Aminohappeid saab määrata värvireaktsioonide abil: ninhüdriin, ksantoproteiin, Fol, Milon, biureedi test jne. Need reaktsioonid on mittespetsiifilised, sest põhinevad üksikute fragmentide tuvastamisel aminohapete struktuuris, mis võivad esineda ka teistes ühendites.
Ninhüdriini reaktsioon, värvireaktsioon, mida kasutatakse aminohapete, iminohapete ja amiinide kvalitatiivseks ja kvantitatiivseks määramiseks. Kuumutamisel leeliselises ninhüdriini (triketohüdrindenhüdraat, C 9 Hb O 4) keskkonnas koos primaarsete aminorühmadega (-NH 2) ainetega moodustub produkt, millel on stabiilne intensiivne sinakasvioletne värvus maksimaalse neeldumisega umbes 570 nm. Kuna neeldumine sellel lainepikkusel sõltub lineaarselt vabade aminorühmade arvust, oli ninhüdriini reaktsioon nende kvantitatiivse määramise aluseks kolorimeetria või spektrofotomeetria abil. Seda reaktsiooni kasutatakse ka sekundaarsete aminorühmade (> NH) määramiseks iminohapetes – proliinis ja hüdroksüproliinis; sel juhul moodustub erekollane toode. Tundlikkus - kuni 0,01%. Kaasaegne automaatne aminohapete analüüs viiakse läbi aminohapete ioonivahetuse lahutamise ja nende kvantitatiivse määramise kombineerimise teel ninhüdriini reaktsiooni abil. Aminohapete segude eraldamisel paberkromatograafiaga saab iga aminohapet määrata koguses vähemalt 2-5 µg.
Aminohapete kogust saab hinnata värvi intensiivsuse järgi.
See reaktsioon on positiivne mitte ainult vabade aminohapete, vaid ka peptiidide, valkude jne puhul.
ksantoproteiini reaktsioon võimaldab tuvastada aromaatseid aminohappeid (fenüülalaniin, türosiin, histidiin, trüptofaan), mis põhineb aromaatse tuuma elektrofiilse asendusreaktsioonil (nitreerimine).
Kontsentreeritud lämmastikhappe toimel, näiteks türosiinil, moodustub kollane toode.
Fohli reaktsioon. See on reaktsioon tsüsteiinile ja tsüstiinile. Aluselise hüdrolüüsi käigus tsüsteiinis ja tsüstiinis "nõrgalt seotud väävel" eraldub üsna kergesti, mille tulemusena moodustub vesiniksulfiid, mis leelisega reageerides annab naatrium- või kaaliumsulfiidid. Plii(II)atsetaadi lisamisel moodustub hallikasmust plii(II)sulfiidi sade.
Kogemuse kirjeldus. Valage katseklaasi 1 ml tsüstiini lahust, lisage 0,5 ml 20% naatriumhüdroksiidi lahust. Segu kuumutatakse keemiseni ja seejärel lisatakse 0,5 ml plii(II)atsetaadi lahust. Täheldatakse plii(II)sulfiidi hallikasmust sadet:
Zimmermanni reaktsioon. See on reaktsioon aminohappe glütsiinile.
Kogemuse kirjeldus. 2 ml 0,1% glütsiini lahusele, mille pH on reguleeritud 10% leeliselahuse lisamisega väärtuseni 8, valatakse 0,5 ml o-ftaaldialdehüüdi vesilahust. Reaktsioonisegu hakkab aeglaselt muutuma erkroheliseks. Mõne minuti pärast ilmub roheline sade.
reaktsioon trüptofaanile. Trüptofaan, reageerides happelises keskkonnas aldehüüdidega, moodustab värvilised kondensatsiooniproduktid. Näiteks glüoksüülhappega (mis on kontsentreeritud äädikhappe lisand) kulgeb reaktsioon vastavalt võrrandile:
Trüptofaani reaktsioon formaldehüüdiga toimub sarnase skeemi järgi.
