkudeks. Kitsas tähenduses mõistetakse transfektsiooni üldiselt kui DNA sisestamist eukarüootsetesse rakkudesse, kasutades erinevaid keemilisi reagente.
Üks esimesi tõhusaks transfektsiooniks välja töötatud meetodeid oli DNA inkubeerimine DEAE-dekstraaniga. Saadud efektiivsus oli võrreldav bakterite transformatsiooniga ja saavutas 106 transfektanti µg DNA kohta.
DEAE-dekstraani toimemehhanism ei ole täielikult kindlaks tehtud, kuid on teada, et see seondub DNA-ga ja rakumembraaniga, stimuleerides pinotsütoosi (joonis 2.8), kuigi rakud seda ise ei omasta. Meetodi puudused hõlmavad DEAE-dekstraani toksilisust teatud tüüpi rakkudele, efektiivsuse sõltuvust preparaadi kvaliteedist ja stabiilsete transfektantide saamise väga madalat sagedust.
Riis. 2.8. DNA sisestamise skeem erinevate komplekside osana rakku endotsütoosi teel: fagotsütoos ja pinotsütoos (a). Mittelipiidsest polükatioonist pärineva osakese skemaatiline esitus seotud DNA-ga dendrovormis, mille negatiivse laengu kompenseerib katioonne polümeer (b)
Transfektsiooni efektiivsust suurendas 10-100 korda rakkude inkubeerimine kaltsiumfosfaadiga sadestatud DNA-ga. DNA kaltsiumsademe tihedad osakesed imenduvad rakus fagotsütoosi teel (joonis 2.8), kuid ainult väike osa läbistavatest molekulidest jõuab tuuma ja integreerub kromosomaalsesse DNA-sse. Kaltsiumfosfaadi meetod on tõhusam ja odavam, kuid põhjustab DNA molekulide purunemist, mis muudab ringikujulised molekulid lineaarseks, viiruste transfektsiooni korral mõnikord mittenakkuslikuks. Lisaks tuleb kaltsiumfosfaadiga transfektsiooni tingimused valida iga sihtraku jaoks eraldi.
Teiste transfektsioonireaktiivide otsimisel leiti, et liigset katioonset laengut kandvad polümeeri molekulid võivad oluliselt tõsta transfektsiooni efektiivsust. Polümeersed katioonid moodustavad nukleiinhapetega stabiilseid neutraliseeritud laengutega komplekse, mis suudavad suure efektiivsusega transportida DNA-d ja RNA-d rakku, kaitstes teel tuuma endonukleaaside toime eest (joonis 2.9).
Riis. 2. 9. DNA transpordi skeem raku tuuma polükatiooni-DNA kompleksi osana, mis on seotud ligandi vahendatud endotsütoosiga spetsiifilise ligandiga
Lineaarse või hargnenud konformatsiooniga (dendriitne vorm) sünteetilised mittelipiidsed polümeersed katioonid võivad kondenseerida DNA ja RNA suhteliselt väikesteks osakesteks, mis seejärel seonduvad rakumembraaniga ja sisenevad rakku mittespetsiifilise endotsütoosi teel. Praegu kasutatakse transfektsiooniks mittelipiidsete polükatioonide, peamiselt polüetüleenimiini, polüamidoamiinide ja nendel põhinevate dendrimeeride rühmast, katioonseid valke nagu polülüsiin, protamiin ja histoonid, aga ka mitmesuguseid kaubanduslikke tooteid, nagu PAMAM.
Revolutsiooniks oli Feigneri (Feigner, 1987) jt sünteesitud esimese madala toksilise katioonse lipiidi DOTMA (1,2-dioleüül-3-N,N,N-trimetüülaminopropaan) kasutuselevõtt praktikas. Transfektsiooni efektiivsus katioonse lipiidiga (joonis 2.10) oli ligikaudu 100 korda suurem kui mis tahes muu kemikaaliga, suure osakaaluga stabiilseid transgeenseid rakke.
