ניתן לזהות חומצות אמינו באמצעות תגובות צבע: נינהידרין, קסנטופרוטאין, פול, מילון, בדיקות ביורטה וכו'. תגובות אלו אינן ספציפיות, מכיוון מבוססים על זיהוי של שברים בודדים במבנה של חומצות אמינו, שיכולים להתרחש גם בתרכובות אחרות.
תגובת נינהידרין, תגובת צבע המשמשת לקביעה איכותית וכמותית של חומצות אמינו, חומצות אימינו ואמינים. בחימום במדיום אלקליני של נינהידרין (טריקטוהידרינדנהידרט, C 9 H b O 4) עם חומרים בעלי קבוצות אמינו ראשוניות (-NH 2), נוצר מוצר בעל צבע כחול-סגול עז יציב עם ספיגה מקסימלית של כ-570 נ"מ. מכיוון שהספיגה באורך גל זה תלויה באופן ליניארי במספר קבוצות האמינו החופשיות, תגובת הנינהדרין שימשה בסיס לקביעה כמותית שלהן על ידי קולורימטריה או ספקטרופוטומטריה. תגובה זו משמשת גם לקביעת קבוצות אמינו משניות (> NH) בחומצות אימינו - פרולין והידרוקסיפרולין; במקרה זה, נוצר מוצר צהוב בהיר. רגישות - עד 0.01%. ניתוח חומצות אמינו אוטומטי מודרני מתבצע על ידי שילוב של הפרדת חילופי יונים של חומצות אמינו וקביעתן הכמותית באמצעות תגובת הנינהדרין. כאשר מפרידים תערובות של חומצות אמינו על ידי כרומטוגרפיה נייר, ניתן לקבוע כל חומצת אמינו בכמות של לפחות 2-5 מיקרוגרם.
ניתן לשפוט את כמות חומצות האמינו לפי עוצמת הצבע.
תגובה זו חיובית לא רק עם חומצות אמינו חופשיות, אלא גם עם פפטידים, חלבונים וכו'.
תגובה xantoproteinמאפשר לך לזהות חומצות אמינו ארומטיות (פנילאלנין, טירוזין, היסטידין, טריפטופן), בהתבסס על התגובה של החלפה אלקטרופילית בגרעין הארומטי (ניטרציה).
תחת הפעולה של חומצה חנקתית מרוכזת, למשל, על טירוזין, נוצר מוצר צהוב.
התגובה של פוהל.זוהי תגובה לציסטאין ולציסטין. במהלך הידרוליזה אלקלית, "הגופרית הקשורה בחלש" בציסטאין ובציסטין מתפצלת בקלות, וכתוצאה מכך נוצר מימן גופרתי, אשר מגיב עם אלקלי נותן נתרן או אשלגן גופרתי. כאשר מוסיפים עופרת(II) אצטט, נוצר משקע אפור-שחור של גופרית עופרת(II).
תיאור הניסיון. יוצקים 1 מ"ל של תמיסת ציסטין לתוך מבחנה, מוסיפים 0.5 מ"ל של תמיסת נתרן הידרוקסיד 20%. התערובת מחוממת לרתיחה, ולאחר מכן מוסיפים 0.5 מ"ל של תמיסת עופרת(II) אצטט. נצפה משקע אפור-שחור של גופרית עופרת(II):
תגובת צימרמן.זוהי תגובה לחומצת האמינו גליצין.
תיאור הניסיון. ל-2 מ"ל של תמיסה 0.1% של גליצין, מותאם על ידי הוספת תמיסה 10% של אלקלי ל-pH = 8, יוצקים 0.5 מ"ל של תמיסה מימית של דיאלדהיד או-פתלי. תערובת התגובה מתחילה להפוך לאט לירוק עז. לאחר מספר דקות מופיע משקעים ירוקים.
תגובה לטריפטופן.טריפטופן, המגיב בסביבה חומצית עם אלדהידים, יוצר תוצרי עיבוי צבעוניים. לדוגמה, עם חומצה גליאוקסילית (שהיא טומאה לחומצה אצטית מרוכזת), התגובה ממשיכה לפי המשוואה:
התגובה של טריפטופן עם פורמלדהיד ממשיכה לפי תכנית דומה.
