nukleotiidid- Nukleosiidide fosforhappe estrid, nukleosiidfosfaadid. Vabad nukleotiidid, eriti ATP, cAMP, ADP, mängivad olulist rolli energia- ja informatsioonilistes rakusiseses protsessis ning on ka nukleiinhapete ja paljude koensüümide koostisosad.
Kahest nukleotiidmolekulist koosnevaid ühendeid nimetatakse dinukleotiidid, kolmest trinukleotiidid, väikesest arvust - oligonukleotiidid, ja paljudest polünukleotiidid või nukleiinhapped.
morfolino(Inglise) Morpholino) on sünteetilised oligonukleotiidid, mida kasutatakse molekulaarbioloogias geeniekspressiooni muutmiseks. Antisenss-oligomeerseid morfolinosid kasutatakse selleks, et blokeerida teiste molekulide juurdepääs spetsiifilistele nukleiinhappejärjestustele. Morfoliinoligonukleotiidid blokeerivad väikesed üheahelalised piirkonnad (umbes 25 nukleotiidi) RNA molekulide pinnal.
Antisenss-oligonukleotiidid on pikad DNA nukleotiidide järjestused kromosoomides. Kui geen tuleb ekspresseerida, siis käivitatakse selle geeni transkriptsiooniprotsess, mille tulemusena sünteesitakse mRNA.
Sünteetiliste antisenss-oligonukleotiidide terapeutiline toime sõltub nende hübridisatsiooni spetsiifilisusest sihtmärk-mRNA ligipääsetava kohaga, resistentsusest raku nukleaaside toime suhtes ja rakku kohaletoimetamissüsteemi olemasolust.
Siiani on genoomi teatud piirkondade aktiivsuse kõige tõhusam sihipärane seiskamine läbi viidud antisenss-oligonukleotiidide (AON) abil. AON-i kasutamise strateegia põhineb DNA molekulide Watson-Cricki interaktsioonil sihtmärk-mRNA-ga. DNA-mRNA heterodupleksi moodustumine viib M-RNA inaktiveerimiseni ja sellele järgneva valgusünteesi lakkamiseni.
Teisisõnu, antisenss-mehhanism viitab oligonukleotiidi seondumisele siht-RNA komplementaarse saidiga ja selle RNA rakusisese funktsiooni pärssimisele.
See lihtne ja atraktiivne teoreetiline mudel osutus aga tegelikkuses palju keerulisemaks. Tuntud on kolme tüüpi antisenss-molekule: suhteliselt lühikesed sünteetilised oligonukleotiidid; antisenss RNA, mida ekspresseeritakse rakus pärast transfektsiooni antisenss ribosüümi geeniga ja millel on katalüütiline aktiivsus.
Antisenss-oligonukleotiididel põhinevate ravimite loomine on ravimiarenduse üks uuemaid suundi. See tehnoloogia annab teadlasele võimaluse vahetult mõjutada peaaegu kõiki rakus toimuvaid protsesse kõrgeima spetsiifilisusega. Kui mingi valk soodustab vähiraku kasvu, siis vastavat antisenss-oligonukleotiidi kasutades saab tagada, et seda valku rakus enam kunagi ei sünteesita. Antisenss-oligonukleotiidid on nii spetsiifilised, et praktiliselt võimatu on mõjutada raku ühtegi teist valku. See spetsiifilisus vähendab traditsiooniliste vähiraviga sageli esinevaid kõrvaltoimeid.
Inaktiveerimise mehhanism pole ikka veel täiesti selge. Kuid võib-olla on see tingitud asjaolust, et kaheahelaline RNA ei ole normaalsetele rakkudele iseloomulik. Kuna iga valgu sünteesi signaal on üksainus mRNA, saab sellise konkreetse valgu signaali sellise komplementaarse järjestuse abil välja lülitada või "välja lüüa".
Joonis 4 Antisenss-oligonukleotiidi toimimismehhanism
Antisenss-oligonukleotiididel põhinevate ravimitega ravimise oluline probleem on selliste ravimite hävitamine rakuensüümide - nukleaaside poolt. Oligodeoksünukleotiide lagundavad nukleaasid, mistõttu on väga oluline kaitsta neid viimaste toime eest, et nad ei kaotaks oma võimet sihtmärgiga hübridiseeruda. Selleks viiakse läbi rakuvalkude elektroforeetiline eraldamine, millesse translatsiooni käigus lisatakse radioaktiivne märgis ja radioautoograafia abil tehakse kindlaks, milliste “antisenss” oligonukleotiidide juuresolekul teatud valgu süntees väheneb. Erinevates RNA transkriptides parimate sihtsaitide valimiseks puuduvad üldised kriteeriumid. Oligonukleotiidid, mis on komplementaarsed 5'- või 3'-konp mRNA-ga, eksoni ja introni piiridega ning isegi kaheahelaliste piirkondadega, võivad olla tõhusad. Oligodeoksünukleotiide lagundavad rakusisesed nukleaasid, seetõttu on oluline kaitsta neid viimaste toime eest, et nad ei kaotaks oma võimet hübridiseeruda sihtmärgiga. Selleks saab pürimidiini aluseid ja desoksüriboosi teatud viisil modifitseerida.
