8860 0
Praegu on teada umbes 40 erinevat rekombinantse DNA rakkudesse viimise meetodit, mis lahendavad plasmamembraani läbimise probleemi erineval viisil. Seni puudub rekombinantse DNA rakkudesse viimise meetodite ühtne klassifikatsioon. Iga arvustuste autor klassifitseerib omal moel, võib-olla seetõttu, et paljude empiiriliselt leitud meetodite puhul pole membraani ületamise mehhanism ikka veel selge, näiteks transformatsiooniks. Ebakindlust on ka terminoloogiaga, mis kiiresti areneva uue teadus- ja praktikavaldkonna puhul pole üllatav.
Igal meetodil võõr-DNA rakkudesse toimetamiseks on oma omadused, eelised ja puudused rakkude ellujäämise, manustamise tõhususe, mitmekülgsuse ja tehniliste rakendusvõimaluste osas. Meetodi valik sõltub peremeesrakkude tüübist ja kasutatava vektori tüübist, samuti eksperimenteerija isiklikest eelistustest ja võimalustest. Allpool käsitletakse üksikasjalikult mõningaid kõige tuntumaid DNA sihtrakkudesse viimise meetodeid.
Transformatsioon selle kõige üldisemas tähenduses on vaba DNA rakku viimise protsess. Kitsamas tähenduses kasutatakse seda terminit peamiselt seoses bakteritega, mis tähistab rekombinantse DNA imendumise protsessi kompetentsete rakkude poolt, mis on indutseeritud rakumembraani temperatuurifaasi üleminekuga. E. coli on rekombinantse DNA-ga töötamisel kõige levinum organism ning plasmiidse DNA rakkudesse viimise tagamiseks hoitakse rakke jääkülma CaCl2 ja DNA lahusega ning seejärel allutatakse 42 °C kuumašokile. ~1 min.
Ilmselt toimub sellise ravi tulemusena rakuseina lokaalne hävimine. Transformatsiooni efektiivsus, mis on määratletud kui transformantide arv 1 µg lisatud DNA kohta,
samas kui see on ligikaudu 10000–10000000. Selle meetodi efektiivsus on madal, transformeeritakse ligikaudu vähem kui 0,1% rakkudest, kuid see puudus kompenseeritakse selektsiooniskeemide kasutamisega, mis võimaldavad teil soovitud kloonid kiiresti tuvastada.
Rakke, mis on võimelised absorbeerima võõr-DNA-d, nimetatakse kompetentseteks. Nende rakkude osakaal populatsioonis on tavaliselt väga väike, kuid seda saab suurendada spetsiaalse toitekeskkonna, kultiveerimistingimuste ja keemilise pädevuse indutseerijate abil (valitud reeglina empiiriliselt). Pädevate rakkude valmistamisel sageli kasutatav etapp on sferoplastide tootmine – rakud, millel on osaliselt või täielikult (protoplastid), millel puudub välimine jäik rakuseina.
Näiteks on see ainus viis, kuidas tõhusalt transformeerida paljusid grampositiivseid baktereid perekondadest Bacillus, Listeria, Streptommyces jne. Mõned pärmi transformatsioonimeetodid hõlmavad ka pärmi rakuseina ensümaatilise eemaldamise etappe glükosidaaside abil. Organismide jaoks, mis on resistentsed keemiliste indutseerijate suhtes või millel puudub loomulik pädevus, kasutatakse muid DNA kohaletoimetamise süsteeme.
Konjugatsioon. On olemas bakteriaalsed plasmiidid (konjugatiivsed plasmiidid), millel on võime luua rakkudevahelisi kontakte, mille kaudu nad liiguvad ühest rakust teise. Kontaktide tekkimise doonor- ja retsipientrakkude vahel tagavad plasmiidide konjugatiivsed omadused ning DNA ülekande enda mobilisatsiooniomadused. Sel juhul võib konjugatiivne plasmiid kanda tavalist plasmiidvektorit, mis asub samas rakus.
Seega on võimalik muul viisil transformeerida retsipientrakke, mida on raske muundada. Näiteks on näidatud laia peremeesorganismi leviala süstikvektori pAT187 mobilisatsiooni ülekandmist E. coli-st erinevatele grampositiivsetele bakteritele (perekonnad Bacillus, Enterococcus, Staphylococcus jne), kuigi palju väiksema efektiivsusega kui ülekandel erinevate vahel. E. coli tüved.
Lisaks on hiljuti demonstreeritud DNA konjugatiivse ülekandmise võimalust bakterirakkudest kultiveeritud loomarakkudesse. Konjugeerimise käigus kantakse üle ainult üks doonorplasmiidi ahel, millel seejärel sünteesitakse teine ahel. Selle tulemuseks on see, et peremeesrestriktsiooniensüümid ei rünnata konjugatiivselt ülekantud plasmiidi. Selle meetodi efektiivsus bakterite puhul on võrreldav transformatsiooni omaga.
Viirusnakkus. Viirustel põhinevate vektorite sisestamiseks kasutatakse laialdaselt peremeesraku loomulikku nakkusteed, mis sõltuvad viiruse tüübist.
perforatsiooni meetodid. Üks populaarsemaid meetodeid nukleiinhapete sihtrakkudesse viimiseks on elektroporatsioon – ajutine pooride loomine lipiidide kahekihilises membraanis lühiajalisel kokkupuutel elektriväljaga. See on universaalne füüsiline transformatsioonimeetod, mille tehnika on välja töötatud peaaegu igat tüüpi raku jaoks.
E. coli-ga töötamisel asetatakse valmistatud rakususpensioon (~50 µl) ja DNA elektroodide vahele ning rakendatakse üks vooluimpulss kestusega ~4,5 ms pingel 1,8 kV, elektroodide vaheline kaugus on 1 mm. Pärast sellist töötlemist tõuseb transformatsiooni efektiivsus väikeste plasmiidide (~3-6 kb) puhul 109-1011-ni ja suurte (~135 kb) puhul kuni 106-ni. Sarnaseid tingimusi kasutatakse BAC vektori sisestamiseks E. colisse.
Kõrgepingelahenduse elektroporatiivne toime kahekihilisele lipiidmembraanile sõltub ilmselt selle kõverusraadiusest. Seetõttu neelavad väikesed bakterirakud tõhusalt DNA-d palju suurema väljatugevusega (12–18 kV/cm) kui suured looma- ja taimerakud, mis neelavad tõhusalt DNA-d väljatugevuse 1–2 kV/cm juures. Elektroporatsioon on kõige lihtsam, tõhusam ja reprodutseeritav meetod DNA molekulide viimiseks rakkudesse, mis aga nõuab spetsiaalset elektroporaatorit.
Muud perforatsioonimeetodid DNA viimiseks rakku: rakkude töötlemine ultraheliga, rakkude kraapimine substraadilt eksogeense materjali juuresolekul, rakkude tsentrifuugimine söötmes DNA-ga koos elektroporatsiooniga, plasmamembraani osmootne perforatsioon, rakusond laser-mikrokiirega, poore moodustava streptolüsiin-O toksiini kasutamine.
Transfektsioon. Algselt tähendas see termin viiruse DNA viimist rakkudesse, nüüd on selle tähendus laienenud ja tähendab mis tahes võõr-DNA viimist eukarüootsetesse rakkudesse. Termin "transformatsioon", mis tähistab prokarüootide ja pärmseente jaoks DNA rakku sisestamise protsessi, osutus ebamugavaks, kuna loomarakkude puhul on transformatsioon normaalsete rakkude muundumine vähirakkudeks. Kitsas tähenduses mõistetakse transfektsiooni üldiselt kui DNA sisestamist eukarüootsetesse rakkudesse, kasutades erinevaid keemilisi reagente.
Üks esimesi tõhusaks transfektsiooniks välja töötatud meetodeid oli DNA inkubeerimine DEAE-dekstraaniga. Saadud efektiivsus oli võrreldav bakterite transformatsiooniga ja saavutas 106 transfektanti µg DNA kohta.
DEAE-dekstraani toimemehhanism ei ole täielikult kindlaks tehtud, kuid on teada, et see seondub DNA-ga ja rakumembraaniga, stimuleerides pinotsütoosi (joonis 2.8), kuigi rakud seda ise ei omasta. Meetodi puudused hõlmavad DEAE-dekstraani toksilisust teatud tüüpi rakkudele, efektiivsuse sõltuvust preparaadi kvaliteedist ja stabiilsete transfektantide saamise väga madalat sagedust.
Riis. 2.8. DNA sisestamise skeem erinevate komplekside osana rakku endotsütoosi teel: fagotsütoos ja pinotsütoos (a). Mittelipiidsest polükatioonist pärineva osakese skemaatiline esitus seotud DNA-ga dendrovormis, mille negatiivse laengu kompenseerib katioonne polümeer (b)
Transfektsiooni efektiivsust suurendas 10-100 korda rakkude inkubeerimine kaltsiumfosfaadiga sadestatud DNA-ga. DNA kaltsiumsademe tihedad osakesed imenduvad rakus fagotsütoosi teel (joonis 2.8), kuid ainult väike osa läbistavatest molekulidest jõuab tuuma ja integreerub kromosomaalsesse DNA-sse. Kaltsiumfosfaadi meetod on tõhusam ja odavam, kuid põhjustab DNA molekulide purunemist, mis muudab ringikujulised molekulid lineaarseks, viiruste transfektsiooni korral mõnikord mittenakkuslikuks. Lisaks tuleb kaltsiumfosfaadiga transfektsiooni tingimused valida iga sihtraku jaoks eraldi.