התגובה של סקאגוצ'י.תגובה זו לחומצת האמינו ארגינין מבוססת על האינטראקציה של ארגינין עם α-naphthol בנוכחות חומר מחמצן. המנגנון שלו עדיין לא הובהר במלואו. ככל הנראה, התגובה מתבצעת לפי המשוואה הבאה:
מכיוון שהנגזרות של הכינונימינים (במקרה זה, נפתוקינון), שבהן המימן של קבוצת האימינו -NH- מוחלף ברדיקל אלקיל או אריל, נצבעות תמיד בגווני צהוב-אדום, אז, כנראה, הכתום-אדום. צבע התמיסה במהלך תגובת Sakaguchi נובע מהופעה של נגזרת נפטוקינונימין בדיוק. עם זאת, האפשרות של היווצרות של תרכובת מורכבת עוד יותר עקב חמצון נוסף של קבוצות ה-NH הנותרות של שאריות הארגינין וטבעת הבנזן של α-naphthol אינה נכללת:
תיאור הניסיון. יוצקים 2 מ"ל מתמיסת 0.01% של ארגינין למבחנה, ולאחר מכן מוסיפים 2 מ"ל מתמיסת 10% של נתרן הידרוקסיד וכמה טיפות של תמיסת אלכוהול 0.2% של α-naphthol. תוכן הצינור מעורבב היטב, מוסיפים 0.5 מ"ל תמיסת היפוברומיט ומערבבים שוב. 1 מ"ל של תמיסת אוריאה 40% מתווסף מיד כדי לייצב את הצבע הכתום-אדום המתפתח במהירות.
תגובה ביורט- משמש כתגובת צבע לחלבונים. בסביבה בסיסית בנוכחות מלחי נחושת(II), הם נותנים צבע סגול. הצבע נובע מיצירת תרכובת קומפלקס נחושת(II), עקב קבוצת הפפטידים -CO-NH-מה שאופייני לחלבונים. תגובה זו קיבלה את שמה מהנגזרת של אוריאה - ביוראט, שנוצרת על ידי חימום אוריאה עם סילוק אמוניה:
בנוסף לחלבונים ולביורט, גם תרכובות אחרות המכילות קבוצה זו נותנות את אותו צביעה: אמידים, אימידים של חומצות קרבוקסיליות, כמו גם תרכובות המכילות קבוצות -CS-NH- או \u003d CH-NH- במולקולה. חלבונים, כמה חומצות אמינו, פפטידים, ביורט ופפטונים בינוניים גם נותנים את התגובה.
צבע הקומפלקס המתקבל בתגובת הביורט עם פפטידים שונים שונה במקצת ותלוי באורך שרשרת הפפטידים. פפטידים באורך שרשרת של ארבע שיירי חומצות אמינו ומעלה יוצרים קומפלקס אדום, טריפפטידים - סגולים ודיפפטידים - כחולים.
צורת קטון של פוליפפטיד
צורת אנול של פוליפפטיד
כאשר הפוליפפטיד יוצר אינטראקציה עם Cu (OH) 2, נוצר קומפלקס, שאת המבנה שלו ניתן להראות כדלקמן.
מאמר זה ישקול שיטות לקביעת חומצות אמינו, המשמשות לא רק בניתוח של מוצרים, אלא בביוכימיה ובניתוח פרמצבטי.
הכמות הכוללת של חומצות אמינו יכולה להתבצע בשיטה פוטומטרית המבוססת על קביעת אמוניה המתקבלת מחומצות אמינו לפי שיטת Kjeldahl.
תגובה עם 1-naphthol. כדי לקבוע ארגינין, היסטידין, טירוזין, הוצעה תגובה עם 1-naphthol. בנוכחות נתרן היפוכלוריט (NaOCl), התמיסה הופכת לאדומה. תמיסה לדוגמה ב-50% אתנול המכילה את חומצת האמינו מקוררת בקרח ומוסיפים תמיסת NaOCl 10% ותמיסת נפתול. תוצר התגובה נצבע באדום (l max = 550 ננומטר). התוכן של חומצות אמינו נקבע על פי עוצמת הצבע של התמיסה המתקבלת.
תגובה ביורט. אחת התגובות החשובות ביותר המשמשות לקביעת חומצות אמינו היא תגובת הביורט. התגובה מתבצעת על ידי הוספת תמיסה מימית מדוללת של מלח נחושת (II) לתמיסה בסיסית של ביורה. במקרה זה, התמיסה הופכת לצבע סגול עז עקב היווצרות תרכובת מורכבת.
תרכובות המכילות לפחות 2 קבוצות אמידים או קבוצת אמינוהידרוקסיאתילן, כמו גם אמידים ואימידים של חומצות אמינו נכנסות לתגובת הביורט. חלבונים ותמיסות מרוכזות של חומצות אמינו ואמידים נותנים תגובה זו. תמיסות מדוללות של חומצות אמינו אינן נותנות תגובה ביורטית ולכן ניתן להשתמש בתגובה כדי לבסס את סופה של הידרוליזה של חלבון. התגובה משמשת גם לקביעה איכותית וכמותית של חלבון. השיטות המשמשות במעבדות אבחון קליניות לקביעת חלבון בדם ובנוזלים ביולוגיים אחרים מבוססות על תגובת הביורט.
תגובת נינהידרין. התגובה השנייה בחשיבותה המשמשת לקביעת חומצות אמינו היא תגובת הנינהרין - תגובת צבע לחומצות א-אמינו, המתבצעת על ידי חימום האחרון בתמיסה בסיסית של עודף נינהרין.