Seega on praegu kõige laialdasemalt kasutatavates "antisenss" oligonukleotiidides fosfodiestersideme vaba hapnikuaatom asendatud sulforühmaga, mille tulemusena moodustub tiofosfaatside. Sel viisil modifitseeritud oligonukleotiidid lahustuvad vees, kannavad negatiivset laengut ja neid ei lõhusta endonukleaasid. Sihtkohaga hübridiseerimisel moodustavad nad RNA-DNA duplekse, mis aktiveerivad ribonukleaasi (RNaasi) H, endogeense ensüümi, mis lõhustab hübriidmolekulis mRNA-d. Selliste oligonukleotiidide, esimese põlvkonna ravimite esimesed kliinilised uuringud on läbi viidud. Sihtmärgid on tsütomegaloviiruse, inimese immuunpuudulikkuse viiruse RNA, samuti vähi, soolehaiguste ja muude haiguste tekke eest vastutavate geenide mRNA.
Sünteesitud "antisenss" oligonukleotiidid fosforamidiidi ja polüamiid (peptiid) sidemetega. Sellised molekulid on nukleaaside toimele väga vastupidavad. Suhkrujäägi 2' süsinikuaatomi ja pürimidiinide C-5 aatomiga seotud keemilised rühmad kaitsevad samuti antisenss-oligonukleotiide ja hõlbustavad nende seondumist sihtkohaga. ). Kõiki nende ja teiste modifikatsioonide eeliseid uuritakse praegu intensiivselt.
Oligonukleotiid on lühike nukleiinhappe tükk, mille pikkus on alla 50 nukleotiidi. Viimase 20 aasta jooksul on tähendus laienenud, hõlmates kõiki keemiliselt sünteesitud nukleiinhappeid, olenemata pikkusest. Esimene publikatsioon oligonukleotiidi sihipärase keemilise sünteesi kohta ilmus 1955. aastal.
Sellest ajast alates on igal aastal sünteesitud miljoneid oligonukleotiide, mida kasutatakse laborites üle maailma. Enamik uuringuid nõuab ainult väikeses koguses DNA-d. Biofüüsikalistes uuringutes (NMR ja röntgenkristallograafia) kasutamiseks on vaja palju suuremaid DNA koguseid (10 µmol või rohkem), nii et nii suurte koguste sünteesi võimaldamiseks on välja töötatud tahkefaasilise sünteesi meetodid, mis võimaldavad oligonukleotiidide kasutamine ravimimolekulidena (näiteks antisenss-oligonukleotiidid).
DNA või RNA oligonukleotiidide süntees viitab määratletud keemilise struktuuri või erineva suurusega järjestustega nukleiinhappefragmentide keemilisele sünteesile.
Joonis 1. Oligonukleotiidide struktuurid.
Tahkefaasilise sünteesi põhimõtte töötas välja ja rakendas polüpeptiidide sünteesil esmakordselt Robert Bruce Merrifield, Ameerika biokeemik, kes sai 1984. aastal Nobeli keemiaauhinna tahkefaasilise peptiidide sünteesi leiutamise eest. Ta mõistis, et eduka sünteesi võti oli esimese monomeeri ankurdamine lahustumatu polümeerse tahke aine külge. Teised monomeerid saab seejärel ühendada ükshaaval kasvava polümeeri liikumatu otsaga. Sünteesi lõpus saab valmis polümeeri ahela lahustumatust polümeerist eraldada ja puhastada. Seda protsessi on aastate jooksul optimeeritud väga tõhusaks ja nüüdseks on sellest saanud automatiseeritud oligonukleotiidide süntesaatorites kasutatav põhitehnika.
Oligonukleotiidide eduka sünteesi tagamiseks on vajalikud järgmised tingimused:
- Kõik reaktiivid peavad olema mittevesilahustes lahustuvad.
- Nukleotiidaluste ja süsivesikute jääkide amino- ja hüdroksüülrühmad peavad olema sobivalt blokeeritud.
- Sünteesi käigus sisestatud kaitserühmad peavad olema stabiilsed ahela pikenemise tingimustes nukleotiididevahelise fosfodiestersideme moodustumisel.
- Kaitserühmad peavad olema piisavalt labiilsed, et neid saaks sünteesi lõpus eemaldada reaktsioonisaadusi kahjustamata.
Oligonukleotiidide funktsioonid ja nende kasutamise väljavaated
Praegu kasutatakse oligonukleotiide ja nende analooge laialdaselt erinevates valdkondades, nagu meditsiin ja molekulaarbioloogilised uuringud, ning neid peetakse ka paljulubavateks terapeutilisteks aineteks ja sondideks molekulaardiagnostikas.
Viimase 20 aasta jooksul on suhteliselt hästi uuritud ainult kahte tüüpi formaalselt elektriliselt neutraalse karkassiga nukleiinhappeanalooge, peptiidnukleiinhappeid ja fosfodiamiidmorfolino-oligonukleotiide. Mõlemat tüüpi analoogid on võimelised komplementaarselt seonduma looduslike DNA ja RNA molekulidega ning seetõttu on need potentsiaalsete ravimitena leidnud rakendust nii molekulaarbioloogias kui ka eriti meditsiinis.
Lisaks sai DNA tehnoloogiate arenedes võimalikuks teadaolevate geenide ekspressiooni uurimine, erinevate organismide genoomide mutatsioonide määramine ning mitmete nakkushaiguste diagnoosimine. Nende probleemide lahendamisel on kõige lootustandvam kasutada DNA kiipe, mis on väikesed plaadid, mille pinnale on ladestunud DNA fragmendid.
DNA kiipide loomise meetod ühendab meetodeid, mis põhinevad oligonukleotiidide sihipärasel sünteesil otse kiibi pinnal. Süntees viiakse läbi 5'-otsas labiilset kaitserühma sisaldavate nukleotiidide astmelise lisamisega kasvavale oligonukleotiidahelale, mille eemaldamine on võimalik valguskiirguse, elektripinge või happelise hüdrolüüsi mõjul.