Teiste transfektsioonireaktiivide otsimisel leiti, et liigset katioonset laengut kandvad polümeeri molekulid võivad oluliselt tõsta transfektsiooni efektiivsust. Polümeersed katioonid moodustavad nukleiinhapetega stabiilseid neutraliseeritud laengutega komplekse, mis suudavad suure efektiivsusega transportida DNA-d ja RNA-d rakku, kaitstes teel tuuma endonukleaaside toime eest (joonis 2.9).
Riis. 2. 9. DNA transpordi skeem raku tuuma polükatiooni-DNA kompleksi osana, mis on seotud ligandi vahendatud endotsütoosiga spetsiifilise ligandiga
Lineaarse või hargnenud konformatsiooniga (dendriitne vorm) sünteetilised mittelipiidsed polümeersed katioonid võivad kondenseerida DNA ja RNA suhteliselt väikesteks osakesteks, mis seejärel seonduvad rakumembraaniga ja sisenevad rakku mittespetsiifilise endotsütoosi teel. Praegu kasutatakse transfektsiooniks mittelipiidsete polükatioonide, peamiselt polüetüleenimiini, polüamidoamiinide ja nendel põhinevate dendrimeeride rühmast, katioonseid valke nagu polülüsiin, protamiin ja histoonid, aga ka mitmesuguseid kaubanduslikke tooteid, nagu PAMAM.
Revolutsiooniks oli Feigneri (Feigner, 1987) jt sünteesitud esimese madala toksilise katioonse lipiidi DOTMA (1,2-dioleüül-3-N,N,N-trimetüülaminopropaan) kasutuselevõtt praktikas. Transfektsiooni efektiivsus katioonse lipiidiga (joonis 2.10) oli ligikaudu 100 korda suurem kui mis tahes muu kemikaaliga, suure osakaaluga stabiilseid transgeenseid rakke.
Riis. Joonis 2. 10. DNA-ga kompleksi struktuur (a) ja katioonse lipiidpolümeeri üldstruktuur (b). Katioonsed lipiidpolümeerid (lineaarsed ja hargnenud), mis on struktuurilt ja omadustelt sarnased rakumembraani fosfolipiididega, moodustavad DNA-ga komplekse mitmekihiliste katioonsete liposoomide kujul (a) reagentide lihtsal segamisel. Sellised kompleksid sisenevad rakku endotsütoosi või lipiidiosa kaudu rakumembraaniga liitumise teel.
Samal ajal võeti praktikas kasutusele uus termin "lipofektsioon", mis rõhutab rakkude geneetilise transformatsiooni kõrget efektiivsust, tuues lipiid-katioonsed kompleksid lähemale nakkusohtlikele viirusosakestele.
Sellele edule tuginedes on nende ühendite (lipofektiin, lipofektamiin, tsellufektiin jne) välja töötatud arvukalt variatsioone.
Paralleelselt töötati välja DNA või RNA-ga täidetud fosfolipiidide liposoomidel põhinevad kohaletoimetamisvahendid.
Tehismembraanide väikesed sfäärid võivad sulanduda rakkude plasmamembraanidega või sattuda endotsütoosi teel, vabastades sisu rakku. Liposomaalse transfektsiooni madalat efektiivsust suurendas fosfolipiidide, näiteks kardiolipiini ja fosfatidüületanoolamiini viimine liposoomide struktuuri, mis koos kahekihiliste membraanidega moodustavad ka ümberpööratud mitsellaarstruktuure, mida nimetatakse kuup- ja kuusnurkseteks faasideks ja mis on võimelised initsieerima membraani. sulandumine.
Liposomaalne meetod on üsna kapriisne ja nõuab konkreetsete rakkude tõhusaks transfektsiooniks kõigi tingimuste hoolikat valimist. Lisaks kahjustab kapseldamise protseduur, tavaliselt ultrahelitöötlus, sageli suuri DNA molekule.
Transfektsioonireaktiivide väljatöötamise uueks etapiks on olnud nukleiinhapete efektiivsema ja sihipärasema kohaletoimetamise väljatöötamine spetsiifilistesse sihtrakkudesse, viies sünteetiliste transfektsioonireaktiivide ja liposoomide struktuuri membraani retseptorvalkudega seondumiseks erinevaid ligande. Selliste rakuliste retseptorite poolt äratuntavate sihtrühmade (ligandide) olemasolu võimaldab kasutada ligandi vahendatud endotsütoosi mehhanisme (vt joonis 2.9).
Selliste ligandidena kasutatakse retseptorite poolt äratuntavaid valke ja peptiide; oligosahhariidid, kuna paljude loomarakkude pinnal on lektiinid - retseptorvalgud, mis neid spetsiifiliselt seovad; polüsahhariidid. Selliste sihitud DNA (RNA) transfektsioonireagendi komplekside rakkudega suhtlemise protsessid on sarnased viirusosakeste tungimisega rakku.
Praegu pakuvad biotehnoloogiaettevõtted laias valikus erinevaid transfektsioonireagente – kõige lihtsamatest ja odavamatest kuni uusimate arendusteni, mis on spetsialiseerunud erinevatele rakutüüpidele ja ülesannetele. Samuti jätkub intensiivselt uute, veelgi tõhusamate transfektsioonireaktiivide loomine.
Mikroinjektsioon - mikronõelaga läbistatakse rakumembraan ja DNA-d sisaldav lahus süstitakse raku tsütoplasmasse või siis otse tuuma, kui tuum on piisavalt suur (näiteks munaraku tuum). DNA mikrosüstimine imetajarakkudesse sai võimalikuks 0,1-0,5 mikronise läbimõõduga mikropipettide valmistamise seadme ja mikromanipulaatori tulekuga. Meetod on väga tõhus, stabiilse integratsiooni ja süstitud geenide ekspressiooniga rakkude osakaal võib ulatuda 50%-ni. Kirjeldatud meetodi eeliseks on ka see, et see võimaldab sisestada mis tahes DNA-d mis tahes rakkudesse ning sisestatud geeni säilitamiseks rakkudes pole vaja selektiivset survet.
Ballistiline transfektsioon, bioballistika või biolistika (mikroosakeste pommitamine) põhineb rakkude pommitamisel umbes 1-2 mikroni suuruste mikrosfääridega, mis on kaetud DNA-ga. Kasutatakse kulla, volframi (mõnikord fütotoksilise), silikooni ja erinevate sünteetiliste nanosfääride mikroosakesi. DNA-ga kaetud mikroosakesed läbivad rakukihte ja kannavad geneetilise konstruktsiooni otse raku organellidesse ja tuumadesse. Sel eesmärgil loodud „geenipüstol“ (geenipüstol) ehk „geenipüstol“, mille J. Sanford töötas välja 1987. aastal DNA viimiseks teraviljadesse, on oma konstruktsioonilt sarnane pneumaatiliste relvadega (joonis 2.11). .
Riis. 2.11. Rekombinantse DNA sisestamine taimelehtedesse, kasutades Bio-Rad korduvkasutatavat geenipüstoli (a) ja selle üldist skeemi (b). Heeliumiimpulss väljutab proovikapslist DNA või RNA-ga kaetud mikroosakesed. DNA-d kandvaid mikroosakesi kiirendatakse ja fokusseeritakse maksimaalseks tungimiseks rakkudesse, liikudes piki kiirenduskanalit ja piki püstoli toru, samal ajal kui laia väljapääsu juures hajub heeliumivool difuusselt külgedele. Filtri vaherõngas hoiab sihtmärgi tabamiseks optimaalset kaugust maksimaalse heeliumi eemaldamisega, et minimeerida kahjustavat mõju raku pinnale.
Mikroosakeste läbitungimissügavus on reeglina väike - kuni 1 mm, kuid kestade eemaldamise eritingimustes võivad mikroosakesed tungida kudedesse 4-5 mm sügavusele ja kanda geene näiteks vöötlihaskiududesse. Ballistiline transfektsioon on väga tõhus isegi siis, kui paksud rakuseinad (pärm, taimed) takistavad paljudel muudel manustamisviisidel ning seda rakendatakse kudedele, organitele ja isegi tervetele organismidele. Praegu kasutatakse seda laialdaselt geeniteraapias transgeensete loomade ja taimede saamiseks.
Transfektsiooni vahendite ja meetodite mitmekesisus on tingitud erinevatest ülesannetest, laiast hulgast sihtrakkudest ja rakkudesse toimetatud nukleiinhapete tüüpidest, aga ka ühiskonna vajadusest hankida üha tõhusamaid vahendeid geneetilise informatsiooni rakkudesse toimetamiseks. , kuded ja terved organismid. Erilist tähelepanu pööratakse transfektsioonireaktiivide ja -meetodite väljatöötamisele seoses inimese geeniteraapia silmatorkavate väljavaadetega, mis nõuavad sihipäraseid, ülitõhusaid ja ohutuid geenide kohaletoimetamise vahendeid.