נינהידרין מבצע דה-קרבוקסילציה חמצונית של חומצות אמינו עם היווצרות אמוניה, פחמן דו חמצני ואלדהיד המכיל אטום פחמן אחד פחות מחומצת האמינו המקורית. לאחר מכן הנינהרין המופחת מגיב עם האמוניה המשתחררת ומולקולת הנינהרין השנייה, ויוצר תוצר עיבוי צבעוני עם אמוניה.
לתרכובת שהתקבלה (פיגמנט) יש צבע כחול סגול (l max = 570 ננומטר). היווצרותה של תרכובת צבעונית זו משמשת בבדיקה כמותית לחומצות א-אמינו, באמצעותה ניתן לזהות חומצות אמינו, אפילו שכמותן אינה עולה על 1 מיקרוגרם.
פרולין והידרוקסיפרולין, שאין להם קבוצת א-אמינו, מגיבים עם נינהידרין ויוצרים נגזרות צהובות (l max = 440 ננומטר). התגובה אינה ספציפית, כי מוצר צבעוני עם נינהידרין נותן גם אמוניה ותרכובות המכילות קבוצת אמינו (אמינים, חלבונים, פפטידים). עם זאת, לא משתחרר CO 2 עם תרכובות אלה. שחרור פחמן דו חמצני אופייני רק לחומצות א-אמינו. התגובה משמשת לקביעה כמותית קולורימטרית של חומצות אמינו, כולל בנתחי חומצות אמינו אוטומטיים (מדידה של נפח CO 2).
תגובת הנינהדרין משמשת לקביעת גליצין, איזולאוצין, לאוצין; צבע פחות עז ניתן על ידי סרין, פנילאלנין, ציסטאין, טירוזין, טריפטופן וכו'.
המוצרים המתקבלים מאופיינים בצבע עז למדי (e = 1.8-3.3 10 4), אך המוצרים הצבעוניים אינם יציבים. עוצמת הצבע יורדת במהירות. CdCl 2 מתווסף לייצוב. הוא יוצר קומפלקסים יציבים עם התרכובות המתקבלות. קדמיום כלוריד גם מזרז את התגובה.
חומצות אמינו וכמה תרכובות אחרות המכילות קבוצת אמינו מתעבים במדיום אלקליני עם 1,2-naphthoquinone - 4-sulfoxylate ליצירת נגזרות אדומות, צהובות, בצבע כתום של 1,2-naphthoquinone monoimine.
התגובה משמשת לקביעת חומצות א-אמינו (וואלין, איזולאוצין, לאוצין וכו').
התגובה עם 4-dimethylaminobenzaldehyde יכולה לשמש כדי לקבוע טריפטופן. תוצר התגובה נצבע בסגול ועוצמת הצבע קובעת את תכולת הטריפטופן בתמיסה המנותחת.
עם זאת, יש לציין כי לעתים רחוקות משתמשים בתגובה זו בניתוח מזון.
לקביעה כמותית של חומצות אמינו המכילות גופרית, נעשה שימוש בשיטה ברומטומטרית המבוססת על התגובה הבאה:
תמיסה של ציסטאין בתמיסת NaOH 1% מוזגת לבקבוק עם פקק טחון, 0.1 N. תמיסת אשלגן ברומט, אשלגן ברומיד יבש וחומצה עם 10% HCl.
BrO 3 - + 5Br - + 6H + → 3Br 2 + 3H 2 O
הברום הנוצר כתוצאה מהתגובה, שכמותו שווה ערך לכמות האשלגן ברומט, מגיב עם חומצת האמינו. לאחר 10 דקות, מוסיפים יודיד אשלגן, המגיב עם ברום שלא הגיב, והיוד המשוחרר עובר טיטרציה ב-0.1 N. תמיסת נתרן תיוסולפט עם עמילן כאינדיקטור.
2I - + Br 2 → Br - + I 2
כמות התיוסולפט המשמשת לטיטרציה שווה לכמות הברום שלא הגיבה עם חומצת האמינו. לפי ההבדל בין כמות האשלגן ברומט המוסף לתיוסולפט, נמצא כמות הברום שהגיב עם חומצת האמינו, ומכאן כמות חומצת האמינו.
מתיונין נקבע באופן דומה. מתיונין מחומצן לסולפון:
תגובה זו, בתנאים מסוימים, מאפשרת לך לקבוע במדויק מאוד את התוכן של מתיונין.