Riis. Joonis 2. 10. DNA-ga kompleksi struktuur (a) ja katioonse lipiidpolümeeri üldstruktuur (b). Katioonsed lipiidpolümeerid (lineaarsed ja hargnenud), mis on struktuurilt ja omadustelt sarnased rakumembraani fosfolipiididega, moodustavad DNA-ga komplekse mitmekihiliste katioonsete liposoomide kujul (a) reagentide lihtsal segamisel. Sellised kompleksid sisenevad rakku endotsütoosi või lipiidiosa kaudu rakumembraaniga liitumise teel.
Samal ajal võeti praktikas kasutusele uus termin "lipofektsioon", mis rõhutab rakkude geneetilise transformatsiooni kõrget efektiivsust, tuues lipiid-katioonsed kompleksid lähemale nakkusohtlikele viirusosakestele.
Sellele edule tuginedes on nende ühendite (lipofektiin, lipofektamiin, tsellufektiin jne) välja töötatud arvukalt variatsioone.
Paralleelselt töötati välja DNA või RNA-ga täidetud fosfolipiidide liposoomidel põhinevad kohaletoimetamisvahendid.
Tehismembraanide väikesed sfäärid võivad sulanduda rakkude plasmamembraanidega või sattuda endotsütoosi teel, vabastades sisu rakku. Liposomaalse transfektsiooni madalat efektiivsust suurendas fosfolipiidide, näiteks kardiolipiini ja fosfatidüületanoolamiini viimine liposoomide struktuuri, mis koos kahekihiliste membraanidega moodustavad ka ümberpööratud mitsellaarstruktuure, mida nimetatakse kuup- ja kuusnurkseteks faasideks ja mis on võimelised initsieerima membraani. sulandumine.
Liposomaalne meetod on üsna kapriisne ja nõuab konkreetsete rakkude tõhusaks transfektsiooniks kõigi tingimuste hoolikat valimist. Lisaks kahjustab kapseldamise protseduur, tavaliselt ultrahelitöötlus, sageli suuri DNA molekule.
Transfektsioonireaktiivide väljatöötamise uueks etapiks on olnud nukleiinhapete efektiivsema ja sihipärasema kohaletoimetamise väljatöötamine spetsiifilistesse sihtrakkudesse, viies sünteetiliste transfektsioonireaktiivide ja liposoomide struktuuri membraani retseptorvalkudega seondumiseks erinevaid ligande. Selliste rakuliste retseptorite poolt äratuntavate sihtrühmade (ligandide) olemasolu võimaldab kasutada ligandi vahendatud endotsütoosi mehhanisme (vt joonis 2.9).
Selliste ligandidena kasutatakse retseptorite poolt äratuntavaid valke ja peptiide; oligosahhariidid, kuna paljude loomarakkude pinnal on lektiinid - retseptorvalgud, mis neid spetsiifiliselt seovad; polüsahhariidid. Selliste sihitud DNA (RNA) transfektsioonireagendi komplekside rakkudega suhtlemise protsessid on sarnased viirusosakeste tungimisega rakku.
Praegu pakuvad biotehnoloogiaettevõtted laias valikus erinevaid transfektsioonireagente – kõige lihtsamatest ja odavamatest kuni uusimate arendusteni, mis on spetsialiseerunud erinevatele rakutüüpidele ja ülesannetele. Samuti jätkub intensiivselt uute, veelgi tõhusamate transfektsioonireaktiivide loomine.
Mikroinjektsioon - mikronõelaga läbistatakse rakumembraan ja DNA-d sisaldav lahus süstitakse raku tsütoplasmasse või siis otse tuuma, kui tuum on piisavalt suur (näiteks munaraku tuum). DNA mikrosüstimine imetajarakkudesse sai võimalikuks 0,1-0,5 mikronise läbimõõduga mikropipettide valmistamise seadme ja mikromanipulaatori tulekuga. Meetod on väga tõhus, stabiilse integratsiooni ja süstitud geenide ekspressiooniga rakkude osakaal võib ulatuda 50%-ni. Kirjeldatud meetodi eeliseks on ka see, et see võimaldab sisestada mis tahes DNA-d mis tahes rakkudesse ning sisestatud geeni säilitamiseks rakkudes pole vaja selektiivset survet.