Võõra DNA stabiilne ja mööduv sisenemine rakku. Pärast rekombinantse DNA sisestamist eukarüootsesse rakku jõuab ainult väike osa sellest tuuma, kuna tuumamembraan on võõrale DNA-le tohutu barjäär. Tuumas võib rekombinantne DNA olla integreeritud kromosoomi või eksisteerida mõnda aega kromosoomivälises olekus.
Sellest lähtuvalt eristatakse stabiilset transfektsiooni, mil rekombinantne DNA integreerub retsipientrakkude kromosoomidesse ja muutub nende lahutamatuks osaks, ning ajutist või mööduvat transfektsiooni, mille käigus eksisteerivad rekombinantsed DNA molekulid ja transkribeeritakse tuumadesse kromosoomivälises rakkudes. seista lühikeseks ajaks. Sisestatud võõr-DNA stabiilne pärand on peamine tingimus transgeensete organismide majanduslikel eesmärkidel saamiseks.
Seetõttu pööratakse erilist tähelepanu DNA rakkudesse viimise meetodite väljatöötamisele, mis toob kaasa suurema osa stabiilsete transformantide tootmise. Lisaks võimaldab suur protsent stabiilseid transformante loobuda selektiiv- ja markergeenidest, mis on transgeensete organismide loomisel ballastiks.
ON. Voinov, T.G. Volova
Sissejuhatus
1 Geenitehnoloogia ensüümide peamised rühmad
1.1 Restriktsiooniensüümid
1.1.1 Piirangute toimemehhanism
1.1.2 Piirangukaartide koostamine
1.3 Ligaasid
2 Uue geeni sisestamine rakku
2.1 Geeniekspressiooni reguleerimine prokarüootides
2.2 Meetodid geeni otseseks sisestamiseks rakku
2.3 Geenide sisestamine imetajarakkudesse
2.4 Imetajate somaatiliste rakkude geneetiline transformatsioon
2.5 Geeniteraapia
2.6 Transgeensete loomade saamine
Järeldus
Bibliograafia
Sissejuhatus
Geenitehnoloogia on funktsionaalselt aktiivsete geneetiliste struktuuride (rekombinantne DNA) in vitro konstrueerimine ehk teisisõnu kunstlike geneetiliste programmide loomine (Baev A. A.). E. S. Piruzyani sõnul on geenitehnoloogia eksperimentaalsete meetodite süsteem, mis võimaldab konstrueerida laboris (katseklaasis) tehislikke geneetilisi struktuure nn rekombinantsete või hübriidsete DNA molekulide kujul.
Me räägime suunatud, etteantud programmi järgi molekulaarsete geneetiliste süsteemide ülesehitamisest väljaspool keha koos nende hilisema sissetoomisega elusorganismi. Sel juhul muutub rekombinantne DNA retsipientorganismi geneetilise aparaadi lahutamatuks osaks ja annab sellele uued ainulaadsed geneetilised, biokeemilised ja seejärel füsioloogilised omadused.
Rakendusliku geenitehnoloogia eesmärk on kujundada sellised rekombinantsed DNA molekulid, mis geeniaparaati viides annaksid kehale inimesele kasulikud omadused.
Rekombinantne DNA tehnoloogia kasutab järgmisi meetodeid:
DNA spetsiifiline lõhustamine restriktsiooninukleaaside abil, kiirendades üksikute geenide eraldamist ja manipuleerimist;
Puhastatud DNA fragmendi kõigi nukleotiidide kiire järjestamine, mis võimaldab määrata geeni ja selle poolt kodeeritud aminohappejärjestuse piirid;
Rekombinantse DNA konstrueerimine;
Nukleiinhapete hübridisatsioon, mis võimaldab tuvastada spetsiifilisi RNA või DNA järjestusi suurema täpsuse ja tundlikkusega, lähtudes nende võimest siduda komplementaarseid nukleiinhappejärjestusi;
DNA kloonimine: in vitro amplifikatsioon polümeraasi ahelreaktsiooniga või DNA fragmendi sisestamine bakterirakku, mis pärast sellist transformatsiooni reprodutseerib seda fragmenti miljonites koopiates;
Rekombinantse DNA sisestamine rakkudesse või organismidesse.
Geenitehnoloogia ajalugu
Geenitehnoloogia ilmus tänu paljude teadlaste tööle biokeemia ja molekulaargeneetika erinevates valdkondades. Palju aastaid on valke peetud makromolekulide peamiseks klassiks. Oli isegi oletus, et geenid on valgulise iseloomuga. Alles 1944. aastal näitasid Avery, McLeod ja McCarthy, et DNA on päriliku teabe kandja. Sellest ajast alates algas intensiivne nukleiinhapete uurimine. Kümmekond aastat hiljem, 1953. aastal, lõid J. Watson ja F. Crick kaheahelalise DNA mudeli. Seda aastat peetakse molekulaarbioloogia sünniaastaks.
1950. ja 1960. aastate vahetusel selgitati välja geneetilise koodi omadused ja 1960. aastate lõpuks kinnitati selle universaalsus katseliselt. Toimus intensiivne molekulaargeneetika areng, mille objektideks olid E. coli, selle viirused ja plasmiidid. Intaktsete DNA molekulide, plasmiidide ja viiruste kõrgelt puhastatud preparaatide eraldamiseks on välja töötatud meetodid. Viiruste ja plasmiidide DNA viidi rakkudesse bioloogiliselt aktiivsel kujul, tagades selle replikatsiooni ja vastavate geenide ekspressiooni. 70ndatel avastati mitmeid ensüüme, mis katalüüsivad DNA transformatsiooni reaktsioone. Geenitehnoloogia meetodite väljatöötamisel mängivad erilist rolli restriktsiooniensüümid ja DNA ligaasid.
Geenitehnoloogia arengu ajalugu võib jagada kolme etappi. Esimene etapp on seotud rekombinantsete DNA molekulide in vitro saamise põhimõttelise võimaluse tõestamisega. Need tööd käsitlevad hübriidide tootmist erinevate plasmiidide vahel. Tõestati rekombinantsete molekulide loomise võimalus erinevate bakteriliikide ja -tüvede algsete DNA molekulide abil, nende elujõulisus, stabiilsus ja funktsioneerimine.
Teine etapp on seotud rekombinantsete DNA molekulide saamise tööga prokarüootide kromosomaalsete geenide ja erinevate plasmiidide vahel, tõestades nende stabiilsust ja elujõulisust.
Kolmas etapp on töö algus eukarüootsete geenide, peamiselt loomsete geenide, lisamisel vektor-DNA molekulidesse (DNA, mida kasutatakse geeniülekandeks ja mida on võimalik integreerida retsipientraku geneetilisse aparatuuri).
Formaalselt tuleks geenitehnoloogia sünniajaks pidada aastat 1972, mil P. Berg, S. Cohen, H. Boyer ja kaastöötajad lõid Stanfordis esimese rekombinantse DNA, mis sisaldas SV40 viiruse, bakteriofaagi ja E. coli DNA fragmente. Ülikool.
1 Geenitehnoloogia ensüümide peamised rühmad
Geenitehnoloogia on molekulaargeneetika järglane, kuid selle sünni võlgneb geneetilise ensümoloogia ja nukleiinhapete keemia edusammudele, kuna ensüümid on molekulaarse manipuleerimise vahendid. Kui vahel saame mikromanipulaatoritega töötada rakkude ja rakuorganellidega, siis DNA ja RNA makromolekulidega töötamisel ei aita ka kõige väiksemad mikrokirurgilised instrumendid. Mida teha? Ensüümid toimivad "skalpelli", "kääride" ja "õmblemise niitidena".
Ainult nemad suudavad leida teatud nukleotiidide järjestusi, "lõigata" sinna molekuli või, vastupidi, teha DNA ahelasse augu. Need ensüümid on rakus töötanud pikka aega, täites DNA replikatsiooni (kahekordistamise) tööd raku jagunemise ajal, kahjustuste parandamise (molekuli terviklikkuse taastamise), geneetilise informatsiooni lugemise ja rakust rakku ülekandmise protsessides. või raku sees. Geeniinseneri ülesanne on valida ensüüm, mis täidaks püstitatud ülesandeid ehk saaks töötada nukleiinhappe kindla lõiguga.
Tuleb märkida, et geenitehnoloogias kasutatavad ensüümid ei ole liigispetsiifilised, mistõttu saab katse läbiviija enda valitud järjestuses ühendada mis tahes päritolu DNA fragmendid ühtseks tervikuks. See võimaldab geenitehnoloogial ületada looduse poolt rajatud liigitõkked ja teostada liikidevahelist ristumist.
Rekombinantse DNA konstrueerimisel kasutatavad ensüümid võib jagada mitmeks rühmaks:
DNA fragmente tootvad ensüümid (restriktsiooniensüümid);
Ensüümid, mis sünteesivad DNA-d DNA (polümeraasi) või RNA (pöördtranskriptaasi) matriitsil;
DNA fragmente ühendavad ensüümid (ligaasid);
Ensüümid, mis võimaldavad muuta DNA fragmentide otste struktuuri.