Samuti on näidatud, et olenevalt valitud sihtgeenist on geeni sihtmärgiga oligonukleotiididel kasvajakudedele palju moduleerivat toimet, alates kasvajarakkude proliferatsiooni aeglustamisest ja peatamisest kuni nende invasiivsete omaduste allasurumiseni.
Nukleiinhapetel põhinevad vähivastased ravimid on väga spetsiifiline vahend geeniekspressiooni moduleerimiseks. Neoplastilise transformatsiooni käigus ebanormaalselt üleekspresseeritud geenide supressiooni saab saavutada nukleiinhappepõhiste ravimitega, nagu antisenss-oligonukleotiidid (asON-id). Üldiselt seisneb geeniekspressiooni pärssimise mehhanism nende komplementaarses seondumises sihtmärk-mRNA-ga, mille järel sihtmärk-mRNA kas lõhustatakse või selle translatsiooniprotsess blokeeritakse.
asON on sünteetilised üheahelalised DNA-d pikkusega 15-20 nukleotiidi. Hiljuti on saadud asON-e, mis võivad takistada splaissitud mRNA transporti tuumast tsütoplasmasse, samuti asON-e, mis pre-mRNA splaissimiskoha blokeerimise tulemusena võivad viia splaissitud mRNA ekspressioonini. alternatiivne valgu variant.
Tulenevalt asjaolust, et looduslikud oligodesoksüribonukleotiidid rakukultuuris ja in vivo tingimustes lagunevad nukleaaside toimel kiiresti, viiakse asON struktuuri sisse erinevaid keemilisi modifikatsioone, et suurendada nende stabiilsust.
Oligonukleotiidide keemiline süntees
Tahkefaasi sünteesi kasutatakse laialdaselt peptiidide sünteesis, oligonukleotiidide sünteesis, oligosahhariidide sünteesis ja kombinatoorses keemias. Tahkiskeemilise sünteesi leiutas 1960. aastatel Bruce Merrifield ja pälvis 1984. aastal Nobeli keemiaauhinna.
Tahkefaasiline süntees viiakse läbi tahkel alusel, filtrite vahel, kolonnides, mis lasevad läbi kõik reaktiivid ja lahustid. Tahkefaasilisel sünteesil on lahuse sünteesi ees mitmeid eeliseid:
tagab kõrge reaktsioonikiiruse
Lisandid ja üleliigsed reaktiivid pestakse ära, seega pole pärast iga sammu puhastamine vajalik
protsessi on võimalik automatiseerida arvutiga juhitavatel tahkefaasilistel süntesaatoritel.
Tahked kandjad (nimetatakse ka vaikudeks) on vees lahustumatud osakesed, mille läbimõõt on tavaliselt 50-200 µm ja millele on sünteesi käigus kinnitatud oligonukleotiid.
On tõendeid, et üks tõhusamaid materjale, mida saab kasutada tahke alusena, on poorne klaas. See on üsna jäik ja ei paisu. Selle sügavates poorides toimub oligonukleotiidide süntees. Klaas sisaldab 500 Å (50 nm) poore, mis sobivad lühikeste oligonukleotiidide sünteesiks. Siiski sobib see halvasti üle 40 aluse pikkuste oligonukleotiidide sünteesiks. See on tingitud asjaolust, et kasvav oligonukleotiid blokeerib poorid ja vähendab reaktiivide difusiooni läbi maatriksi.
Tavalise oligonukleotiidide sünteesi tahked kandjad valmistatakse tavaliselt 20-30 µmol nukleosiidiga ühe grammi vaigu kohta. Oligonukleotiidide süntees suurematel koormustel muutub vähem tõhusaks steerilise takistuse tõttu vaigu külge kinnitatud külgnevate DNA ahelate vahel.
Oligonukleotiidide keemilise sünteesi etapid
Fosforamidaadi oligosüntees toimub 3' kuni 5' suunas (vastupidiselt DNA biosünteesi suunale 5' kuni 3' DNA replikatsioonis). Tsükli sünteesi kohta lisatakse üks nukleotiid.
Riis. 2. Fosforamidaadi oligonukleotiidi sünteesitsükkel
Oligonukleotiidi sünteesi alguses kinnitatakse esimene nukleosiid eelnevalt vaigule (kandjale) ja sünteesikolonnid A, G, C või T valitakse sõltuvalt soovitud oligonukleotiidi 3'-otsas olevast nukleosiidist. Ankurdatud nukleosiidil on 5'-DMT kaitserühm (DMT=4,4'-dimetoksütritüül), mille ülesanne on vältida polümerisatsiooni ja see kaitserühm tuleb eemaldada (detritüülimine). Detrialiseerimise mehhanism on näidatud joonisel 3.
Joonis 3. Kaitserühma eemaldamise mehhanism.
Pärast detritüülimist on ankurdatud nukleosiid valmis reageerima järgmise alusega, mis lisatakse nukleosiidfosforamidaadi monomeerina. Vastava nukleosiidi suur liig segatakse aktivaatoriga (tetrasool või selle derivaadid). Nukleosiidi diisopropüülaminorühm protoneeritakse aktivaatori poolt ja seega muutub see väga eemaldatavaks rühmaks. See tõrjub kiiresti välja seotud nukleosiidi 5'-hüdroksüülrühma poolt, luues fosfittriestri (joonis 4).
Joonis 4. Prootonimise mehhanism aktivaatori poolt.
Nukleosiidfosforamidiidid on inertses atmosfääris üsna stabiilsed ja neid saab toota suurtes kogustes, tarnida üle maailma ja säilitada kuiva tahke ainena mitu kuud enne kasutamist.