Sakaguchi reaktsioon. See reaktsioon aminohappele arginiinile põhineb arginiini interaktsioonil α-naftooliga oksüdeeriva aine juuresolekul. Selle mehhanismi pole veel täielikult välja selgitatud. Ilmselt viiakse reaktsioon läbi järgmise võrrandi järgi:
Kuna kinonimiinide (antud juhul naftokinooni) derivaadid, milles iminorühma –NH– vesinik on asendatud alküül- või arüülradikaaliga, on alati kollakaspunaste toonidega, siis nähtavasti oranžikaspunane värv lahuse kogus Sakaguchi reaktsiooni ajal on tingitud täpselt naftokinooni imiini derivaadi ilmumisest. Siiski ei ole välistatud veelgi keerulisema ühendi moodustumine arginiinijäägi ülejäänud NH-rühmade ja α-naftooli benseenitsükli edasise oksüdeerumise tõttu:
Kogemuse kirjeldus. Valage katseklaasi 2 ml 0,01% arginiini lahust, seejärel lisage 2 ml 10% naatriumhüdroksiidi lahust ja paar tilka 0,2% α-naftooli alkoholilahust. Katseklaasi sisu segatakse hästi, lisatakse 0,5 ml hüpobromiidi lahust ja segatakse uuesti. Kiiresti tekkiva oranžikaspunase värvuse stabiliseerimiseks lisatakse kohe 1 ml 40% uurea lahust.
Biureti reaktsioon- kasutatakse valkude värvireaktsioonina. Leeliselises keskkonnas vask(II)soolade juuresolekul annavad need violetse värvuse. Värvus on tingitud vask(II) kompleksühendi moodustumisest peptiidrühma tõttu -CO-NH- mis on omane valkudele. See reaktsioon sai oma nime karbamiidi derivaadi - biureedi järgi, mis moodustub karbamiidi kuumutamisel ammoniaagi eemaldamisega:
Lisaks valkudele ja biureedile annavad sama värvuse ka teised seda rühma sisaldavad ühendid: amiidid, karboksüülhapete imiidid, samuti ühendid, mis sisaldavad molekulis rühmi -CS-NH- või \u003d CH-NH-. Reaktsiooni annavad ka valgud, mõned aminohapped, peptiidid, biureet ja keskmised peptoonid.
Biureedi reaktsioonil erinevate peptiididega saadud kompleksi värvus on mõnevõrra erinev ja sõltub peptiidahela pikkusest. Peptiidid, mille ahela pikkus on neli aminohappejääki ja rohkem, moodustavad punase kompleksi, tripeptiidid - lillad ja dipeptiidid - sinised.
polüpeptiidi ketooni vorm
polüpeptiidi enoolvorm
Kui polüpeptiid interakteerub Cu (OH) 2-ga, moodustub kompleks, mille struktuuri saab näidata järgmiselt.
Selles artiklis käsitletakse aminohapete määramise meetodeid, mida ei kasutata mitte ainult toodete analüüsimisel, vaid ka biokeemias ja farmatseutilises analüüsis.
Aminohapete üldkoguse saab määrata fotomeetrilise meetodiga, mis põhineb aminohapetest saadud ammoniaagi määramisel Kjeldahli meetodil.
Reaktsioon 1-naftooliga. Arginiini, histidiini, türosiini määramiseks pakuti välja reaktsioon 1-naftooliga. Naatriumhüpokloriti (NaOCl) juuresolekul muutub lahus punaseks. Aminohapet sisaldav proovilahus 50% etanoolis jahutatakse jääga ning lisatakse 10% NaOCl lahus ja naftooli lahus. Reaktsiooniprodukt on värvitud punaseks (lmax = 550 nm). Aminohapete sisaldus määratakse saadud lahuse värvuse intensiivsuse järgi.
Biureti reaktsioon. Üks tähtsamaid aminohapete määramiseks kasutatavaid reaktsioone on biureedi reaktsioon. Reaktsioon viiakse läbi vask(II)soola lahjendatud vesilahuse lisamisega biureedi leeliselisele lahusele. Sel juhul muutub lahus kompleksühendi moodustumise tõttu intensiivseks violetseks värviks.
Biureedi reaktsioonis osalevad vähemalt 2 amiidrühma või aminohüdroksüetüleenrühma sisaldavad ühendid, samuti aminohapete amiidid ja imiidid. Valgud ning aminohapete ja amiidide kontsentreeritud lahused annavad selle reaktsiooni. Lahjendatud aminohapete lahused ei anna biureedi reaktsiooni ja seetõttu saab reaktsiooni kasutada valgu hüdrolüüsi lõppemise kindlakstegemiseks. Reaktsiooni kasutatakse ka valgu kvalitatiivseks ja kvantitatiivseks määramiseks. Kliinilise diagnostika laborites kasutatavad meetodid valgu määramiseks veres ja teistes bioloogilistes vedelikes põhinevad biureedi reaktsioonil.
ninhüdriini reaktsioon. Teine kõige olulisem aminohapete määramisel kasutatav reaktsioon on ninhüdriini reaktsioon – a-aminohapete värvusreaktsioon, mis viiakse läbi viimaste kuumutamisel ninhüdriini liia leeliselises lahuses.