Ballistiline transfektsioon, bioballistika või biolistika (mikroosakeste pommitamine) põhineb rakkude pommitamisel umbes 1-2 mikroni suuruste mikrosfääridega, mis on kaetud DNA-ga. Kasutatakse kulla, volframi (mõnikord fütotoksilise), silikooni ja erinevate sünteetiliste nanosfääride mikroosakesi. DNA-ga kaetud mikroosakesed läbivad rakukihte ja kannavad geneetilise konstruktsiooni otse raku organellidesse ja tuumadesse. Sel eesmärgil loodud „geenipüstol“ (geenipüstol) ehk „geenipüstol“, mille J. Sanford töötas välja 1987. aastal DNA viimiseks teraviljadesse, on oma konstruktsioonilt sarnane pneumaatiliste relvadega (joonis 2.11). .
Riis. 2.11. Rekombinantse DNA sisestamine taimelehtedesse, kasutades Bio-Rad korduvkasutatavat geenipüstoli (a) ja selle üldist skeemi (b). Heeliumiimpulss väljutab proovikapslist DNA või RNA-ga kaetud mikroosakesed. DNA-d kandvaid mikroosakesi kiirendatakse ja fokusseeritakse maksimaalseks tungimiseks rakkudesse, liikudes piki kiirenduskanalit ja piki püstoli toru, samal ajal kui laia väljapääsu juures hajub heeliumivool difuusselt külgedele. Filtri vaherõngas hoiab sihtmärgi tabamiseks optimaalset kaugust maksimaalse heeliumi eemaldamisega, et minimeerida kahjustavat mõju raku pinnale.
Mikroosakeste läbitungimissügavus on reeglina väike - kuni 1 mm, kuid kestade eemaldamise eritingimustes võivad mikroosakesed tungida kudedesse 4-5 mm sügavusele ja kanda geene näiteks vöötlihaskiududesse. Ballistiline transfektsioon on väga tõhus isegi siis, kui paksud rakuseinad (pärm, taimed) takistavad paljudel muudel manustamisviisidel ning seda rakendatakse kudedele, organitele ja isegi tervetele organismidele. Praegu kasutatakse seda laialdaselt geeniteraapias transgeensete loomade ja taimede saamiseks.
Transfektsiooni vahendite ja meetodite mitmekesisus on tingitud erinevatest ülesannetest, laiast hulgast sihtrakkudest ja rakkudesse toimetatud nukleiinhapete tüüpidest, aga ka ühiskonna vajadusest hankida üha tõhusamaid vahendeid geneetilise informatsiooni rakkudesse toimetamiseks. , kuded ja terved organismid. Erilist tähelepanu pööratakse transfektsioonireaktiivide ja -meetodite väljatöötamisele seoses inimese geeniteraapia silmatorkavate väljavaadetega, mis nõuavad sihipäraseid, ülitõhusaid ja ohutuid geenide kohaletoimetamise vahendeid.
Võõra DNA stabiilne ja mööduv sisenemine rakku. Pärast rekombinantse DNA sisestamist eukarüootsesse rakku jõuab ainult väike osa sellest tuuma, kuna tuumamembraan on võõrale DNA-le tohutu barjäär. Tuumas võib rekombinantne DNA olla integreeritud kromosoomi või eksisteerida mõnda aega kromosoomivälises olekus.
Sellest lähtuvalt eristatakse stabiilset transfektsiooni, mil rekombinantne DNA integreerub retsipientrakkude kromosoomidesse ja muutub nende lahutamatuks osaks, ning ajutist või mööduvat transfektsiooni, mille käigus eksisteerivad rekombinantsed DNA molekulid ja transkribeeritakse tuumadesse kromosoomivälises rakkudes. seista lühikeseks ajaks. Sisestatud võõr-DNA stabiilne pärand on peamine tingimus transgeensete organismide majanduslikel eesmärkidel saamiseks.