Kuid isegi ülitäpse oligonukleotiidide sünteesi töö korral jääb võimalus, et järgmises etapis osalemiseks on mõned reageerimata 5'-hüdroksüülrühmad. Kui sellist katkestust ei peatata, kuhjuvad need iga järgneva tsükliga ja lõppsaaduseks on oligonukleotiidide komplekssegu, millest enamik kannab endas ebaõiget geneetilist informatsiooni.
Seetõttu muudab 5'-hüdroksüülrühmade atsetüülimise meetod need järgneva reaktsiooni suhtes inertseks. See on vajalik ka lisandite minimeerimiseks.
Lisamisetapis moodustunud triesterfosfit (P(III)) on hapete suhtes ebastabiilne ja tuleb muuta stabiilseks vormiks (P(V)). See saavutatakse joodi oksüdeerumise tõttu vee ja püridiini juuresolekul (joonis 5). Saadud fosfotriester on tegelikult DNA telg, mis on kaitstud 2-tsüanoetüülrühmaga. Tsüanoetüülrühm hoiab ära soovimatud reaktsioonid fosforiga järgnevate sünteesitsüklite ajal.
Joonis 5. Oksüdatiivse etapi mehhanism.
Pärast seda tuleb DNA ahela 5' otsas olev DMT kaitserühm eemaldada, et primaarne hüdroksüülrühm saaks reageerida järgmise nukleotiidfosforamidaadiga. Kaitse eemaldamise reaktsioon trikloroäädikhappega diklorometaanis on kiire. Tsüklit korratakse üks kord iga aluse jaoks, kuni saadakse soovitud oligonukleotiid.
Järgmiseks peate sünteesitud oligonukleotiidi tahkest alusest eraldama. Sel juhul kasutatakse suktsinüüli. Eraldamine on võimalik, kui töödeldakse toatemperatuuril ühe tunni jooksul kontsentreeritud ammoniaagi vesilahusega (joonis 6).
Joonis 6. Oligonukleotiidi eraldamise mehhanism tahkest kandjast kontsentreeritud ammoniaagi vesilahuses.
Lõhustamisreaktsioon toimub mõnel süntesaatoril automaatselt ja oligonukleotiidi sisaldav ammoniaagilahus siseneb klaasviaali. Teise võimalusena võib seedimist teha käsitsi, võttes kolonni süntesaatorist ja loputades ammooniumhüdroksiidi sisaldavates süstaldes.
Oligonukleotiid lahustatakse kontsentreeritud ammoniaagi vesilahuses ja järgnev kuumutamine võimaldab eemaldada kaitserühmad heterotsüklilistest alustest ja fosfaatidest. Vesilahus eemaldatakse seejärel aurustamisega ja oligonukleotiid on puhastamiseks valmis.
Lisaks DMT kaitserühmale on vaja täiendavaid kaitserühmi ka adeniini, tsütosiini ja guaniini jaoks (joonis 7). Tümiini puhul pole see aga vajalik.
Joonis 7. Kaitserühma struktuurid, mida tavaliselt kasutatakse adeniini, tsütosiini ja guaniini aluste kaitsmiseks DNA oligonukleotiidide fosforamidaadi sünteesi ajal.
järeldused
1. Kunstlikult sünteesitud oligonukleotiide kasutatakse erinevates teadusvaldkondades üha enam ning nende valmistamise meetodeid täiustatakse üha enam, mis võimaldab sünteesida piisaval hulgal oligonukleotiide laborikatseteks ja terapeutiliste ravimite loomiseks.
2. Siiani on kõige levinum oligonukleotiidide sünteesi meetod tahkefaasilise sünteesi meetod, mis võib oluliselt kiirendada oligonukleotiidide saamise protsessi, samuti vähendada kasutatud reaktiivide hulka.
5507 0
Seda on võimalik saavutada mitmel viisil: vastava oligonukleotiidi hübridiseerimine spetsiifilise geeni või mRNA-ga, valgu transkriptsioonifaktori blokeerimine, mRNA hulga vähendamine RNA ensüümide poolt lõhustamise tulemusena jne. Mõelge mõne neist põhimõtetele.
Ribooligonukleotiidi, mis seondub spetsiifilise mRNA-ga ja inhibeerib seeläbi selle kodeeritava valgu translatsiooni, nimetatakse "antisenss-mRNA-ks". Seda mehhanismi kasutavad mõned bakterid geenide reguleerimiseks (joonis 3.20). Praktikas kasutatakse kunstlikult kujundatud geene, milles DNA insert on sellises orientatsioonis, et nende transkriptid on sihtmärk-mRNA suhtes antisenss (joonis 3.21).
Riis. 3.20. Bakterioferritiini (bfr) geeni reguleerimine antisenss-RNA abil
Riis. 3.21. mRNA translatsiooni inhibeerimine sünteetilise antisenss-oligonukleotiidiga
On näidatud, et sünteetilisi antisenss-oligonukleotiide saab kasutada, kuid nende terapeutiline toime sõltub tugevalt nende resistentsusest rakuliste nukleaaside toimele, kohaletoimetamissüsteemist ja nende hübridisatsiooni spetsiifilisusest. Spetsiifilise mRNA kõige tõhusamate sihtmärkkohtade määramiseks testitakse 15-20 aluse pikkuste antisenss-oligonukleotiidide komplekti sihtmärk-mRNA-d sünteesiva rakukultuuriga. Sünteesitud valkude koostis määratakse elektroforeesiga ja tehakse kindlaks, millise oligonukleotiidi sisseviimine viib sihtvalgu sünteesi vähenemiseni.