Ninhüdriin teostab a-aminohapete oksüdatiivset dekarboksüülimist ammoniaagi, süsinikdioksiidi ja aldehüüdi moodustumisega, mis sisaldab ühe süsinikuaatomi vähem kui algne aminohape. Seejärel reageerib redutseeritud ninhüdriin vabanenud ammoniaagi ja teise ninhüdriini molekuliga, moodustades ammoniaagiga värvilise kondensatsiooniprodukti.
Saadud ühend (pigment) on violetse-sinise värvusega (l max = 570 nm). Selle värvilise ühendi moodustumist kasutatakse a-aminohapete kvantitatiivses testis, millega saab tuvastada aminohappeid, isegi nende kogus ei ületa 1 µg.
Proliin ja hüdroksüproliin, millel puudub a-aminorühm, reageerivad ninhüdriiniga, moodustades kollaseid derivaate (l max = 440 nm). Reaktsioon ei ole spetsiifiline, sest ninhüdriiniga värviline toode annab ka ammoniaaki ja aminorühma sisaldavaid ühendeid (amiinid, valgud, peptiidid). Nende ühenditega aga CO 2 ei eraldu. Süsinikdioksiidi eraldumine on iseloomulik ainult a-aminohapetele. Reaktsiooni kasutatakse a-aminohapete kolorimeetriliseks kvantitatiivseks määramiseks, sealhulgas automaatsetes aminohapete analüsaatorites (CO 2 mahu mõõtmine).
Ninhüdriini reaktsiooni kasutatakse glütsiini, isoleutsiini, leutsiini määramiseks; vähem intensiivset värvi annavad seriin, fenüülalaniin, tsüsteiin, türosiin, trüptofaan jne.
Saadud tooteid iseloomustab üsna intensiivne värvus (e = 1,8–3,3 10 4), kuid värvilised tooted on ebastabiilsed. Värvi intensiivsus väheneb kiiresti. Stabiliseerimiseks lisatakse CdCl2. See moodustab saadud ühenditega stabiilsed kompleksid. Kaadmiumkloriid kiirendab ka reaktsiooni.
Aminohapped ja mõned muud aminorühma sisaldavad ühendid kondenseeruvad leeliselises keskkonnas 1,2-naftokinoon-4-sulfoksülaadiga, moodustades punase, kollase, oranži värvi 1,2-naftokinooni monoimiini derivaadid.
Reaktsiooni kasutatakse a-aminohapete (valiin, isoleutsiin, leutsiin jne) määramiseks.
Trüptofaani määramiseks võib kasutada reaktsiooni 4-dimetüülaminobensaldehüüdiga. Reaktsioonisaadus on värvitud lillaks ja värvi intensiivsus määrab trüptofaani sisalduse analüüsitavas lahuses.
Tuleb siiski märkida, et seda reaktsiooni kasutatakse toiduanalüüsis harva.
Väävlit sisaldavate aminohapete kvantitatiivseks määramiseks kasutatakse bromatomeetrilist meetodit, mis põhineb järgmisel reaktsioonil:
Tsüsteiini lahus 1% NaOH lahuses valatakse 0,1 N jahvatatud korgiga kolbi. kaaliumbromaadi lahus, kuiv kaaliumbromiid ja hapestati 10% HCl-ga.
BrO3 - + 5Br - + 6H + → 3Br2 + 3H2O
Reaktsiooni tulemusena tekkinud broom, mille kogus on võrdne kaaliumbromaadi kogusega, reageerib aminohappega. 10 minuti pärast lisatakse kaaliumjodiid, mis reageerib reageerimata broomiga, ja vabanenud jood tiitritakse 0,1 N-ga. naatriumtiosulfaadi lahus, mille indikaatoriks on tärklis.
2I - + Br 2 → Br - + I 2
Tiitrimiseks kasutatud tiosulfaadi kogus on võrdne broomi kogusega, mis ei reageerinud aminohappega. Lisatud kaaliumbromaadi ja tiosulfaadi koguste erinevuse järgi leitakse aminohappega reageerinud broomi kogus ja seega ka aminohappe kogus.
Metioniin määratakse sarnaselt. Metioniin oksüdeeritakse sulfooniks:
See reaktsioon võimaldab teatud tingimustel väga täpselt määrata metioniini sisaldust.