1.1 Restriktsiooniensüümid
On üldtunnustatud, et mõisteid "restriktsiooniensüüm", "restriktsiooni endonukleaas" ja "kohaspetsiifiline endodesoksüribonukleaas" peetakse sünonüümidena.
Kõik bakteriaalsed restriktsiooniendonukleaasid tunnevad ära spetsiifilised, üsna lühikesed DNA järjestused ja seonduvad nendega. Selle protsessiga kaasneb DNA molekuli lõikamine kas äratundmiskohas endas või mõnes teises kohas, mille määrab ensüümi tüüp. Koos restriktsiooniaktiivsusega on bakteritüvel võime metüülida DNA-d; seda protsessi iseloomustab sama spetsiifilisus DNA järjestuste kui restriktsiooni puhul. Metülaas lisab metüülrühmad adeniini või tsütosiini jääkidele samas kohas, kus restriktsiooniensüüm seondub. Metüleerimise tulemusena muutub sait piirangute suhtes resistentseks. Seetõttu kaitseb metüülimine DNA-d lõikamise eest.
Seal on 3 peamist piirangute klassi: 1, 2 ja 3.
Kõik restriktsiooniensüümid tunnevad ära rangelt määratletud järjestused kaheahelalisel DNA-l, kuid 1. klassi restriktsiooniensüümid viivad läbi katkestusi DNA molekuli suvalistes punktides ning 2. ja 3. klassi restriktsiooniensüümid tunnevad ära ja lõikavad DNA ära rangelt määratletud punktides. äratundmiskohtades või neist kindlal kaugusel.kaugus.
1. ja 3. tüüpi ensüümidel on keeruline subühiku struktuur ja neil on kahte tüüpi aktiivsus - modifitseeriv (metüleeriv) ja ATP-sõltuv endonukleaas.
Teise klassi ensüümid koosnevad 2 eraldi valgust: restriktsiooni endonukleaas ja modifitseeriv metülaas, seetõttu kasutatakse geenitehnoloogias ainult klassi 2 ensüüme. Nad vajavad kofaktoritena magneesiumiioone.
Praegu on eraldatud üle 500 2. klassi restriktsiooni, kuid erinevatest mikroorganismidest eraldatud ensüümide hulgas on neid, mis tunnevad DNA-l ära samad järjestused. Selliseid paare või rühmi nimetatakse isoshisomeerideks. Tõelist isoskizomerismi eristatakse, kui ensüümid tunnevad ära sama nukleotiidjärjestuse ja lõhuvad DNA samades punktides, ja vale, kui ensüümid, tundes ära sama koha DNA-s, teevad katkestused samas kohas erinevates punktides.
Enamik 2. klassi restriktaase tunneb ära järjestused, mis sisaldavad 4 kuni 6 nukleotiidipaari, seega jagatakse restriktaasid väikese ja suure lõikega. Väikese lõikega restriktsiooniensüümid tunnevad ära tetranukleotiidi ja toovad molekulidesse palju rohkem katkestusi kui suure lõikega restriktsiooniensüümid, mis tunnevad ära kuuest nukleotiidipaarist koosneva järjestuse. See on tingitud asjaolust, et teatud nelja nukleotiidi järjestuse esinemise tõenäosus on palju suurem kui kuue nukleotiidi järjestuse esinemise tõenäosus. Näiteks bakteriofaagi T7 40 000 bp DNA-l puudub järjestus, mida R1 tunneb ära E. coli-st.
Väikese lõhenemise restriktaasid hõlmavad Hpa II ja Alu (Arthrobacter luteusest), suure lõhenemisega - Eco R I (Escherichia colist) ja Hind III. Kui eeldada, et restriktsiooniensüümi äratundmissaidid on DNA ahelas jaotunud juhuslikult, siis neljast nukleotiidist koosnevat järjestust (saiti) tuvastavate ensüümide sihtmärk peaks esinema keskmiselt 1 kord iga 256 aluspaari kohta ning kuut nukleotiidi ära tundvate ensüümide sihtmärk. 4096 aluspaari. Kui restriktsioonisait on geeni sees, viib DNA restriktsiooniensüümiga töötlemine selle inaktiveerimiseni. Sellise sündmuse tõenäosus on väga suur, kui seda töödeldakse väikese lõikega restriktaasidega, ja ebaoluline, kui kasutatakse suure lõikega endonukleaase. Seetõttu tehakse intaktse geeni saamiseks lõhustamist vaheldumisi mitme suurelõikelise restriktaasiga või kasutatakse "alapiirangu" meetodit, s.t. restriktsioon viiakse läbi tingimustes, kus lõhustamine toimub ainult ühes kohas.
1.1.1 Piirangute toimemehhanism
4-6 aluspaarist koosnevad palindroomid – restriktsioonisaidid – toimivad sageli sihtmärkidena (tuvastuskohad). Restriktsiooni tuvastamise punktid on 180 °C pöörlemise suhtes sümmeetrilised, see tähendab, et nukleotiidjärjestus vasakult paremale ühes ahelas on sama, mis teisest ahelast paremalt vasakule. Sümmeetria tähendab, et need, mida tuleks metüleerida, esinevad mõlemal DNA ahelal. Selle tulemusena võib sihtkoht olla täielikult metüülitud (mõlemad ahelad modifitseeritud), poolmetüleeritud (ainult üks ahel metüülitud) või metüleerimata.
Täielikult metüleeritud sait ei ole piiratud ega muudetud. Restriktsiooniensüüm ei tunne poolmetüleeritud saiti ära, kuid metülaasi abil saab selle täielikult metüleeritud saidiks muuta. Bakterites seostatakse metüülimist tavaliselt olemasoleva modifikatsiooni oleku säilitamisega. Täielikult metüleeritud DNA replikatsioon viib poolmetüleeritud DNA moodustumiseni. On tõenäoline, et hemimetüleeritud saitide äratundmine on metülaasi in vivo toimimise normaalne samm.
Metüleerimata sihtkoht on substraat kas restriktsiooni või modifitseerimise jaoks in vitro. Rakus on modifitseerimata DNA suurema tõenäosusega piiratud. Lõikamisreaktsioon viiakse läbi kahes etapis. Kõigepealt lõigatakse üks DNA ahel ja seejärel teine kõrvuti. Lõikekoha mõlemal küljel külgnevatel aladel võib toimuda eksonukleootiline lagunemine. Toimub tõhus ATP hüdrolüüs, mille rolli pole veel välja selgitatud.
Kuidas tunneb ensüüm ära ühe koha, kuid lõikab teise, üsna kauge koha? Oluline on märkida, et valk ei eraldu kunagi DNA molekulist, millega see algselt oli seotud. Kui ensüümi inkubeeritakse modifitseeritud ja modifitseerimata DNA seguga, lõikab see eelistatavalt modifitseerimata DNA. Seetõttu ei eraldu valk sidumissaiti tuvastades metüleerimata DNA-st, et leida lõikamissaiti.
On kaks alternatiivset mudelit, mis selgitavad äratundmis- ja lõhustamiskohtade seost: ühe järgi liigub ensüüm, teise mudeli järgi DNA. Kui ensüüm liigub, jätkub selle liikumine mööda DNA-d, kuni ta valib lõikekoha. Kui DNA liigub, jääb ensüüm kinnituvastuskohas kinni ja DNA tõmmatakse läbi ensüümi teise sidumissaidi ning see jätkub, kuni ensüüm jõuab lõikekohani (veel iseloomustamata). Saadi elektronmikroskoopia andmed, mis näitavad, et ensüüm põhjustab DNA-s ahela moodustumist ja jääb pärast lõikamist ilmselt seotuks äratundmiskohaga; need andmed kinnitavad teist mudelit.
1.1.2 Piirangukaartide koostamine
Restriktsiooniensüümidest on saanud tõhus uurimisvahend. Need võimaldavad väga suuri DNA molekule muuta mitmesajast kuni mitme tuhande aluse pikkuseks fragmentide komplektiks. Agaroosgeelelektroforeesi meetodil (vt 1. jagu) saab erineva suurusega DNA fragmente kergesti eraldada ja seejärel iga fragmenti eraldi uurida.
Lühikesed fragmendid rändavad palju kiiremini kui pikad. Suhteliselt kõrge agaroosi kontsentratsiooni korral ei suuda suured killud geelist üldse läbi tungida. Migratsiooni käigus restriktsioonifragmendid ei lagune, neid saab elueerida (välja pesta) bioloogiliselt aktiivsete kaheahelaliste molekulide kujul. Geelide värvimine DNA-d siduvate värvidega paljastab ribade komplekti, millest igaüks vastab restriktsioonifragmendile, mille molekulmassi saab määrata teadaoleva molekulmassiga DNA-ga kalibreerimise teel.
Pärast genoomi teatud piirkonna töötlemist restriktsiooninukleaaside komplektiga saadud DNA fragmentide suuruste võrdlemine võimaldab koostada restriktsioonikaardi, mis näitab iga restriktsioonisaidi asukohta teiste piirkondade suhtes.