Seetõttu pööratakse erilist tähelepanu DNA rakkudesse viimise meetodite väljatöötamisele, mis toob kaasa suurema osa stabiilsete transformantide tootmise. Lisaks võimaldab suur protsent stabiilseid transformante loobuda selektiiv- ja markergeenidest, mis on transgeensete organismide loomisel ballastiks.
ON. Voinov, T.G. Volova
Paljud uuringud näitavad, et erinevate viiruste kasutamine on väga tõhus lahendus, mis võimaldab läbida organismi immuunkaitse ja seejärel nakatada rakke, kasutades neid viiruse levitamiseks. Selle protseduuri läbiviimiseks valisid geenitehnoloogid retroviiruste ja adenoviiruste rühmast välja sobivaimad viirused. Retroviirused toovad geneetilist teavet ribonukleiinhappe (RNA) kujul, mis on DNA-laadne molekul, mis aitab töödelda DNA-sse salvestatud geneetilist teavet. Niipea, kui on võimalik tungida sügavale nn sihtrakku, saadakse RNA molekulist DNA molekuli koopia. Seda protsessi nimetatakse pöördtranskriptsiooniks. Kui uus DNA molekul on rakule kinnitatud, sisaldavad kõik raku uued koopiad seda modifitseeritud geeni.
Adenoviirused kannavad geneetilist teavet koheselt DNA kujul, mis toimetatakse mittejagunevasse rakku. Kuigi need viirused viivad DNA otse sihtraku tuuma DNA ei sobitu raku genoomi. Seega ei kandu modifitseeritud geen ja geneetiline informatsioon edasi tütarrakkudele. Adenoviirustega läbiviidava geeniteraapia eeliseks on see, et geenid on võimalik viia närvisüsteemi rakkudesse ja hingamisteede limaskestale, taaskord vektori abil. Lisaks on veel kolmas geeniteraapia meetod, mis viiakse läbi nn adeno-assotsieerunud viiruste kaudu. Need viirused sisaldavad suhteliselt väike kogus geneetilist teavet ja neid on palju raskem eemaldada kui retroviiruseid ja adenoviiruseid. Adeno-assotsieerunud viiruste eeliseks on aga see, et nad ei põhjusta inimese immuunsüsteemi reaktsiooni.
Antropogeneetika genealoogiline meetod
Selle meetodi aluseks on sugupuude koostamine ja analüüs. Seda meetodit kasutatakse laialdaselt iidsetest aegadest tänapäevani hobusekasvatuses, veiste ja sigade väärtuslike liinide valikul, tõukoerte hankimisel, aga ka uute karusloomatõugude aretamisel.
Inimese geneetika uurimise meetodina hakati genealoogilist meetodit kasutama alles 20. sajandi algusest, kui selgus, et sugupuude analüüs, milles mõne tunnuse (haiguse) edasikandumine põlvest põlve saab asendada. hübridoloogilisel meetodil, mis tegelikult pole inimestele rakendatav.
Tõupuude koostamisel on allikaks inimene - proband, kelle sugupuud uuritakse. Tavaliselt on see kas patsient või teatud tunnuse kandja, mille pärilikkust tuleb uurida. Genealoogiliste tabelite koostamisel kasutatakse G. Yusti poolt 1931. aastal välja pakutud sümboleid (joon. 6.24). Põlvkondi tähistatakse rooma numbritega, antud põlvkonna üksikisikuid tähistatakse araabia numbritega.
Genealoogilise meetodi abil saab kindlaks teha uuritava tunnuse päriliku tinglikkuse, samuti selle pärilikkuse tüübi (autosoomne dominantne, autosoomne retsessiivne, X-seotud dominantne või retsessiivne, Y-seotud). Mitme tunnuse sugupuude analüüsimisel võib ilmneda nende pärilikkuse seos, mida kasutatakse kromosoomikaartide koostamisel. See meetod võimaldab uurida mutatsiooniprotsessi intensiivsust, hinnata alleeli ekspressiivsust ja läbitungimist. Seda kasutatakse laialdaselt meditsiinilises geneetilises nõustamises järglaste ennustamiseks. Siiski tuleb märkida, et sugupuu analüüs muutub palju keerulisemaks, kui peredes on vähe lapsi.