Ja valgud
On teada, et kõigil 20 erinevat kanoonilist α-aminohapet on ühesuguse struktuuriga, funktsionaalrühmade kolm varianti (joonis 3.3). Kahjuks ei ole reaktsioonid amino- ja karboksürühmadele väga spetsiifilised, sest vastavalt kõigile amiinidele, mitmetele amiididele ja karboksüülhapetele. Sama kehtib enamiku nende radikaalide kohta = R, millest 10 on mittepolaarsed, see tähendab, et neid esindavad alifaatsed = süsivesinikrühmad, millest enamik on keemiliselt inertsed. Suhteliselt madal on ka enamiku R-polaarsete aminohapete spetsiifilisus, milles esinevad alkoholi (Ser, Tre, Tyr) amiid (Acn, Gln) ja karboksüülrühmad (Asp, Glu). Aktiivsemad on aminorühm (Liz), imidasool His ja guanidinorühm Arg, samas kui tiorühma Cys aktiivsus on kõrgeim. Seetõttu sai suurima praktilise tähtsuse α-aminohapete kvalitatiivses ja kvantitatiivses analüüsis, sealhulgas aminohapete analüsaatorites, universaalne ninhüdriini reaktsioon, mis on spetsiifiline nii amino- kui ka karboksürühmade samaaegsel esinemisel α-C juures. aatom.
Riis. 3.3. α-aminohapete ja nende polümerisatsiooniproduktide struktuuri üldvalemid. Selgitused tekstis.
α-aminohapete polümerisatsioon peptiidide ja valkude struktuuriks (joonis 3.3) säilitab kõik nende R-tüübid, kuid:
1. Ninhüdriini reaktsioon muutub negatiivseks, kuna välja arvatud N- ja C-ots, kuluvad α-amino- ja α-karboksürühmad peptiidsidemete moodustamiseks. Positiivne ninhüdriini reaktsioon valguga viitab pigem aminohappeliste lisandite olemasolule preparaadis või roogades.
2. Kõigi peptiidide ja valkude puhul on biureedi reaktsioon peptiidirühmale, mis puudub monomeersetes aminohapetes, spetsiifiline.
3. Spetsiifilisematest reaktsioonidest R aminohapetele on kasulikud järgmised: ksantoproteiini reaktsioon kontsentreeritud lämmastikhappega, aromaatse R Phen, Tyr, Tri; reaktsioonid isatiiniga viieliikmelise tsükli Pro jaoks, samuti reaktsioonid imidasooli R His, tiorühma Cys ja guanidinorühma Arg jaoks. Oluline on arvestada, et osa neist R-dest on peidetud valgugloobulite sees ja seetõttu on kvalitatiivsed reaktsioonid neile nõrgenenud. Seetõttu enne nende läbiviimist valgud tavaliselt ühel või teisel viisil denatureeritakse.
4. Erinevalt aminohapete tõelistest lahustest iseloomustab valkude kolloidseid lahuseid settereaktsioonid on seotud nende hüdratatsioonikestade hävimisega ja selle tulemusena nende lahustuvuse vähenemisega vett eemaldavate ainete toimel: neutraalsed soolad = väljasoolamine, metanool = MeOH, etanool = EtOH, atsetoon, uurea ja muud ained.
Kvalitatiivsete reaktsioonide läbiviimisel peaksite:
1. Järgige hoolikalt tuleohutuse eeskirju ning töötage kontsentreeritud hapete ja leelistega = EJ.
2. Märgistage klaasgraafi või viltpliiatsiga 2 rida katseklaase ja asetage ühte neist mitte rohkem kui 0,5 ml (2-5 tilka) 1% aminohappelahust ja ligikaudu sama palju 1% valgulahust. teises.
3. Lisage aminohapete ja valgu lahustega katseklaasi paari paralleelselt 3-5 tilka vastavaid reagente ja tehke ülejäänud vastava reaktsiooni jaoks näidatud protseduurid.
4. Kui on vaja katseklaase soojendada, eemalda tiigli kaas ja pane tikuga põlema kuiv kütus. Seejärel kinnitage katseklaas hoidikusse, mille primitiivne disain on väga ebausaldusväärne. Seetõttu on parem mähkida paar katseklaasi ribaks volditud paberitükiga ja neid pöidlaga hoides lasta katseklaaside alumised pooled ühtlaselt läbi leegi, vältides kaelte suunamist naabritele ja lahuse kiiret keemist. Pärast toimingu lõpetamist kustutage leek õigeaegselt tiigli kaanega.