5000 aluspaari (bp) pikkune DNA molekul. töödeldi eraldi restriktsiooniensüümidega A ja B. Fragmendid eraldati elektroforeesiga. Ensüüm A lõikas DNA neljaks 2100, 1400, 1000 ja 500 aluspaari suuruseks fragmendiks. Restriktsiooniensüüm B andis 3 fragmenti: 2500, 1300 ja 1200 bp. (joonis 37). Nende ensüümide restriktsioonisaitide asukoha määramiseks kasutatakse järgmise sammuna kahekordse lõhustamise protseduuri – DNA-d töödeldakse kahe endonukleaasiga. Uuritud fragmendi samaaegne töötlemine kahe restriktaasiga andis 6 fragmenti: 1900, 1000, 800, 600, 500, 200 bp.
Riis. 1. Elektroforeesi tulemused pärast DNA fragmendi töötlemist erinevate restriktsiooniensüümidega
Kõige täiuslikum võimalus on elueerida iga lõhustamisel saadud fragment ühe restriktsiooniensüümiga ja seejärel töödelda seda teise fragmentiga. Pärast seda töötlemist saadud fragmentide segu analüüsitakse ka elektroforeesiga. Meie näites saadi järgmised tulemused:
Iga nelja A-fragmendi töötlemine restriktsiooniensüümiga B
2100–1900 ja 200,
1400–800 ja 600,
500–500 (muutusteta)
Iga kolme B-fragmendi töötlemine restriktsiooniensüümiga A
2500–1900 ja 600
1300–800 ja 500
1200–1000 ja 200
Saadud tulemuste analüüs näitab, et kõiki ensüüme, mis on saadud A-fragmentide seedimisel restriktsiooniensüümiga B, saab tuvastada proovides, mis on saadud B-fragmentide seedimisel restriktsiooniensüümiga A. Kattuvad fragmendid on restriktsioonikaardistamise võti. Selles näites on need B-fragment 2100 ja A-fragment 2500. Teise restriktsiooniensüümiga töötlemisel annavad nad fragmendi 1900.
Nende fragmentide poolitamise andmete põhjal eeldame, et ühelt poolt 200 aluspaari kaugusel. fragmendist 1900 on järgmine A-koht ja teisest otsast 600 aluspaari kaugusel. - järgmine B-koht (joonis 38). Kahe endonukleaasiga töötlemisel 200 bp fragment moodustub 1 kord, kui seda töödeldakse B-fragmendi 1200 restriktsiooniensüümiga A, st fragment 1200 asub vasakul. Jääb veel kindlaks teha, kuidas kaart paremale läheb. Ilmselgelt on see A-fragment 1400, kuna restriktsiooniensüüm B lõikab selle fragmentideks 600 ja 800. Ilmselgelt tuleks fragment 1300 fragmendist 2500 paremale kõrvale jätta. Siis A-fragmendi 500 olemasolu ja B jagunemine. - fragment 1300 restriktsiooniensüümi A abil 800-ks ja 500-ks.
Restriktsioonikaartide koostamisel kasutatakse tavaliselt mitmeid restriktsiooniensüüme, mistõttu on vaja analüüsida erinevate ensüümide toimel saadud fragmentide vahelisi keerulisi seoseid. Mittetäielikku poolitamist saab kasutada kaardistamise protseduuri lihtsustamiseks. Teatud tingimustel ei tunne restriktsiooniensüüm ära ega lõika DNA molekulis kõiki saite. Näiteks DNA osalise lõhustamise korral ensüümi A abil võib moodustuda 3100 bp, 1400 bp pikkuseid fragmente. ja 500 p. Võrreldes neid täielike poolitusandmetega (2100, 1400, 1000 ja 500), saame kohe 2100 ja 1000 kõrvuti panna (fragment 3100). Ja olles saanud killu 3500 - koht 2100 b.p. ja 1400 lk.
Riis. 2. Restriktsioonifragmendi analüüs ja DNA fragmentide kaart
Teine meetod on radioaktiivse otsamärgise kasutuselevõtt. Lõppfragmendid määratakse sel juhul märgise lisamisega. Samuti saate fragmente sobitada nukleiinhapete hübridiseerimise teel. Kattuvad fragmendid (antud juhul 2100 ja 2500) hübridiseeruvad.
Esimene kaart oli SV40 viiruse (pahaloomulist transformatsiooni põhjustav ahviviirus) jaoks, mis sisaldas 5423 aluspaari. Kasutati restriktsiooniensüümi Hind-II, mis lõikab viiruse tsirkulaarse DNA 11 fragmendiks. Nende paigutuse järjekord DNA-s tehti kindlaks, uurides fragmentide komplekte, mis moodustuvad lõhustumise lõppedes. Esimene katkestus muutis rõngamolekuli lineaarseks, mis seejärel lagunes järjest väiksemateks fragmentideks. Kõigepealt uuriti kattuvate fragmentide komplekte ja seejärel täieliku lõhustumise saadusi. Nii saadi tsirkulaarse viiruse DNA restriktsioonikaart, millele rakendati restriktsiooniensüümi lõikamissaite. Korrates sarnaseid katseid teise restriktsiooniensüümiga, saab üksikasjalikuma kaardi, kus on märgitud palju restriktsioonisaite.
Selle teabe abil on võimalik tuvastada DNA-s bioloogiliselt olulisi piirkondi. Kuna restriktsioonikaart peegeldab konkreetse nukleotiidjärjestuse asukohta antud piirkonnas, võimaldab kahe või enama seotud geeni kaartide võrdlemine hinnata nendevahelist homoloogiat. Restriktsioonikaarte analüüsides on võimalik võrrelda erinevate loomaliikide DNA teatud lõike ilma nende nukleotiidjärjestust määramata. Nii näiteks leiti, et inimese, orangutani ja šimpansi hemoglobiiniahelaid kodeerivad kromosoomipiirkonnad on viimase 5-10 miljoni aasta jooksul (alates liikide lahknemisest) jäänud praktiliselt muutumatuks.
Piirangute kaardistamine võimaldab näha suuri geneetilisi muutusi, nagu deletsioonid või insertsioonid. Sel juhul toimub restriktsioonifragmentide vähenemine või suurenemine, samuti restriktsioonisaitide kadumine või ilmumine.
Üks kaardistamistehnikatest on sõrmejälg ("sõrmejälje meetod" või DNA-sõrmejälg). See tähendab korratute ja mittetäielike fragmentide komplektide kasutamist, mis on genoomile iseloomulikud, kuigi see ei kirjelda seda täielikult.
1.2 Pöördtranskriptaas
Pöördtranskriptaasi kasutatakse mRNA transkribeerimiseks DNA komplementaarseks ahelaks. Retroviiruste, mille genoomi esindavad üheahelalised RNA molekulid, uurimisel leiti, et rakusisese arengu käigus läbib retroviirus oma genoomi kaheahelalise DNA kujul kaheahelalise DNA kromosoomidesse integreerimise etapi. peremeesrakk. 1964. aastal esitas Temin hüpoteesi viirusspetsiifilise ensüümi olemasolu kohta, mis on võimeline sünteesima RNA matriitsil komplementaarset DNA-d. Sellise ensüümi eraldamiseks tehtud jõupingutusi kroonis edu ning 1970. aastal avastasid Temin ja Mizutani, aga ka neist sõltumatult, soovitud ensüümi ekstratsellulaarsete Rousi sarkoomiviiruse virioonide preparaadis. Seda RNA-sõltuvat DNA polümeraasi nimetatakse pöördtranskriptaasiks või revertaasiks.
Kõige üksikasjalikumalt on uuritud lindude retroviiruste revertaasi. Iga virion sisaldab umbes 50 selle ensüümi molekuli. Pöördtranskriptaas koosneb kahest subühikust - a (65 kDa) ja b (95 kDa), mis esinevad ekvimolaarsetes kogustes. Pöördtranskriptaasil on vähemalt kolm ensümaatilist aktiivsust:
1) DNA polümeraas, kasutades matriitsina nii RNA-d kui ka DNA-d;
2) RNaas H aktiivsus, hüdrolüüsib RNA-d RNA-DNA hübriidis, kuid mitte ühe- või kaheahelalist RNA-d;
3) DNA endonukleaasi aktiivsus.
Esimesed kaks tegevust on vajalikud viiruse DNA sünteesiks ja endonukleaas näib olevat oluline viiruse DNA integreerimiseks peremeesraku genoomi. Puhastatud pöördtranskriptaas sünteesib DNA nii RNA kui ka DNA matriitsidel. Sünteesi alustamiseks vajab reversetaas, nagu ka teised polümeraasid, lühikest kaheahelalist piirkonda (praimerit). Praimer võib olla nii RNA kui ka DNA üheahelaline segment, mis reaktsiooni käigus seotakse kovalentselt äsja sünteesitud DNA ahelaga.