וגם חלבונים
ידוע שלכל 20 הזנים של חומצות אמינו קנוניות יש מבנה זהה, עם שלוש גרסאות של קבוצות פונקציונליות (איור 3.3). למרבה הצער, תגובות לקבוצות אמינו וקרבוקסי אינן מאוד ספציפיות, מכיוון בהתאמה, אופייני לכל האמינים, מספר אמידים וחומצות קרבוקסיליות. כך גם לגבי רוב הרדיקלים שלהם = R, ש-10 מהם אינם קוטביים, כלומר, הם מיוצגים על ידי קבוצות פחמימנים אליפטיות, רובן אינרטיות מבחינה כימית. גם הספציפיות של רוב חומצות האמינו הקוטביות R נמוכה יחסית, שבהן מופיעות אלכוהול (Ser, Tre, Tyr) אמיד (Acn, Gln) וקבוצות קרבוקסיל (Asp, Glu). קבוצת האמינו (Liz), האימידאזול His וקבוצת הגואנידינו Arg פעילים יותר, בעוד הפעילות של קבוצת התיו Cys היא הגבוהה ביותר. לכן, תגובת הנינהידרין האוניברסלית, הספציפית לנוכחות בו-זמנית של קבוצות אמינו וקרבוקסיות באטום α-C, קיבלה את המשמעות המעשית הגדולה ביותר בניתוח האיכותי והכמותי של חומצות α, כולל בנתחי חומצות אמינו.
אורז. 3.3. נוסחאות כלליות למבנה של חומצות אמינו α ותוצר הפילמור שלהן. הסברים בטקסט.
פילמור של חומצות אמינו α למבנה של פפטידים וחלבונים (איור 3.3) משמר את כל סוגי ה-R שלהם, אבל:
1. תגובת הנינהדרין הופכת לשלילית, כי למעט ה-N-ו-C-טרמינל, קבוצות α-amino ו-α-carboxy מושקעות ביצירת קשרים פפטידים. תגובה חיובית של נינהידרין עם חלבון מצביעה על נוכחות של זיהומים חומצות אמינו בהכנה או במנות.
2. עבור כל הפפטידים והחלבונים, תגובת הביורט לקבוצת הפפטידים, אשר נעדרת בחומצות אמינו מונומריות, היא ספציפית.
3. מבין התגובות הספציפיות יותר לחומצות אמינו R, הבאות שימושיות: תגובה של xantoprotein עם חומצה חנקתית מרוכזת, ל-R Phe, Tyr, Tri ארומטי; התגובה עם איזטין עבור הטבעת פרו בעלת חמישה איברים, כמו גם ריאקציות עבור האימידאזול R His, קבוצת התיו Cys וקבוצת הגואנידינו Arg. חשוב לקחת בחשבון שחלק מה-R הללו חבויים בתוך כדוריות חלבון, ולכן, התגובות האיכותיות אליהם נחלשות. לכן, לפני שהם מבוצעים, חלבונים בדרך כלל עוברים דנטורציה בצורה כזו או אחרת.
4. בניגוד לתמיסות אמיתיות של חומצות אמינו, תמיסות קולואידיות של חלבונים מתאפיינות ב תגובות משקעהקשורים להרס של קליפות ההידרציה שלהם, וכתוצאה מכך, ירידה במסיסות שלהם בפעולת חומרים מסירי מים: מלחים ניטרליים = המלחה, מתנול = MeOH, אתנול = EtOH, אצטון, אוריאה וחומרים אחרים.
ביצוע תגובות איכותיות, עליך:
1. הקפידו על כללי בטיחות אש ועבדו עם חומצות ואלקליות מרוכזות = EJ.
2. סמן 2 שורות של מבחנות ב-glasgraph או טוש והנח באחת מהן לא יותר מ-0.5 מ"ל (2-5 טיפות) של תמיסת חומצות אמינו 1%, ובערך אותו נפח של תמיסת חלבון 1% באחר.
3. בזוג מבחנות עם תמיסות חומצות אמינו וחלבונים, הוסיפו במקביל 3-5 טיפות מהריאגנטים המתאימים ובצעו את שאר ההליכים המצוינים לתגובה המתאימה.
4. אם יש צורך לחמם את המבחנות, הסר את מכסה כור ההיתוך והעלה באש לייבוש דלק בגפרור. לאחר מכן, מהדקים את המבחנה לתוך המחזיק, שהעיצוב הפרימיטיבי שלו מאוד לא אמין. לכן, עדיף לעטוף זוג מבחנות בפיסת נייר מקופלת ברצועה ולהחזיק אותן באגודל, להעביר באופן שווה את החצאים התחתונים של המבחנות דרך הלהבה, הימנעות מכיוון הצוואר על השכנים ומהרתחה מהירה של התמיסה. לאחר השלמת הפעולה, כבה את הלהבה בזמן עם מכסה כור ההיתוך.
5. תוצאות הניסויים, בהתאם לתבנית, מתווה על פריסת מחברת מעבדהבצורת טבלה:
6. לאחר בחינת התוצאות ולאחר השלמת הפרוטוקול, יחד עם מתלה מבחנות, הציגו אותן למורה להגנה.