Nukleaasi lõhustumise eest kaitsmiseks sünteesitakse modifitseeritud oligonukleotiide, mis ei kaota hübridiseerumisvõimet. Joonisel fig. 3.22 näitab modifitseeritud nukleotiidide struktuure, mille efektiivsust intensiivselt uuritakse. Näiteks on näidatud, et oligonukleotiidid, milles fosfodiestersideme vaba hapnik on asendatud väävliga (struktuur b), hübridiseeruvad tõhusalt komplementaarse sihtmärk-RNA-ga ja tekkivad RNA-DNA dupleksid aktiveerivad intratsellulaarse ribonukleaasi H.
See endogeenne ensüüm hüdrolüüsib sellistes hübriidides RNA järjestust. Selliste oligonukleotiididega on juba tehtud paljutõotavaid kliinilisi uuringuid, mille sihtmärkideks olid tsütomegaloviiruse RNA, HIV ja mõned vähi arengu eest vastutavad RNA-d.
Riis. 3.22. Oligonukleotiidi modifikatsioonid: a - normaalne fosfodiesterside; b - tiofosfaatside; c - fosfamiidside; d - 2"-0-metüülriboos, e - C-5-propünüültsütosiin
Antisenss-oligonukleotiidide tõhusaks kohaletoimetamiseks pakitakse need sageli liposoomidesse, mida omakorda muudetakse spetsiifiliste ligandidega, mis tagavad sihipärase kohaletoimetamise (oleme seda tehnikat juba näinud, kui kaalusime terapeutiliste geenide mitteviirusliku kohaletoimetamise meetodeid). Praeguseks on viirusnakkuste ja malaaria ravis läbi viidud mitmeid teste ja on näidatud, et antisenss-oligonukleotiidide kõrge terapeutiline efektiivsus pärsib silelihasrakkude soovimatut proliferatsiooni (angioplastikajärgsed tüsistused, koronaaroperatsioon, ateroskleroos). .
Ribosüümide - loodusliku nukleaasi aktiivsusega RNA - toimepõhimõte ja struktuur on näidatud joonisel fig. 3.23.
On leitud, et need lühikese ahelaga RNA-d on võimelised tõhusalt alla suruma viiruse geenide, onkogeenide, kasvufaktorite ja teiste terapeutiliselt oluliste geenide ekspressiooni, lõhustades nende mRNA-d. Substraadiga seonduvat järjestust modifitseerides on võimalik saada konkreetsele mRNA-le spetsiifilisi ribosüüme. Ribosüüme saab sünteesida otse rakus katalüütilist domeeni kodeeriva sünteetilise oligodesoksüribonukleotiidi ja sellega külgnevate hübridiseerivate piirkondade transkriptsiooni teel.
Riis. 3.23. mRNA lõhustamine ribosüümidega. Nool näitab lõhustamiskohta.
Selline oligonukleotiid sisestatakse eukarüootsesse ekspressioonivektorisse ja asetatakse rakku. Saadud RNA omandab spontaanselt aktiivse konformatsiooni, nn vasarapea kuju. Keemiliselt on sünteesitud palju erineva struktuuri ja aktiivsusega ribosüüme. Näiteks Venemaa Teaduste Akadeemia Siberi filiaali Keemilise Bioloogia ja Eksperimentaalmeditsiini Instituudi (Novosibirsk) nukleiinhapete laboris tehakse aastatepikkusi uuringuid, et saada sünteetilisi ribosüüme, millel on suurenenud aktiivsus ja stabiilsus.
Et suurendada kaitset enneaegse lõhustamise eest rakusiseste nukleaaside poolt, saadakse erinevaid ribosüümide derivaate – metüleeritud 2"-hüdroksüülrühmadega (vt joonis 3.22, d) binaarstruktuuridega jne. Ribosüümmolekuli struktuur mõjutab oluliselt selle efektiivsust. Joonis 3.24 näitab mdr1 mRNA lõhustamise kineetikat erinevate struktuuridega sünteesitud ribosüümidega.
Riis. 3.24. MDR1 mRNA 190-meerilise 5'-terminaalse fragmendi lõhustamine modifitseeritud binaarsete (1,3) ja täispika (2,4) ribosüümidega: a - RNA struktuur isoleeritud spetsiifilise saidiga; b - lõhustumisproduktide akumuleerumine ( materjalid, mida pakuvad A.G. Venyaminova, IBKhiFM, Novosibirsk)
Molekulaarteraapias on eriline koht nn eelravimi aktiveerimise meetoditel. Näiteks üks vähi geeniteraapia meetoditest on kasvajarakkude hävitamine, kasutades gantsükloviiri (GCV, guanosiini derivaadi), tümidiini kinaasi geeni produkti, aktiveeritud derivaati, mis pärineb juba mainitud herpes simplex-viirusest HSVtk. meie.
Kasvajarakud transfekteeritakse in vivo HSVtk geeniga aktiivse promootori all ja mõne päeva pärast manustatakse gantsükloviiri, mis fosforüülitakse viiruse tümidiini kinaasiga monofosfaadiks ja seejärel peremeesraku kinaaside poolt trifosfaadiks. See derivaat inhibeerib DNA polümeraasi ja peatab DNA sünteesi, mis põhjustab prolifereeruvate rakkude surma. Rakkudevaheliste kontaktide kaudu tungib gantsükloviirtrifosfaat naaberrakkudesse ja hävitab seega veel kümme kasvajarakku.
Geeni, mis viib inimese enda raku surmani, nimetatakse "suitsiidi" geeniks (meie puhul on selleks tümidiini kinaasi geen) ja termin "eelravim" viitab ravimi mitteaktiivsele vormile (antud juhul on see gantsükloviir). Seda lähenemist on kasutatud geeniaktivaatori-eelravimi kombinatsiooni muude variantide loomiseks, kuid GCV-HSVtk süsteemi efektiivsus on juba tõestatud mitmete prekliiniliste uuringute käigus.