5. Koostage katsete tulemused vastavalt mallile laborimärkmiku leviku kohta tabeli kujul:
6. Pärast tulemuste läbivaatamist ja protokolli täitmist esitage need koos katseklaaside riiuliga õpetajale kaitsmiseks.
1. Ninhüdriini reaktsioon. Põhineb α-aminohapete deamineerimisel ja dekarboksüülimisel ninhüdriini alkoholilahusega:
Saadud ammoniaak, reageerides kahe ninhüdriini molekuliga, moodustab värvilise derivaadi, mille neeldumismaksimum on 540 nm juures (Pro puhul - 440 nm).
Edusammud: lisage uuritavatele proovidele 3-5 tilka ninhüdriini 0,5% alkoholilahust. Kuumutage katseklaase segudega õrnalt leegil ja registreerige 2-3 minuti pärast värvuse ilmumine.
2. Ksantoproteiini reaktsioon. Nagu eespool mainitud, põhineb see aromaatse R-ga aminohapete nitroderivaatide moodustumisel: Phen, Tyr, Tri.
Edusammud: Lülitades sisse tõmbekapi tõmbe, lisage ettevaatlikult paar tilka kontsentreeritud lämmastikhapet (HNO 3) katselahustega katsutipaari. Kuumutage katseklaase õrnalt leegil, vältides kaelade suunda naabrite poole, ja registreerige värvide areng.
3. Nitroprussiidi reaktsioon. See põhineb väävlit sisaldava aminohappe tsüsteiini leeliselisel hüdrolüüsil koos naatriumsulfiidi (Na 2 S) vabanemisega, mis annab punase kompleksi värskelt valmistatud naatriumnitroprussiidi lahusega.
Edusammud: Lisage mõlemasse katseklaasi võrdne kogus 20% naatriumhüdroksiidi koos 5-10 tilga testlahustega ja keetke vähemalt 3-5 minutit. Lisage katseklaasidesse 3-5 tilka naatriumnitroprussiidi lahust ja registreerige värvuse areng.
4. Biuree reaktsioon. See põhineb peptiidsideme värvilise kompleksi moodustumisel leeliselises keskkonnas Cu 2+ iooniga. Toimib universaalse testina peptiidide ja valkude tuvastamiseks lahustes. Kuna peptiidsidemete arvu suurenemisega suureneb lahuse värvuse intensiivsus lineaarselt, kasutatakse seda laialdaselt valgu kontsentratsioonide fotomeetriliseks määramiseks.
Edusammud. Lisage katseklaasidesse sama kogus 10% naatriumhüdroksiidi lahust koos 5-10 tilga testlahustega. Segage hästi ja lisage 2 tilka 1% vasksulfaadi lahust (CuSO 4). Segage proovid ja registreerige mõne minuti pärast värvide areng.
5. Katse keetmisega. Põhineb valkude termilisel denatureerimisel.
Edusammud. Hapestada mõlemad katseklaasid testlahustega, mis ei sisalda rohkem kui üks tilk 1% äädikhappe (AcOH) lahust, ja kuumutada keemiseni. Pärast lahuste keetmist 2-3 minutit registreerige tulemused ja selgitage nähtuse mehhanismi.
6. Sadestamine raskmetallide sooladega(mina) . Nende denatureerivad omadused põhinevad raskete Me katioonide võimel reageerida valgu molekuli funktsionaalrühmadega R: tio-, amino-, karboksü-, aromaatsed. Samuti põhjustavad nende tugevad anioonid valgumolekulides ionogeensete rühmade taaslaadimist, hävitades seeläbi neis ioonsidemeid.
Edusammud. Lisage mõlemasse katseklaasi paar tilka 5% vasksulfaadi (CuSO 4) lahust. Salvestage ja selgitage tulemusi.
7. Sadestamine orgaaniliste hapetega. Põhineb valkude happelisel denaturatsioonil ja R-aminohapete tio-, amino- ja aromaatsete rühmade kovalentsete derivaatide moodustumisel kloororgaaniliste ainetega.
Edusammud. Lisage mõni tilk 10% trikloroäädikhappe (TCA) lahust katselahustega katseklaasidesse ja registreerige tulemused mõne minuti pärast
Aminohapete määramise meetodid
Aminohapped on bioloogiliselt aktiivsed ained, neil on oluline roll inimorganismi elus, neid kasutatakse laialdaselt ravimitena. Mõned neist on asendamatud ja sisenevad kehasse koos toiduga. Praegu on ravimtaimedes, ravimites ja bioloogilistes vedelikes ning toiduainetes sisalduvate aminohapete kvantitatiivseks määramiseks mitmeid meetodeid.