1. תגובת נינהידרין.בהתבסס על דמינציה ודקרבוקסילציה של חומצות אמינו α עם תמיסת אלכוהול של נינהידרין:
האמוניה המתקבלת, המגיבה עם שתי מולקולות של נינהידרין, יוצרת נגזרת צבעונית עם מקסימום ספיגה ב-540 ננומטר (עבור Pro - 440 ננומטר).
התקדמות: הוסף 3-5 טיפות של תמיסת אלכוהול 0.5% של ninhydrin לדגימות הנבדקות. מחממים בעדינות את המבחנות עם תערובות על להבה ולאחר 2-3 דקות רושמים את הופעת הצבע.
2. תגובה של Xantoprotein.כפי שהוזכר לעיל, הוא מבוסס על היווצרות של נגזרות ניטרו של חומצות אמינו עם R ארומטי: Phen, Tyr, Tri.
התקדמות: הפעלת הטיוטה של קולט האדים, הוסף בזהירות כמה טיפות של חומצה חנקתית מרוכזת (HNO 3) לזוג מבחנות עם תמיסות בדיקה. מחממים בעדינות את המבחנות על להבה, הימנעות מכיוון הצוואר אל השכנים, ורושמים את התפתחות הצבע.
3. תגובה ניטרופרוסיד.הוא מבוסס על הידרוליזה בסיסית של חומצת האמינו ציסטאין המכילה גופרית, עם שחרור של נתרן גופרתי (Na 2 S), הנותן קומפלקס אדום עם תמיסה טרייה שהוכנה של נתרן ניטרופוסיד.
התקדמות:הוסף נפח שווה של 20% נתרן הידרוקסיד לשתי המבחנות עם 5-10 טיפות של תמיסות בדיקה והרתיח במשך 3-5 דקות לפחות. הוסף 3-5 טיפות תמיסת סודיום ניטרופרוסיד למבחנות ותעד את התפתחות הצבע.
4. תגובת ביורט.הוא מבוסס על היווצרות בתווך אלקליני של קומפלקס צבעוני של קשר פפטיד עם יון Cu 2+. משמש כבדיקה אוניברסלית לזיהוי פפטידים וחלבונים בתמיסות. מכיוון שעם עלייה במספר קשרי הפפטיד, עוצמת הצבע של התמיסה עולה באופן ליניארי, נעשה בה שימוש נרחב לקביעה פוטומטרית של ריכוזי חלבון.
התקדמות. הוסף את אותה כמות של תמיסת 10% נתרן הידרוקסיד למבחנות עם 5-10 טיפות של תמיסות בדיקה. מערבבים היטב ומוסיפים 2 טיפות של תמיסת סולפט נחושת 1% (CuSO 4). מערבבים את הדוגמאות ולאחר מספר דקות רושמים את התפתחות הצבע.
5. בודקים עם הרתחה.מבוסס על דנטורציה תרמית של חלבונים.
התקדמות. חממו את שתי המבחנות בתמיסות בדיקה עם לא יותר מטיפה אחת של תמיסת חומצה אצטית (AcOH) 1% וחממו לרתיחה. לאחר הרתחת התמיסות במשך 2-3 דקות, רשמו את התוצאות והסבירו את מנגנון התופעה.
6. משקעים עם מלחים של מתכות כבדות(לִי) . תכונות הדנטורציה שלהם מבוססות על יכולתם של קטיוני Me כבדים להגיב עם קבוצות פונקציונליות R של מולקולת החלבון: תיאו-, אמינו-, קרבוקסי-, ארומטי. כמו כן, האניונים החזקים שלהם גורמים לטעינה מחדש של קבוצות יונוגניות במולקולות חלבון, ובכך להרוס את הקשרים היוניים בהן.
התקדמות. הוסף כמה טיפות של תמיסת 5% של נחושת גופרתית (CuSO 4) לשתי המבחנות עם תמיסות הבדיקה. רשום והסבר את התוצאות.
7. משקעים עם חומצות אורגניות.הוא מבוסס על דנטורציה חומצה של חלבונים ויצירת נגזרות קוולנטיות של קבוצות תיאו, אמינו וארומטיות של חומצות אמינו R עם אורגנוכלוריינים.
התקדמות. הוסף כמה טיפות של תמיסה 10% של חומצה טריכלורואצטית (TCA) למבחנות עם תמיסות בדיקה ורשום את התוצאות תוך מספר דקות
שיטות לקביעת חומצות אמינו
חומצות אמינו הן חומרים פעילים ביולוגית, הן ממלאות תפקיד חשוב בחיי גוף האדם, הן נמצאות בשימוש נרחב כתרופות. חלקם הכרחיים ונכנסים לגוף עם מזון. כיום קיימות מספר שיטות לקביעה כמותית של חומצות אמינו בחומרי צמחי מרפא, בתרופות ובנוזלים ביולוגיים ובמוצרי מזון.