Riis. 3. RNA molekulide kaheahelaliste DNA koopiate sünteesi skeem
Pöördtranskriptaasi kasutatakse valdavalt messenger-RNA transkribeerimiseks komplementaarseks DNA-ks (cDNA). Pöördtranskriptsiooni reaktsioon viiakse läbi spetsiaalselt valitud tingimustes, kasutades tugevaid RNaasi aktiivsuse inhibiitoreid. Sel juhul on võimalik saada sihtmärk-RNA molekulide täispikad DNA koopiad. Oligot (dT) kasutatakse praimerina polü(A)-d sisaldava mRNA pöördtranskriptsiooniks ja RNA molekulide jaoks, millel ei ole 3"-polü(A) otsad, keemiliselt sünteesitud oligonukleotiide, mis on komplementaarsed 3"-otsaga. kasutatakse uuritud RNA-d. Pärast komplementaarse DNA ahela sünteesi mRNA-l ja RNA hävitamist (tavaliselt kasutatakse leelistöötlust) sünteesitakse DNA teine ahel. Sel juhul kasutatakse reversetaasi võimet moodustada üheahelalise cDNA 3' otstes isekomplementaarseid juuksenõelu, mis võivad toimida praimerina.
Matriitsiks on cDNA esimene ahel. Seda reaktsiooni võivad katalüüsida nii reversetaas kui ka E. coli DNA polümeraas I. On näidatud, et nende kahe ensüümi kombinatsioon võimaldab suurendada täielike kaheahelaliste cDNA molekulide saagist. Pärast sünteesi lõppemist jäävad cDNA esimene ja teine ahel kovalentselt seotuks juuksenõelaga, mis toimis teise ahela sünteesil praimerina. See silmus lõhustatakse S1 endonukleaasiga, mis hävitab spetsiifiliselt nukleiinhapete üheahelalisi piirkondi. Saadud otsad ei ole alati tömbid ja järgneva kloonimise efektiivsuse suurendamiseks parandatakse need tömbiks, kasutades E. coli DNA polümeraasi I Klenowi fragmenti. Saadud kaheahelalise cDNA saab seejärel sisestada kloonimisvektoritesse, paljundada hübriid-DNA molekulidena ja kasutada edasistes uuringutes.
1.3 Ligaasid
1961. aastal näitasid Meselson ja Weigl faagi l näitel, et rekombinatsioon hõlmab DNA molekulide purunemist ja sellele järgnevat taasühendamist. See tähistas DNA fragmentide ristsidumises osaleva ensüümi otsingute algust. 1967. aastal leiti selline ensüüm ja see sai nimeks DNA ligaas. See katalüüsib fosfodiestersideme sünteesi 2-ahelalises nukleiinhappemolekulis.
Teisisõnu, DNA ligaasid seovad külgnevaid nukleotiide, moodustades sideme suhkrujääkide vahel. DNA ligaasid on hädavajalikud DNA parandamise protsessides, replikatsiooniprotsessides – DNA ahela kahekordistamisel.
DNA ligaase on kahte tüüpi, mis erinevad kofaktorinõuete ja toimeviisi poolest. E. coli DNA ligaas kasutab kofaktorina difosfopüridiini nukleotiidi, T4 faagi ligaas aga ATP-d Mg2+ juuresolekul. T4 faagi ligaas on mitmekülgsem, kuna lisaks kleepuvate otste ligeerimisele on see võimeline katalüüsima kaheahelaliste tömpide otstega DNA fragmentide taasühinemisreaktsiooni. Seda kasutatakse sagedamini.
2 Uue geeni sisestamine rakku
Rekombinantse geeni sisestamiseks rakku on kaks võimalust: vektori kasutamine või otsesüst.
Nõuded vektor-DNA-le, selle koostis
Vektor on DNA või RNA molekul, mis koosneb kahest komponendist: vektoriosast (kandjast) ja kloonitud võõrgeenist. Vektori ülesanne on viia valitud DNA retsipientrakku, integreerida see genoomi, võimaldada transformeeritud rakkude tuvastamist ning tagada sisestatud geeni stabiilne ekspressioon.
Seega peab vektor olema väike, võimeline peremeesrakus säilima (replitseeruma), palju kordi kopeerima (amplifitseerima), ekspresseerima vastavat geeni (sisaldama vastavaid regulatoorseid järjestusi), omama markergeeni, mis võimaldab eristada hübriidrakud nende tõhusaks selektsiooniks; peab saama üle kanda vastava organismi rakku.
Stabiilse geeniekspressiooni eest vastutavaid regulatoorseid järjestusi arutatakse hiljem.
On võimalik eristada 2 markergeenide rühma, mis võimaldavad eristada transformeeritud rakke:
1. Selektiivsed geenid, mis vastutavad antibiootikumide (kanamütsiin, tetratsükliin, neomütsiin jne), herbitsiidide (taimedes) resistentsuse eest. Need võivad olla mõne substraadi auksotroofia geenid jne. Sellise markeri tööpõhimõtteks on transformeeritud rakkude võime kasvada selektiivsel toitekeskkonnal, millele on lisatud teatud aineid, mis pärsivad transformeerimata normaalsete rakkude kasvu ja jagunemist.
2. Rakkude suhtes neutraalseid valke kodeerivad reportergeenid, mille olemasolu kudedes on lihtne testida.
Kõige sagedamini kasutatavad reportergeenid on β-glükuronidaasi (GUS), rohelise fluorestseeruva valgu (GFP), lutsiferaasi (LUC) ja klooramfenikoolatsetüültransferaasi (CAT) geenid. Sellest arsenalist kasutatakse kõige sagedamini geene GUS ja GFP ning vähemal määral LUC ja CAT geene. Praegu reportergeenina kasutatav GUS on Escherichia coli modifitseeritud geen, mis kodeerib β-glükuronidaasi molekulmassiga 68 kD. GUS on aktiivne paljudes keskkonnatingimustes, mille optimaalne pH on 5–8 ja 37 °C. See võib hüdrolüüsida laias valikus looduslikke ja sünteetilisi glükuroniide, mis võimaldab valida sobivad substraadid ensüümi aktiivsuse spektrofotomeetriliseks või fluoromeetriliseks määramiseks, samuti kudede in situ histokeemiliseks värvimiseks (näiteks siniseks). Ensüüm on üsna stabiilne: see on vastupidav kuumusele (poolväärtusaeg 55°C juures on umbes 2 tundi) ja pesuainete toimele. GUS-i aktiivsus ei kao külmutamise-sulatamise protsessi ajal. Geneetiliselt muundatud kimäärsete valkude osana säilitab GUS tavaliselt oma funktsionaalse aktiivsuse. Elusrakkudes on GUS-valk samuti väga stabiilne ja aktiivne mitmest tunnist mitme päevani.
GFP (roheline fluorestseeruv valk) avastasid Shimomura et al. 1962. aastal luminestseeruvas meduusis Aequorea victoria. GFP geeni kloonisid 1992. aastal Prasher jt ning juba paar aastat hiljem kasutati seda geeni aktiivselt reportergeenina uuringutes erinevate pro- ja eukarüootsete organismidega. Praegu kasutatakse GFP geeni sadades uuringutes kogu maailmas ja nende arv kasvab kiiresti. Selline kiire kasv on tingitud GFP valgu eriomadustest, nimelt selle võimest fluorestseeruda spektri nähtavas (rohelises) piirkonnas, kui seda kiiritatakse pika lainepikkusega UV-ga. See fluorestsents tuleneb otseselt valgust ja ei vaja selle avaldumiseks substraate ega kofaktoreid. Tänu sellele omadusele on GFP geen väga paljulubav reportergeen, mis võimaldab läbi viia erinevaid in vivo (mittepurustavaid) uuringuid transgeensete organismidega.
Arvukaid GFP derivaate on ühiselt nimetatud AFP-ks (autofluorescent proteins – autofluorescent proteins). Mereanemoonist Discosoma sp. Hiljuti eraldati veel üks punaselt fluorestseeruv DsRed valk. Venemaa Teaduste Akadeemia teadlased on hiljuti eraldanud Anthozoa seltsi erinevatest korallipolüüpidest veel mitu sarnast fluorestseeruvat valku. Seda saab denatureerida väga kõrgete temperatuuride, äärmuslike pH väärtuste või tugevate redutseerivate ainete, nagu Na2SO4, toimel. Füsioloogilistesse tingimustesse naasmisel taastab GFP suures osas võime fluorestseeruda. Geenitehnoloogia meetoditega loodud kimäärsete valkude osana säilitab GFP tavaliselt oma funktsionaalse aktiivsuse. Elusrakkudes on GFP valk samuti väga stabiilne.
CAT geenid vastutavad klooramfenikoolatsetüültransferaasi (isoleeritud Escherihia colist) sünteesi eest. See ensüüm katalüüsib atsetüülrühma üleminekut atsetüül-CoA-lt klooramfenikoolile. See määratakse histokeemiliselt, muutes sobiva substraadi lisamisel koe värvi.