Erinevate objektide aminohapete kvantitatiivse määramise meetodite hulgast võib eristada nelja põhirühma: kromatograafilised, spektrofotomeetrilised, titrimeetrilised ja elektrokeemilised analüüsimeetodid.
Kromatograafilised meetodid
Viimastel aastakümnetel on aminohapete gaas-vedelikkromatograafia valdkonnas tehtud olulisi edusamme. Pakutakse välja mikropakendatud kolonne kasutav meetod, mis võimaldab suhteliselt lühikese aja jooksul peaaegu täielikult eraldada 17 bioloogiliselt olulist α-aminohapet.
Aminohapete määramiseks gaas-vedelikkromatograafia abil seerumi, plasma, uriini ja tserebrospinaalvedeliku proovides on välja töötatud meetod, mis põhineb 2,3,4,5,6-pentafluorobensoüülisobutüüleetrite valmistamisel, millele järgneb eraldamine polüdimetüülsiloksaankolonnis temperatuuri programmeerimisrežiimis 140°C kuni 250°C leekionisatsioonidetektoriga. Kromatograafilise eraldamise aeg on 28 minutit. Uurimistöö tulemusena õnnestus eraldada 27 aminohapet.
Vaatamata kõrgefektiivse vedelikkromatograafia meetodite mitmekesisusele aminohapete analüüsimisel, on spektrofotomeetrilise tuvastamisega pöördfaasiversioon kõige väljendusrikkam ja ligipääsetavam. Edukaks eraldamiseks ja tuvastamiseks muundatakse aminohapped hüdrofoobseteks ja valgust neelavateks derivaatideks, st viiakse läbi kolonnieelne derivatiseerimine. Derivatiseerimise reagentidena kasutatakse ortoftaalaldehüüdi, naftaleen-2,3-dikarboksüaldehüüdi, 9-fluorenüülmetüülkloroformiaati.
On välja töötatud meetod L-tsüstiini, L-glutamiinhappe ja glütsiini kvantitatiivseks määramiseks ravimis Eltacin, millel on antioksüdantne toime koos antianginaalse toimega. Glutamiinhape ja glütsiin määrati pöördfaasi kõrgefektiivse vedelikkromatograafia abil pärast kolonnieelset derivatiseerimist ortoftaaldehüüdi / N-atsetüül-L-tsüsteiini reagendiga. Tsüsteiini derivatiseerimine on autorite sõnul keeruline aminohappe enda ja sellest tulenevate derivaatide ebastabiilsuse tõttu. Seetõttu viidi tsüsteiini analüüs läbi bromatomeetrilise tiitrimise meetodil. Leiti, et märkimisväärses koguses tsüsteiini esinemine proovis ei sega glütsiini ja glutamiinhappe derivatiseerimise produktide määramist ortoftaaldehüüdi / N-atsetüül-L-tsüsteiini reagendiga. Meetodit iseloomustab kõrge reprodutseeritavus ja määramistäpsus.
Võimalus kasutada 4,7-fenantroliin-5,6-diooni (fankinooni) fluorogeense reagendi märgisena selle derivaatide kolonnieelseks moodustamiseks aminohapete eraldamiseks ja kvantitatiivseks analüüsiks kõrgfektiivse vedelikkromatograafia abil. uurinud. Kuna fankinoon ei oma fluorestsentsi, reageerib see aminohapete aminorühmadega (68 °C juures 160 min), moodustades iminokinoole, mille fluorestsentsi mõõdetakse lainepikkusel 460 nm. Eraldatud derivaadid identifitseeriti Tm-, IR-, massi- ja PMR-spektri abil. Kõrgfektiivne vedelikkromatograafia viidi läbi kromatograafil fluorestsentsdetektoriga ja kolonnis gradientelueerimisega segudega: trietüülamiini lahus - fosfaatpuhver (pH 3) - metanool. Sisestandardina kasutati kinidiini. See meetod on suurte laborite tingimustes üsna paljutõotav ja seda saab kasutada valmis ravimvormide aminohapete analüüsimiseks.