מכל מגוון השיטות לקביעה כמותית של חומצות אמינו בעצמים שונים, ניתן להבחין בארבע קבוצות עיקריות: שיטות ניתוח כרומטוגרפיות, ספקטרופוטומטריות, טיטרימטריות ואלקטרוכימיות.
שיטות כרומטוגרפיות
במהלך העשורים האחרונים חלה התקדמות משמעותית בתחום כרומטוגרפיית גז-נוזל של חומצות אמינו. מוצעת שיטה באמצעות עמודות ארוכות במיקרו, המאפשרת להפריד כמעט לחלוטין 17 חומצות α-אמינו חשובות ביולוגית בזמן קצר יחסית.
פותחה שיטה לקביעת חומצות אמינו באמצעות כרומטוגרפיית גז-נוזל בדגימות של סרום, פלזמה, שתן ונוזל מוחי, המבוססת על הכנת 2,3,4,5,6-pentafluorobenzoyl-isobutyl ethers, ולאחר מכן הפרדה על עמודה של polydimethylsiloxane במצב תכנות טמפרטורה מ 140°C עד 250°C עם גלאי יינון להבה. זמן ההפרדה הכרומטוגרפי הוא 28 דקות. כתוצאה ממחקר, ניתן היה להפריד בין 27 חומצות אמינו.
למרות מגוון השיטות של כרומטוגרפיה נוזלית בביצועים גבוהים בניתוח חומצות אמינו, גרסת הפאזה הפוכה עם זיהוי ספקטרופוטומטרי היא האקספרסיבית והנגישה ביותר. להפרדה וזיהוי מוצלחים, חומצות אמינו מומרות לנגזרות הידרופוביות וסופגות אור, כלומר, מתבצעת נגזרת טרום-עמודה. בתור ריאגנטים עבור derivatization, אורטופטלאלדהיד, נפתלין-2,3-dicarboxyaldehyde, 9-fluorenylmethylchloroformate משמשים.
פותחה שיטה לקביעה כמותית של L-cystine, L-glutamic acid ו-glycine בתרופת Eltacin, בעלת פעילות נוגדת חמצון בשילוב עם אפקט אנטי-אנגינלי. חומצה גלוטמית וגליצין נקבעו על ידי כרומטוגרפיית נוזלים עם ביצועים גבוהים בפאזה הפוכה לאחר נגזרת טרום-עמודה עם ריאגנט אורטופטלאלדהיד/N-אצטיל-L-ציסטאין. דריווטיזציה של ציסטאין, לדברי המחברים, קשה בגלל חוסר היציבות של חומצת האמינו עצמה והנגזרות הנובעות מכך. לכן, הניתוח של ציסטאין בוצע בשיטת טיטרציה ברומטומטרית. נמצא כי נוכחות של כמויות משמעותיות של ציסטאין בדגימה אינה מפריעה לקביעת תוצרי הנגזרת של גליצין וחומצה גלוטמית עם מגיב האורתופתאלדהיד / N-אצטיל-L-ציסטאין. השיטה מאופיינת בשחזור גבוה ובדיוק קביעה.
האפשרות להשתמש ב-4,7-phenanthroline-5,6-dion (fanquinone) כתווית ריאגנט פלואורגני ליצירת טרום-עמודה של נגזרותיו להפרדה וניתוח כמותי של חומצות אמינו על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים. מְחוֹשָׁב. פנוקווינון אינו בעל קרינה משלו, מגיב עם קבוצות אמינו של חומצות אמינו (ב-68 מעלות צלזיוס למשך 160 דקות), ויוצר אימינוקינולים, שהקרינה שלהם נמדדת באורך גל של 460 ננומטר. הנגזרות המבודדות זוהו על ידי ספקטרום Tm, IR, מסה ו-PMR. כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בוצעה על גבי כרומטוגרף עם גלאי ניאון ועמודה עם פליטת שיפוע עם תערובות: תמיסת טריאתילאמין - חיץ פוספט (pH 3) - מתנול. קווינידין שימש כתקן פנימי. שיטה זו מבטיחה למדי בתנאים של מעבדות גדולות וניתן להציע אותה לניתוח חומצות אמינו בצורות מינון מוגמרות.