Geeniteraapia on uus meditsiiniline distsipliin, mille kujunemine toimub meie silme all. Vaatamata mõningatele õnnestumistele ja paljutõotavatele väljavaadetele on veel mitmeid väljakutseid, mis tuleb ületada.
Mõned probleemid on kaugel meditsiinist ja molekulaarbioloogiast. Need on eetilised ja poliitilised küsimused. Nagu olete juba märganud, kaalusime geeniteraapia meetodeid ainult somaatiliste rakkude jaoks. See tähendab, et tehtavad parandused piirduvad teatud elundi või koega, "korrigeeritud" geenid ei kandu edasi järgmisele põlvkonnale. Sugurakkude (sperma või munarakud) või viljastatud rakkude genotüübi muutusi tuleb edasi anda põlvest põlve.
Praegu on somaatiliste rakkude geeniteraapia klassifitseeritud meditsiinilise sekkumise standardmeetodiks. Seevastu sugurakkude geeniteraapia on tehnoloogiliselt palju keerulisem, problemaatilisem ja ettearvamatum. Seetõttu on selles valdkonnas katsed paljudes riikides keelatud.
80ndate lõpus. Ameerika Ühendriikides on kehtestatud eeskirjad, mis reguleerivad katseid somaatiliste rakkude geeniteraapia valdkonnas. Need tagavad erapooletu ja esindusliku patsientide valiku ja nende teadlikkuse (kui ohtlik on ravi, milline on selle õnnestumise tõenäosus jne), patsientide ja läbiviidud uuringute andmete konfidentsiaalsuse, kõigi manipulatsioonide korrektse teostamise, kahjustamata , nii konkreetsetele patsientidele kui ka elanikkonnale üldiselt.
Kuna somaatiliste rakkude ravi toob kaasa geneetiliste haigustega patsientide seisundi paranemise ja olulise eluea pikenemise, kuid "paranenud" geen ei päri, siis arvatakse, et see toob kaasa geneetiliste haiguste kuhjumise inimpopulatsioon. Populatsioonigeneetika järgi kulub aga tõhusa ravi tulemusel kahjuliku geeni esinemissageduse oluliseks tõusuks tuhandeid aastaid.
ON. Voinov, T.G. Volova
Enamikus geeniteraapia meetodites ex vivo ja in vivo kasutatakse kloonitud geneetilisi konstruktsioone, mis asendavad valgu funktsionaalset vormi, mida patsiendi kehas ei sünteesita või mis sünteesitakse defektsel kujul. Paljud inimeste haigused (vähk, põletikud, viirus- ja parasiitnakkused) on aga seotud hoopis normaalse valgu ületootmisega. Nende seisundite raviks on välja töötatud ravimeetodid.
süsteemid, mis kasutavad spetsiifilisi oligonukleotiide. Selline väike oligonukleotiid võib hübridiseeruda spetsiifilise geeni või mRNA-ga ja vähendada transkriptsiooni või translatsiooni taset, vähendades seeläbi sünteesitava patoloogia eest vastutava valgu kogust. Oligonukleotiidi, mis hübridiseerub geeni endaga ja blokeerib selle transkriptsiooni, nimetatakse "antigeenseks" ja seda, mis hübridiseerub vastava mRNA-ga, nimetatakse "antisenss" (Antisense RNA). Spetsiifiliste geenide transkriptsiooni aktiveerimise vältimiseks võib kasutada ka kaheahelalisi oligonukleotiide, mis seonduvad spetsiifiliselt DNA-d siduvate valkudega (aktivaatorvalgud). Lõpuks võib teatud mRNA ja sellel sünteesitava valgu koguse vähendamiseks kasutada ribosüüme – looduslikke RNA järjestusi, mis seonduvad spetsiifiliste RNA molekulidega ja lõikavad neid.
Tulevikus leiavad nukleiinhappel põhinevad ravimid tõenäoliselt laialdast rakendust, kusjuures teadusliku uurimistöö ja kliiniliste uuringute peamiseks objektiks on erinevad "antisenss" oligonukleotiidid.
3.1 Antisenss-oligonukleotiidid ravimitena
"Antisense" RNA (Antisense RNA), mida peaks kasutama ravimina, on lühike (15-20 nukleotiidi) oligonukleotiid, mis võib seonduda teatud sellega komplementaarse mRNA saidiga ja pärssida selle kodeeritava valgu translatsiooni. pärssides seeläbi patoloogilist protsessi (joon. 2).