Lüsiini kvantitatiivseks määramiseks on välja töötatud potentsiomeetrilise biosensoriga kõrgsurvevedelikkromatograafia meetod. Biosensor on konstrueeritud lüsiini oksüdaasi sisaldava membraani kinnitamisega ioonselektiivse NH4+ elektroodi külge. Lüsiini ensümaatilisel lagunemisel tekkivad ammooniumiioonid tuvastatakse potentsiomeetriliselt. Kultuurivedelikes sisalduva trüptofaani analüüsimiseks on välja töötatud kromatodensitomeetriline ekspressmeetod. Õhekihikromatograafia viidi läbi Sorbfil plaatidel. Kromatograafia viidi läbi süsteemis propanool-2 - 25% ammooniumhüdroksiidi lahus (7:3) 25 minutit. Kromatogrammid kuivatati toatemperatuuril ja hoiti 120 °C juures 15 minutit. Laigude tuvastamiseks kromatogrammidel kasutati spetsiifilist reaktiivi - trüptofaani indoolitsükli suhtes selektiivset 4-dimetüülaminobensaldehüüdi 0,5% etanoolilahuse kujul, millele oli lisatud 5% kontsentreeritud väävelhapet. Pärast kromatogrammide ilmutamist teflonküvetti sukeldamisega värskelt valmistatud 4-dimetüülaminobensaldehüüdi lahusega hoiti neid 5-7 minutit temperatuuril 110 °C. Trüptofaani laigud skaneeriti lainepikkusel 625 nm, kasutades arvuti videodensitomeetrit. Väljatöötatud meetod on vaatamata kõrgele määramistäpsusele ja produktiivsusele spetsiifiline trüptofaani suhtes.
α-aminohapete analüüsimiseks bioloogilistes vedelikes, ravimites ja toiduainetes kasutatakse laialdaselt kapillaarelektroforeesi meetodeid, mis põhinevad komplekssegu komponentide eraldamisel kvartskapillaaris rakendatud elektrivälja toimel. Kuna aminohapped on oma olemuselt tsvitterioonsed, saab neid eraldada sobiva pH-ga elektrolüüdipuhvrite abil, enamasti kasutatakse neutraalseid ja aluselisi eralduspuhvreid.
Kapillaarelektroforeesi meetodi spetsiifilisuse ja tundlikkuse suurendamiseks üksikute α-aminohapete analüüsimisel kasutatakse nende eelderivatiseerimist, millele järgneb eraldamine kvartskapillaaris ja reaktsiooniproduktide spektrofotomeetriline määramine. Seega kasutatakse derivatiseerivate ainetena 9-fluorenüülmetüülformiaati, 9-(2-karbasool)etüülkloroformiaati ja tsüaniinvärvi. Meetodi väljavaated tulenevad selle eelistest, nagu kiire analüüs, proovi ettevalmistamise lihtsus, väike reaktiivide tarbimine ja instrumentide lihtsus.
Seadmed ja reaktiiv: kromatograafiline paber; kromatograafiline kamber; fotoelektriline kolorimeeter; käärid; klaasplaadid (3x32 cm) - 3 tk.; kromatogrammide hoidik; kuivatuskapp; mikropipetid; maanduskorgiga katseklaasid; bürett 25 ml; aminohapete standardsegu; aminohapete testsegu; butanool, äädikhape, vesi vahekorras 15:3:7; 1% ninhüdriini lahus 95% atsetoonis; etüülalkohol (75%), küllastunud vasksulfaadiga.
Töö lõpetamine
Võtke kromatograafilise paberi leht mõõtmetega 18x28 cm ja tõmmake lihtsa pliiatsiga horisontaaljoon selle lühikesest servast 3 cm kaugusele. Seejärel jagatakse see vastavalt lisatud skeemile ebavõrdseteks segmentideks ning nooltega märgitakse standardi ja katsesegude rakenduspiirid ning vastavad pealdised tehakse lihtsa pliiatsiga.
Paber kinnitatakse lauapinna kohale ja stardijoonele, piiratakse nooltega, standardsegu kantakse esmalt spetsiaalse mikropipetiga õhukese joonena, kuni kogu lahus mikropipetist kantakse stardijoonele (mikropipett on täidetud 2-3 cm). Kasutatud lahuse massi mõõdetakse standardseguga täidetud (enne lahuse pealekandmist) ja tühja (pärast lahuse pealekandmist) pipeti kaalumisega. Tavaliselt kantakse paberile 0,02–0,03 g standardlahust. Seejärel täitke puhas pipett testitava aminohapete seguga (annab õppejõud uuringu jaoks), kaaluge ja kandke segu vastava märgiga stardijoonele.