פותחה טכניקה לכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים עם ביוחיישן פוטנציומטרי לקביעה כמותית של ליזין. החיישן הביולוגי נבנה על ידי הצמדת ממברנה המכילה ליזין אוקסידאז לאלקטרודת NH4+ סלקטיבית ליונים. יוני האמוניום הנוצרים במהלך הפירוק האנזימטי של ליזין מתגלים בצורה פוטנציומטרית. פותחה שיטת אקספרס כרומטודנסימטרית לניתוח טריפטופן בנוזלים תרבותיים. כרומטוגרפיה של שכבה דקה בוצעה על צלחות סורבפיל. כרומטוגרפיה בוצעה במערכת propanol-2 - תמיסת אמוניום הידרוקסיד 25% (7:3) למשך 25 דקות. הכרומטוגרמות יובשו בטמפרטורת החדר ונשמרו על 120 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. כדי לזהות כתמים בכרומטוגרמות, נעשה שימוש במגיב ספציפי - 4-דימתיל-אמינובנזלדהיד, סלקטיבי לטבעת האינדול של טריפטופן, בצורה של תמיסת אתנול 0.5% בתוספת חומצה גופרתית מרוכזת 5%. לאחר פיתוח הכרומטוגרמות על ידי טבילה בקובטת טפלון עם תמיסה טרייה של 4-דימתיל-אמינובנזלדהיד, הן נשמרו במשך 5-7 דקות בטמפרטורה של 110 מעלות צלזיוס. כתמי טריפטופן נסרקו באורך גל של 625 ננומטר באמצעות דנסימטר וידאו מחשב. השיטה שפותחה, למרות הדיוק הגבוה בנחישות ובפרודוקטיביות, היא ספציפית לטריפטופן.
לניתוח של חומצות אמינו α בנוזלים ביולוגיים, תרופות ומוצרי מזון, נעשה שימוש נרחב בשיטות אלקטרופורזה נימיות, המבוססות על הפרדת מרכיבי תערובת מורכבת בנימי קוורץ תחת פעולת שדה חשמלי מיושם. מכיוון שחומצות אמינו הן בטבען צווטריוני, ניתן להפריד אותן באמצעות מאגרי אלקטרוליטים בעלי pH מתאים, לרוב משתמשים במאגרי הפרדה ניטרליים ובסיסיים.
על מנת להגביר את הספציפיות והרגישות של השיטה של אלקטרופורזה נימית לניתוח של חומצות α-אמינו בודדות, נעשה שימוש בנגזרת ראשונית שלהן, ולאחר מכן הפרדה בנימי קוורץ וקביעה ספקטרופוטומטרית של תוצרי התגובה. לפיכך, 9-פלוארניל-מתיל פורמט, 9-(2-קרבזול)-אתיל כלורופורמט וצבע ציאנין משמשים כחומרי נגזרת. הסיכויים של השיטה נובעים מיתרונותיה כמו ניתוח מהיר, קלות הכנת הדגימה, צריכה נמוכה של ריאגנטים וקלות המכשור.
ציוד וריאגנט: נייר כרומטוגרפי; תא כרומטוגרפי; קולורימטר פוטואלקטרי; מספריים; צלחות זכוכית (3x32 ס"מ) - 3 יח'; מחזיק לכרומטוגרמות; ארון ייבוש; מיקרופיפטות; מבחנות עם פקקים טחונים; בורט 25 מ"ל; תערובת סטנדרטית של חומצות אמינו; תערובת בדיקה של חומצות אמינו; בוטנול, חומצה אצטית, מים ביחס 15:3:7; תמיסה של 1% של נינהידרין ב-95% אצטון; אלכוהול אתילי (75%), רווי בסולפט נחושת.
השלמת העבודה
קח דף נייר כרומטוגרפי בגודל 18X28 ס"מ וצייר קו אופקי בעיפרון פשוט במרחק של 3 ס"מ מהקצה הקצר שלו. לאחר מכן הוא מחולק למקטעים לא שווים בהתאם לתכנית המצורפת וגבולות היישום של התקן ותערובות הבדיקה מסומנים בחצים והכתובות המתאימות נעשות בעיפרון פשוט.
הנייר מקובע מעל פני השולחן ועל קו הזינוק, מוגבל בחצים, מורחים תחילה את התערובת הסטנדרטית בעזרת מיקרופיפטה מיוחדת בקו דק עד שכל התמיסה מהמיקרופיפטה מועברת לקו הזינוק (מילוי המיקרופיפטה). 2-3 ס"מ). המסה של התמיסה המיושמת נמדדת על ידי שקילת הפיפטה המלאה בתערובת הסטנדרטית (לפני מריחת התמיסה) וריקה (לאחר מריחת התמיסה). בדרך כלל מורחים 0.02-0.03 גרם מהתמיסה הסטנדרטית על הנייר. לאחר מכן מלאו פיפטה נקייה בתערובת חומצות האמינו לבדיקה (ניתן על ידי המורה ללימוד), שקלו אותה ומרחו את התערובת על קו ההתחלה עם הסימון המתאים.
הכרומטוגרמה המוכנה ממוקמת בתא כרומטוגרפי עם מערכת ממסים שנשפכה לתוכו קודם לכן כדי להפריד בין תערובת של חומצות אמינו, למשל, תערובת של בוטנול, חומצה אצטית ומים ביחס של 15:3:7. ההפרדה מתבצעת בכרומטוגרפיה עולה עד שהקו הקדמי מגיע ל-2-3 ס"מ לקצה העליון של הנייר הכרומטוגרפי (קו הסיום). לאחר מכן, הכרומטוגרמה מוסרת מהתא והקצה העליון של הנייר מוכנס מיד למחזיק העשוי משלושה מוטות זכוכית המחוברים בטבעת גומי ומניחים במנדף למשך 20 דקות כדי להסיר ממסים מהנייר.