Sünteetiliste "antisenss" oligonukleotiidide terapeutiline toime sõltub nende hübridisatsiooni spetsiifilisusest sihtmärk-mRNA ligipääsetava kohaga, resistentsusest raku nukleaaside toimele ja rakku kohaletoimetamise süsteemi olemasolust. 15-20 nukleotiidi järjestused hübridiseeruvad unikaalsete, üsna kõrge spetsiifilisusega mRNA-dega. Potentsiaalsed märklaudkohad määratakse "antisenss" oligonukleotiidide komplekti testimise teel, kasutades rakukultuuri, mis sünteesib sihtmärk-mRNA-d. Selleks viiakse läbi rakuvalkude elektroforeetiline eraldamine, millesse translatsiooni käigus lisatakse radioaktiivne märgis ja radioautoograafia abil tehakse kindlaks, milliste “antisenss” oligonukleotiidide juuresolekul teatud valgu süntees väheneb. Erinevates RNA transkriptides parimate sihtsaitide valimiseks puuduvad üldised kriteeriumid. Tõhusad võivad olla oligonukleotiidid, mis on komplementaarsed mRNA 5' või 3' otstega, eksoni ja introni piiridega ning isegi kaheahelaliste piirkondadega. Antisenss-oligonukleotiide võivad rakusisesed nukleaasid lagundada, mistõttu on oluline kaitsta neid viimaste toime eest, et nad ei kaotaks oma võimet sihtmärgiga hübridiseeruda. Selleks saab pürimidiini aluseid, riboosi või desoksüriboosi teatud viisil modifitseerida (joonis 3). Seega on praegu kõige laialdasemalt kasutatavates antisenss-oligonukleotiidides fosfodiestersideme vaba hapnikuaatom asendatud SH-rühmaga (joonis 3B). ), mille tulemusena moodustub tiofosfaatside. Sel viisil modifitseeritud oligonukleotiidid lahustuvad vees, kannavad negatiivset laengut ja neid ei lõhusta endonukleaasid. Sihtkohaga hübridiseerituna moodustavad nad duplekse, mis aktiveerivad ribonukleaasi (RNaasi), endogeense ensüümi, mis lõikab sellises hübriidmolekulis mRNA-d. Selliste oligonukleotiidide - "esimese põlvkonna" ravimite - esimesed kliinilised uuringud on läbi viidud. Sihtmärgid on tsütomegaloviiruse, inimese immuunpuudulikkuse viiruse RNA, samuti vähi, soolehaiguste ja muude haiguste tekke eest vastutavate geenide mRNA.
Sünteesitud "antisenss" oligonukleotiidid fosforamidiidi ja polüamiid (peptiid) sidemetega - peptiidnukleiinhapped (peptiidnukleiinhapped, PNA-d) (joon. 3 V ja D ). Sellised molekulid on nukleaaside toimele väga vastupidavad. Suhkrujäägi 2'-süsiniku aatomiga ja pürimidiinide C-5 aatomiga seotud keemilised rühmad kaitsevad samuti antisenss-oligonukleotiide ja hõlbustavad nende seondumist sihtkohaga (joonis 3). 2D Ja E ). Kõiki nende ja teiste modifikatsioonide eeliseid uuritakse praegu intensiivselt.
Antisenss-oligonukleotiidide tungimist rakku saab oluliselt hõlbustada nende paigutamisega liposoomidesse. See ülitõhus manustamissüsteem võimaldab kasutada "antisenss" oligonukleotiide madalatel kontsentratsioonidel. Kui aga liposoomid on konjugeeritud teatud elundite teatud rakkude epitoopide suhtes spetsiifiliste antikehadega, on võimalik läbi viia „antisenss” oligonukleotiidide sihipärane kohaletoimetamine.
Läbiviidud prekliinilised testid on näidanud, et "antisenss" oligonukleotiidid on väga tõhusad ravimid. Uuritud on nende kasutamise võimalust koronaar- ja unearterite stenoosi raviks, mis põhjustab südameinfarkti ja insulti. Nendel juhtudel kasutavad nad sageli angioplastikat, arterite laiendamist balloonkateetriga, kuid ligikaudu 40% patsientidest ilmnevad stenoosid uuesti 6 kuu pärast, kuna angioplastika stimuleerib silelihasrakkude proliferatsiooni ja rakkudevahelise aine sekretsiooni sisemusse. arteri kiht selle laienemise kohas. Ühes katses süstiti pärast angioplastikat rottide unearteritesse tiofosfaatsidemetega antisenss-oligonukleotiide, mis on komplementaarsed imetajate rakutsükli jaoks olulisi valke kodeerivate mRNA-dega; selle tulemusena vähenes korduvate stenooside esinemissagedus 90%. Silelihasrakkude proliferatsioon esineb ka ateroskleroosi, suhkurtõve, pärgarteri šunteerimise järgsete tüsistuste korral. Tõenäoliselt saab kõiki neid olekuid juhtida sarnaselt.
Antisenss-oligonukleotiide saab kasutada ka viirusnakkuste ja malaaria raviks. Lisaks näitasid Crohni tõve ravis läbi viidud I faasi kliiniliste uuringute tulemused "antisenss" oligonukleotiidi suukaudsel manustamisel selget terapeutilist toimet ilma märgatavate kõrvalmõjudeta. Sel juhul kodeeris sihtmärk-mRNA 1. tüüpi rakkudevahelist adhesiooni, mida toodetakse Crohni tõvega patsientidel ülemäära. Selle eesmärk on uurida sama oligonukleotiidi efektiivsust teiste põletikuliste haiguste, nagu reumatoidartriit, psoriaas ja haavandiline koliit, ravis.
Põhimõtteliselt võivad "antisenss" oligonukleotiidid moodustada kromosomaalse sihtmärk-DNA-ga kolmikheeliksi ja blokeerida transkriptsiooni. Kuid "antigeensete" oligonukleotiidide spetsiifilisus ei vasta veel ravimite jaoks vastuvõetud standarditele.
"Antisense" RNA (Antisense RNA), mida peaks kasutama ravimina, on lühike (15-20 nukleotiidi) oligonukleotiid, mis võib seonduda teatud sellega komplementaarse mRNA saidiga ja pärssida selle kodeeritava valgu translatsiooni. pärssides seeläbi patoloogilist protsessi (joon. 2).