Valmistatud kromatogramm asetatakse kromatograafiakambrisse, kuhu on eelnevalt valatud lahustite süsteem, et eraldada aminohapete segu, näiteks butanooli, äädikhappe ja vee segu vahekorras 15:3:7. Eraldamine toimub tõusevkromatograafiaga, kuni esijoon ulatub 2-3 cm kaugusele kromatograafilise paberi ülemisest servast (viimistlusjoon). Pärast seda eemaldatakse kromatogramm kambrist ja paberi ülemine ots torgatakse kohe kolmest klaasvardast koosnevasse hoidikusse, mis on kinnitatud kummirõngaga ja asetatakse 20 minutiks tõmbekapisse, et eemaldada paberist lahustid.
Riis. 8. Aminohapete paigutuse skeem kromatogrammil:
A - aminohapete segu pealekandmise punkt; I - tsüstiin ja tsüsteiin;
2 - lüsiin; 3 - histidiin; 4 - arginiin; 5 - asparagiinhape,
seeria ja glütsiin; 6 - glutamiinhape ja treoniin; 7 - alaniin;
8 - proliin; 9 - türosiin; 10 - valiin ja metioniin; II - trüptofaan;
12 - fenüülalaniin; 13 - leutsiin ja isoleutsiin
Kuivatatud kromatogramm kastetakse ninhüdriini 1% lahusesse atsetoonis, et tuvastada sellel aminohappelaikude asukohti. Seejärel asetatakse kromatogramm 10 minutiks tõmbekapisse, et eemaldada atsetoon, ja viiakse ahju, kus see jäetakse 15 minutiks temperatuurile 70 °C seisma. Standardsete ja testsegude aminohapped tuvastatakse sinakasvioletsete laikudena, mis paiknevad ahelas lahustisüsteemi suunas stardijoonest kromatogrammi ülemise servani.
Testsegus sisalduvad aminohapped identifitseeritakse standardse ja testsegu aminohapete poolt hõivatud positsioonide kromatogrammil (joonis 8).
Aminohapete kvantitatiivse sisalduse määramiseks uuritavates segudes joonistatakse kromatogramm lihtsa pliiatsiga nii, et samal tasemel asuvad värvilised tsoonid, mis vastavad samale aminohappele, on ümbritsetud ligikaudu identsete ristkülikutega (joonis 9). .
I II III IV
Riis. 9. Aminohapete paigutuse skeem kromatogrammil:
I - segu nr I; II - segu nr 2; 1U - segu nr 3; Ш - standardne
aminohapete segu
Joonistatud paberilõigud lõigatakse välja ja asetatakse katseklaasidesse, mille numbrid peaksid vastama kromatogrammi täppide arvule. Igasse katseklaasi valatakse büretist 10 ml meesulfaadiga küllastunud 75% etüülalkoholi lahust (500 ml etüülalkoholile lisatakse 0,2 ml vasksulfaadi küllastunud lahust). Katseklaas suletakse korgiga ja perioodiliselt segades saavutatakse telliskivipunase värvuse (Ruemani sinililla vasesool) täielik üleminek paberilt lahusesse. Selleks kulub 15-20 minutit. Standard- ja katselahuste neeldumist (optilist tihedust) mõõdetakse rohelise valguse filtriga (540 nm) fotoelektrokalorimeetril. Võrdlusvoogu paigaldatakse küvett 75% etüülalkoholi ja vasksulfaadi lahusega.
Aminohapete kvantitatiivne sisaldus uuritavas lahuses arvutatakse uuritava ja standardproovi ekstinktsioonide suhte põhjal.
Arvutamise näide. Oletame, et standardsegu sisaldab 1,8 mg glütsiini 1 ml-s, 0,02 g seda standardlahust kantakse lähteribale. Seetõttu saadud kromatogramm (1,8 × 0,02) = 0,036 mg glütsiini. Leppigem veel kokku, et värviliste lahuste neelduvus oli 0,288 standardse ja 0,336 tundmatu segu puhul. Siis on glütsiini sisaldus kromatogrammile kantud katsesegus (36×0,336): 0,288=42 µg. Kui veel eeldada, et kromatogrammile kantakse uuritavat segu näiteks koguses 0,0250 g, siis on glütsiini sisaldus 1 ml uuritavas lahuses (42:0,0250) = 1680 µg ehk 1,68 mg. / ml.
Koostage oma katse tulemused, tehke nendest järeldused.
Labor nr 15
Ioonide eraldamineFe 3+ , co 2+ , Ni 2+