אורז. 8. סידור של חומצות אמינו בכרומטוגרמה:
A - נקודה של החלת תערובת של חומצות אמינו; I - ציסטין וציסטאין;
2 - ליזין; 3 - היסטידין; 4 - ארגינין; 5 - חומצה אספרטית,
סדרה וגליצין; 6 - חומצה גלוטמית ותראונין; 7 - אלנין;
8 - פרולין; 9 - טירוזין; 10 - ולין ומתיונין; II - טריפטופן;
12 - פנילאלנין; 13 - לאוצין ואיזולאוצין
את הכרומטוגרמה המיובשת טובלים בתמיסה של 1% של נינהידרין באציטון כדי לזהות את מיקומם של כתמי חומצות אמינו עליה. לאחר מכן הכרומטוגרמה ממוקמת למשך 10 דקות במנדף כדי להסיר אצטון ומועברת לתנור, שם היא נשארת למשך 15 דקות ב-70 מעלות צלזיוס. חומצות אמינו של תערובות התקן והתערובות הנבדקות מתגלות ככתמים כחולים-סגולים המסודרים בשרשרת לכיוון מערכת הממס מקו ההתחלה לקצה העליון של הכרומטוגרמה.
זיהוי חומצות האמינו הכלולות בתערובת הבדיקה מתבצע בצירוף מקרים בכרומטוגרמה של העמדות בהן תופסות חומצות האמינו של תערובות התקן ותערובות הבדיקה (איור 8).
כדי לקבוע את התוכן הכמותי של חומצות אמינו בתערובות הבדיקה, מציירים את הכרומטוגרמה בעיפרון פשוט כך שהאזורים הצבעוניים השוכנים על אותה מפלס, המתאימים לאותה חומצת אמינו, מוקפים בתוך מלבנים זהים בערך (איור 9). .
I II III IV
אורז. 9. סידור של חומצות אמינו על הכרומטוגרמה:
I - תערובת מס' I; II - תערובת מס' 2; 1U - תערובת מס' 3; Ш - סטנדרטי
תערובת חומצות אמינו
קטעי הנייר המתוארים נחתכים ומניחים במבחנות, שמספרן צריך להתאים למספר הכתמים בכרומטוגרמות. 10 מ"ל של תמיסה 75% של אלכוהול אתילי רווי בדבש סולפט מוזגים לכל מבחנה מבורה (0.2 מ"ל של תמיסה רוויה של גופרת נחושת מתווספת ל-500 מ"ל אלכוהול אתילי). המבחנה נסגרת בפקק ועם ערבוב מעת לעת מושג מעבר מלא של הצבע האדום-לבנים (מלח נחושת של כחול-סגול של רומן) מהנייר לתוך התמיסה. זה לוקח 15-20 דקות. הספיגה (צפיפות אופטית) של תמיסת התקן והבדיקה נמדדת בפוטו-אלקטרוקלורימטר עם מסנן אור ירוק (540 ננומטר). קובטה עם תמיסה של 75% של אלכוהול אתילי עם גופרת נחושת מותקנת בזרם הייחוס.
התכולה הכמותית של חומצות אמינו בתמיסת הבדיקה מחושבת מהיחס בין ההכחדות של הבדיקה והדגימות הסטנדרטיות.
דוגמא חישוב. נניח שהתערובת הסטנדרטית מכילה 1.8 מ"ג גליצין ב-1 מ"ל, 0.02 גרם מתמיסה סטנדרטית זו מורחים על רצועת ההתחלה. לכן, הכרומטוגרמה שהתקבלה (1.8×0.02) = 0.036 מ"ג גליצין. הבה נסכים עוד שהספיגה של התמיסות הצבעוניות הייתה 0.288 עבור הסטנדרט ו-0.336 עבור התערובת הלא ידועה. אז תכולת הגליצין בתערובת הבדיקה המיושמת על הכרומטוגרמה תהיה (36'0.336): 0.288=42 מיקרוגרם. אם נניח עוד שתערובת הבדיקה מיושמת על הכרומטוגרמה בכמות של, למשל, 0.0250 גרם, אז תכולת הגליצין ב-1 מ"ל מתמיסת הבדיקה תהיה (42: 0.0250) = 1680 מיקרוגרם, או 1.68 מ"ג. / מ"ל.
צייר את תוצאות הניסוי שלך, הסיק מהן מסקנות.
מעבדה מס' 15
הפרדת יוניםFe 3+ , שיתוף 2+ , ני 2+