Sünteetiliste "antisenss" oligonukleotiidide terapeutiline toime sõltub nende hübridisatsiooni spetsiifilisusest sihtmärk-mRNA ligipääsetava kohaga, resistentsusest raku nukleaaside toimele ja rakku kohaletoimetamise süsteemi olemasolust. 15-20 nukleotiidi järjestused hübridiseeruvad unikaalsete, üsna kõrge spetsiifilisusega mRNA-dega. Potentsiaalsed märklaudkohad määratakse "antisenss" oligonukleotiidide komplekti testimise teel, kasutades rakukultuuri, mis sünteesib sihtmärk-mRNA-d. Selleks viiakse läbi rakuvalkude elektroforeetiline eraldamine, millesse translatsiooni käigus lisatakse radioaktiivne märgis ja radioautoograafia abil tehakse kindlaks, milliste “antisenss” oligonukleotiidide juuresolekul teatud valgu süntees väheneb. Erinevates RNA transkriptides parimate sihtsaitide valimiseks puuduvad üldised kriteeriumid. Tõhusad võivad olla oligonukleotiidid, mis on komplementaarsed mRNA 5' või 3' otstega, eksoni ja introni piiridega ning isegi kaheahelaliste piirkondadega. Antisenss-oligonukleotiide võivad rakusisesed nukleaasid lagundada, mistõttu on oluline kaitsta neid viimaste toime eest, et nad ei kaotaks oma võimet sihtmärgiga hübridiseeruda. Selleks saab pürimidiini aluseid, riboosi või desoksüriboosi teatud viisil modifitseerida (joonis 3). Seega on praegu kõige laialdasemalt kasutatavates antisenss-oligonukleotiidides fosfodiestersideme vaba hapnikuaatom asendatud SH-rühmaga (joonis 3B). ), mille tulemusena moodustub tiofosfaatside. Sel viisil modifitseeritud oligonukleotiidid lahustuvad vees, kannavad negatiivset laengut ja neid ei lõhusta endonukleaasid. Sihtkohaga hübridiseerituna moodustavad nad duplekse, mis aktiveerivad ribonukleaasi (RNaasi), endogeense ensüümi, mis lõikab sellises hübriidmolekulis mRNA-d. Selliste oligonukleotiidide - "esimese põlvkonna" ravimite - esimesed kliinilised uuringud on läbi viidud. Sihtmärgid on tsütomegaloviiruse, inimese immuunpuudulikkuse viiruse RNA, samuti vähi, soolehaiguste ja muude haiguste tekke eest vastutavate geenide mRNA.
Sünteesitud "antisenss" oligonukleotiidid fosforamidiidi ja polüamiid (peptiid) sidemetega - peptiidnukleiinhapped (peptiidnukleiinhapped, PNA-d) (joon. 3 V ja D ). Sellised molekulid on nukleaaside toimele väga vastupidavad. Suhkrujäägi 2'-süsiniku aatomiga ja pürimidiinide C-5 aatomiga seotud keemilised rühmad kaitsevad samuti antisenss-oligonukleotiide ja hõlbustavad nende seondumist sihtkohaga (joonis 3). 2D Ja E ). Kõiki nende ja teiste modifikatsioonide eeliseid uuritakse praegu intensiivselt.
Antisenss-oligonukleotiidide tungimist rakku saab oluliselt hõlbustada nende paigutamisega liposoomidesse. See ülitõhus manustamissüsteem võimaldab kasutada "antisenss" oligonukleotiide madalatel kontsentratsioonidel. Kui aga liposoomid on konjugeeritud teatud elundite teatud rakkude epitoopide suhtes spetsiifiliste antikehadega, on võimalik läbi viia „antisenss” oligonukleotiidide sihipärane kohaletoimetamine.
Läbiviidud prekliinilised testid on näidanud, et "antisenss" oligonukleotiidid on väga tõhusad ravimid. Uuritud on nende kasutamise võimalust koronaar- ja unearterite stenoosi raviks, mis põhjustab südameinfarkti ja insulti. Nendel juhtudel kasutavad nad sageli angioplastikat, arterite laiendamist balloonkateetriga, kuid ligikaudu 40% patsientidest ilmnevad stenoosid uuesti 6 kuu pärast, kuna angioplastika stimuleerib silelihasrakkude proliferatsiooni ja rakkudevahelise aine sekretsiooni sisemusse. arteri kiht selle laienemise kohas. Ühes katses süstiti pärast angioplastikat rottide unearteritesse tiofosfaatsidemetega antisenss-oligonukleotiide, mis on komplementaarsed imetajate rakutsükli jaoks olulisi valke kodeerivate mRNA-dega; selle tulemusena vähenes korduvate stenooside esinemissagedus 90%. Silelihasrakkude proliferatsioon esineb ka ateroskleroosi, suhkurtõve, pärgarteri šunteerimise järgsete tüsistuste korral. Tõenäoliselt saab kõiki neid olekuid juhtida sarnaselt.
Antisenss-oligonukleotiide saab kasutada ka viirusnakkuste ja malaaria raviks. Lisaks näitasid Crohni tõve ravis läbi viidud I faasi kliiniliste uuringute tulemused "antisenss" oligonukleotiidi suukaudsel manustamisel selget terapeutilist toimet ilma märgatavate kõrvalmõjudeta. Sel juhul kodeeris sihtmärk-mRNA 1. tüüpi rakkudevahelist adhesiooni, mida toodetakse Crohni tõvega patsientidel ülemäära. Selle eesmärk on uurida sama oligonukleotiidi efektiivsust teiste põletikuliste haiguste, nagu reumatoidartriit, psoriaas ja haavandiline koliit, ravis.
Põhimõtteliselt võivad "antisenss" oligonukleotiidid moodustada kromosomaalse sihtmärk-DNA-ga kolmikheeliksi ja blokeerida transkriptsiooni. Kuid "antigeensete" oligonukleotiidide spetsiifilisus ei vasta veel ravimite jaoks vastuvõetud standarditele.