LUC – geen kodeerib ensüümi lutsiferaasi (kloonitud bakteritest ja tulikärbestest). See põhjustab transformeeritud rakkude sära. Bakteriaalne ensüüm koosneb kahest alaühikust. Ensüümide aktiivsuse määramiseks on vaja spetsiaalset varustust - fluorimeetrit ja digitaalset videokaamerat valgussignaali võimendiga. Ensüüm kaotab oma aktiivsuse pesuvahendite ja kõrgendatud temperatuuri mõjul. Transgeensete taimede valikul on selektiivsete geenide asendamine reportergeenidega sageli väga soovitav, kuna reportergeenide kasutamisel on potentsiaalse ohu võimalus keskkonnale ja inimeste tervisele praktiliselt välistatud. Reportergeenide ulatus on aga laiem kui lihtsalt transgeneesi kontroll. Teine ja ilmselgelt olulisem reportergeenide eesmärk on paljastada (võimaluse korral kvantitatiivselt) konkreetse konkreetse geeni ekspressiooni ajalised ja ruumilised tunnused, olgu need siis natiivsed või võõrad. Reportergeeni kinnitamine ainult ühele promootorpiirkonnale võimaldab "puhtal kujul" uurida selle rolli uuritava geeni ekspressiooni reguleerimisel transkriptsiooni tasemel.
Geeni valku kodeeriva piirkonna asendamine reporterpiirkonnaga, säilitades samal ajal piirkonna, mis kodeerib 5'-otsa transleerimata mRNA järjestust, võimaldab hinnata selle järjestuse rolli mRNA transpordi protsessides tuumast tsütoplasma ja translatsiooni algus.
Geeni üks olulisemaid omadusi on selle väljendusvõime. Selle omaduse eest vastutavad mitmesugused geneetilised elemendid, mille peame integreerima geeni kandvasse vektormolekuli.
2.1 Geeniekspressiooni reguleerimine prokarüootides
Paljud bakterigeenid on paigutatud nii, et nad on võimelised toimima oluliselt erineva efektiivsusega. Näiteks E. coli's varieerub erinevate valkude suhteline sisaldus sõltuvalt nende funktsioonidest väga laias vahemikus (alla 0,1% kuni 2%); iga E. coli kromosoomi valku kodeerib üks geen. Sellised variatsioonid on tingitud geeniekspressiooni kontrollisüsteemi tegevusest, mis viiakse läbi peamiselt DNA transkriptsiooni tasemel. Seega on geeni aktiivsuse tase enamasti seotud sellel sünteesitud mRNA kogusega, see tähendab RNA polümeraasi ensüümi aktiivsusega.
DNA järjestusi, mis paiknevad enne struktuurgeeni algust ja määravad RNA polümeraasi aktiivsuse astme, nimetatakse regulatoorseteks järjestusteks. Üks selline järjestus on DNA lõik, millega seondub RNA polümeraas. Seda piirkonda nimetatakse promootoriks.
Promootori alusjärjestus määrab mRNA sünteesi initsiatsiooni sageduse ja ühe aluse asendamine selles järjestuses võib viia initsiatsiooni sageduse vähenemiseni 1000 korda.
Promootor võib olla tugev või nõrk. Tugev promootor algatab mRNA sünteesi sageli, nõrk promootor palju harvemini. Teisest küljest võib promootor olla reguleeritav või reguleerimata. Näiteks β-laktamaasi promootor on reguleerimata, kuid tugev. Selliste promootorite kasutamine ei ole alati mugav. Fakt on see, et suur kogus valku võib blokeerida bakterite kasvu. Lisaks võib rekombinantse DNA raske transkriptsioon häirida plasmiidi replikatsiooni ja see läheb kaotsi. Seetõttu on mugavam kasutada reguleeritud tugevaid promootoreid (indutseeritavaid), mille kaasamist ja seega ka võõrvalgu sünteesi saab läbi viia siis, kui on saadud suur bakterimass.
Mõned plasmiidvektorid sisaldavad promootorit, mida reguleerib repressorgeeni temperatuuritundlik valguprodukt. Repressorvalk on teatud temperatuuridel aktiivne ja blokeerib promootori tegevuse. Temperatuuri tõstmisel 42 °C-ni saab promootori "sisse lülitada" ja kiiresti saada suures koguses soovitud valku.
Indutseeritavate promootoritena kasutatakse ka trüptofaani operoni Trp promootorit, mida reguleerib trüptofaani nälg, laktaasi operoni lac promootorit, mida indutseerib substraat (laktoos) ja teisi.
Teatud struktuursete geenide transkriptsiooni intensiivsus võib sõltuda selle lõpetamise efektiivsusest, eelkõige sellest, kui sageli peatab RNA polümeraas RNA sünteesi enne nende geenideni jõudmist. Suhteliselt hiljuti leiti, et paljudes aminohapete biosünteesi kontrollivates E. coli operonites on promootori ja esimese struktuurgeeni vahel terminaatorjärjestus. Teatud tingimustel moodustub terminatsioonisignaal, mis nõrgendab transkriptsiooni intensiivsust.
Seda nähtust nimetatakse sumbumiseks ja DNA segmenti nimetatakse attenuaatoriks (attenuaatoriks). Nagu represseerimine, sõltub nõrgenemine vastavate aminohapete olemasolust söötmes. Näiteks trüptofaani liig trüptofaanist sõltuvate mutantide rakkudes, mille repressor on defektne, saab ainult 1 10-st transkriptsiooni alustanud RNA polümeraasi molekulist atenuaatorist jagu ja loeb geenide struktuuri. Trüptofaani eemaldamine kolmekordistab geeni transkriptsiooni efektiivsust. Erinevalt repressioonist ei sõltu antenuatsioon mitte aminohappest endast, vaid trüptofanüül-tRNA-st (vastava tRNA-ga seotud aminohape).
Rekombinantse DNA tootlikkuse efektiivsust mõjutab oluliselt selle DNA koopiate arv raku kohta. Ekspresseeritud geeni koguaktiivsus suureneb koos plasmiidi koopiate arvu suurenemisega. Seega on mitmekoopialisi plasmiide kasutades võimalik saavutada soovitud valguproduktide ülesüntees. Tavaliselt kasutatavaid plasmiidvektoreid (pBR 322 jt) hoitakse rakus 20-50 koopias. Nüüd on teadlaste käsutuses temperatuuritundlikud mutantsed plasmiidid, mis on võimelised koguma kuni üks kuni kaks tuhat koopiat raku kohta ilma selle elutähtsaid funktsioone rikkumata. Seega on võimalik saavutada plasmiidsete geenide ületootmine bakteritüvede-ületootjate poolt.
Ekspressiooni reguleerimine E. coli-s toimub ka translatsiooni tasemel. 6-8 nukleotiidist koosnev alusjärjestus, mis asub vahetult enne initsiatsioonikoodonit AUG, määrab translatsiooni efektiivsuse. See järjestus on mRNA seondumiskoht ribosoomiga. Reeglina on see initsiatiivkoodonist 8 nukleotiidi kaugusel ja selle nihe ühes või teises suunas võib vastava mRNA translatsiooni efektiivsust drastiliselt vähendada. Kirjeldatud piirkonda nimetatakse Shine-Dalgarno jadaks, selle esimest korda tuvastanud teadlaste järgi.
Vektor peab muuhulgas sisaldama markergeeni, mis võimaldab muudetud rakke selekteerida. Looduses laialt levinud ensüümide geene, mis modifitseerivad antibiootikume ja inaktiveerivad nende toimet, kasutatakse sageli selektiivsete geenidena.
Eukarüootse genoomi korralduse tunnused
Eukarüootsetes organismides on transkriptsiooni reguleerimise mehhanism palju keerulisem. Eukarüootsete geenide kloonimise ja sekveneerimise tulemusena on leitud spetsiifilised transkriptsioonis ja translatsioonis osalevad järjestused.
Eukarüootset rakku iseloomustavad:
1. Intronite ja eksonite olemasolu DNA molekulis.
2. i-RNA küpsemine - intronite väljalõikamine ja eksonite õmblemine.
3. Transkriptsiooni reguleerivate regulatoorsete elementide olemasolu, näiteks: a) promootorid – 3 tüüpi, millest igaühel on spetsiifiline polümeraas. Pol I replitseerib ribosomaalseid geene, Pol II replikeerib valgu struktuurgeene, Pol III replikeerib väikeseid RNA-sid kodeerivaid geene. Pol I ja Pol II promootorid on transkriptsiooni initsiatsioonikohast ülesvoolu, Pol III promootor on struktuurgeeni raamistikus; b) modulaatorid - DNA järjestused, mis suurendavad transkriptsiooni taset; c) enhanserid - järjestused, mis suurendavad transkriptsiooni taset ja toimivad sõltumata nende asukohast geeni kodeeriva osa suhtes ja RNA sünteesi lähtepunkti seisundist; d) terminaatorid – spetsiifilised järjestused, mis peatavad nii translatsiooni kui ka transkriptsiooni.
Need järjestused erinevad prokarüootsetest järjestustest oma primaarse struktuuri ja asukoha poolest initsiatsioonikoodoni suhtes ning bakteriaalne RNA polümeraas ei tunne neid ära. Seega peavad eukarüootsete geenide ekspressiooniks prokarüootsetes rakkudes geenid olema prokarüootsete regulatoorsete elementide kontrolli all. Seda asjaolu tuleb ekspressioonivektorite koostamisel arvesse võtta.
2.2 Meetodid geeni otseseks sisestamiseks rakku
Geeni otsene sisestamine rakku toimub mitmel viisil:
1. Transfektsioon
2. Mikrosüst
3. Elektroporatsioon
5. Pakend liposoomidesse
6. Elektronpüstol
Transfektsiooni käigus adsorbeerub DNA kaltsiumfosfaadi kristallidele (Graham van der Eb, 1973). Moodustuvad kaltsiumi sademe osakesed. Neid omastab rakk fagotsütoosi teel.
Transformatsiooni efektiivsuse suurendamiseks lisatakse spetsiifilisele DNA-le, mis sisaldab geeni, mille jaoks selektsioon tehakse, mittespetsiifiline kandja-DNA. Tavaliselt võetakse selleks DNA vasika harknäärest või lõhe spermast. Osa DNA-st seondub membraaniga ega sisene rakkudesse. DNA-d aktsepteerib 15–90% rakkudest. Mõni päev pärast süstimist on väike osa rakkudest võimelised ekspresseerima võõraid geene, kuid siis ekspressioonitase langeb ja 10-3 - 10-5 rakku läbib enam-vähem stabiilse transformatsiooni.
Transfektsiooniks kasutatakse ka DNA-d adsorbeerivat polümeeri DEAE-dekstraani. Rakkude sisenemise efekt ja ekspressiooniaeg on kõrged, kuid stabiilse transformatsiooni sagedus on madalam kui kaltsiumi sademe kasutamisel. Transfektsiooni sagedust suurendab glütseroolšokk (4 minutit 15% glütseroolis HEPES-puhvris).
Mis tahes geeni saab rakkudesse sisestada, kui see ligeeritakse eelnevalt kloonitud selektsioonimarkeriga. Täiendavad uuringud on aga näidanud, et ligeerimine väljaspool rakku ei ole vajalik. Rakud, mis absorbeerivad selektiivset geeni, absorbeerivad koos sellega ka muud kaltsiumsademes sisalduvat DNA-d. Seega saab kotransformatsioonimeetodit kasutades kultiveeritud eukarüootsetesse rakkudesse sisestada peaaegu iga kloonitud DNA segmendi, kui see DNA koos selektsioonimarkeriga sisaldub segu koostises kaltsiumi sademe moodustamiseks.
Transfektsiooniks võib kasutada kromosoome või kromosoomide fragmente. Doonorrakud blokeeritakse mitoosi staadiumis. Mitootilised kromosoomid vabanevad osmootse šoki ja homogeniseerimise mõjul. Neid puhastatakse diferentsiaaltsentrifuugimisega. Kromosoomid ladestuvad rakkude pinnale kaltsiumkloriidiga ja mõne tunni pärast töödeldakse neid reagendiga, mis on võimeline membraane perforeerima (näiteks glütserool).
Retsipientrakkude töötlemiseks kasutatakse kromosoomide jämedalt puhastatud preparaate, kuna sel juhul hävivad kromosoomid kõige vähem. Kromosoomide arv 1 raku töötlemiseks on piiratud. Parem on kasutada mitte rohkem kui 20 kromosoomi 1 retsipientraku kohta, kuna suspensioonis olevate kromosoomide kõrge kontsentratsiooni korral need aglutineeruvad. Retsipientrakk sisaldab doonorkromosoomide fragmente, mida saab integreerida genoomi ja mis võivad iseseisvalt paljuneda. Sisestatud fragmentides on sageli täheldatud deletsioone.
Mitte kõik rakud ei ole võimelised genoomset DNA-d suure sagedusega transformeerima. Inimese fibroblastid sisaldavad tõhusalt plasmiidset DNA-d ja peaaegu üldse mitte genoomset DNA-d.
DNA mikrosüstimine imetajarakkudesse sai võimalikuks 0,1-0,5 mikronise läbimõõduga mikropipettide valmistamise seadme ja mikromanipulaatori (joonis 45) tulekuga. Nii süstiti TK rakkudesse plasmiidid, mis sisaldavad tümidiini kinaasi (TK) geeniga herpesviiruse fragmenti ja plasmiidi pBR322, ning näidati, et TK geen tungis tuumadesse ja replitseerub neis normaalselt. Mikroinjektsioonimeetodi DNA sisestamiseks töötasid välja 1970. aastate alguses Anderson ja Diakoumakos. Põhimõtteliselt saab hea aparatuuriga 1 tunniga süstida 500-1000 rakku ning parimates katsetes täheldatakse süstitud geenide stabiilset integreerumist ja ekspressiooni 50% rakkudest. Kirjeldatud meetodi eeliseks on ka see, et see võimaldab sisestada mis tahes DNA-d mis tahes rakkudesse ning sisestatud geeni säilitamiseks rakkudes pole vaja selektiivset survet.
Riis. 4. DNA sisestamine mikrosüstiga
Elektroporatsioon põhineb asjaolul, et kõrgepingeimpulsid suurendavad pöörduvalt biomembraanide läbilaskvust. Elektroporatsiooni söötmele lisatakse rakud ja DNA fragmendid, mis tuleb rakkudesse viia (joonis 46). Kõrgepingeimpulsse (pinge 200 - 350 V, impulsi kestus 54 ms) lastakse läbi söötme, mille tulemusena tekivad tsütoplasmaatilises membraanis poorid (elektriline lagunemine), mille eluiga ja suurus on piisav makromolekulide nagu DNA jaoks. osmootsete jõudude toimel väliskeskkonnast rakku siseneda. Samal ajal suureneb raku maht.
Elektrivälja tugevus ja selle toime kestus, transformeeriva DNA ja retsipientrakkude kontsentratsioon iga rakusüsteemi jaoks valitakse eksperimentaalselt, et saavutada ellujäänud rakkude suur DNA omastamise protsent. On näidatud, et optimaalsete elektroporatsioonitingimuste korral võib transformantide arv ulatuda 80%-ni ellujäänud rakkudest.
Elektroporatsioon on pigem füüsikaline kui biokeemiline meetod ja see näib olevat selle laialdase kasutamise põhjus. Arvukad uuringud on näidanud, et elektroporatsiooni saab edukalt kasutada DNA molekulide viimiseks erinevatesse rakutüüpidesse, nagu kultiveeritud loomarakud, algloomad, pärm, bakterid ja taimede protoplastid. Kõrgepingelahenduse elektroporatiivne toime kahekihilisele lipiidmembraanile sõltub ilmselt selle kõverusraadiusest. Seetõttu neelavad väikesed bakterirakud tõhusalt DNA-d palju suurema väljatugevusega (10 kV/cm ja rohkem) kui suured looma- ja taimerakud, mis neelavad tõhusalt DNA-d väljatugevuse 1–2 kV/cm juures.
Elektroporatsioon on kõige lihtsam, tõhusam ja reprodutseeritavam meetod DNA molekulide rakkudesse viimiseks. Kuid kuni viimase ajani kasutati seda meetodit piiratud arvus laborites jadaseadmete - elektroporaatorite - puudumise tõttu. Selliste seadmete ilmumine ja täiustamine lähiaastatel toob kaasa selle lähenemisviisi laialdase kasutamise erinevate rakutüüpide geenitehnoloogias.
Riis. 5. Elektroporatsiooni meetod
"Minirakud" saadakse doonorrakkude mitoosi blokeerimisel koltsemiidiga. Rakkude pikaajalisel töötlemisel koltsemiidiga moodustub iga kromosoomi ümber uus tuumamembraan. Tsütokalasiin B-ga töötlemine ja tsentrifuugimine viib minirakkude moodustumiseni, mis on tsütoplasma membraani kapseldatud mikrotuumad.
Saadud minirakud on väga tundlikud erinevatele mõjudele, seetõttu valitakse sulandamiseks spetsiaalsed kerged tingimused. Meetod on raske, kapriisne, efektiivsus madal - 10-6 - 10-7.
Liposoompakendit kasutatakse eksogeense geneetilise materjali kaitsmiseks restriktaaside hävitava toime eest.
Liposoomid on sfäärilised kestad, mis koosnevad fosfolipiididest. Need saadakse vesilahuse ja lipiidide segu järsul loksutamisel või fosfolipiidide vesiemulsioonide ultraheliga töötlemisel. DNA viimiseks looma- ja taimerakkudesse sobivad kõige paremini fosfatidüülseriinist ja kolesteroolist koosnevad liposoomid. Liposoomide abiga transpordisüsteemid on rakkudele vähetoksilised.
Bioloogilise ballistika (biolistika) meetod on tänapäeval üks tõhusamaid taimede, eriti üheiduleheliste transformatsiooni meetodeid.
Meetodi olemus seisneb selles, et väikseimad volframiosakesed, läbimõõduga 0,6-1,2 mikronit, pihustatakse transformatsiooniks vajalikku geenikonstrukti sisaldava vektori DNA-ga. DNA-d kandvad volframiosakesed ladestatakse tsellofaani substraadile ja asetatakse biolistilise püstoli sisse. Kallus või rakususpensioon kantakse agarisöötmega Petri tassile ja asetatakse 10-15 cm kaugusele biolistilise püstoli alla.Rõhk püstolis vähendatakse vaakumpumba abil 0,1 atm-ni. Rõhu vabanemise hetkel väljutatakse biolistilisest püstolist suure kiirusega volframiosakesed, mis rakuseinu rebides satuvad tsütoplasmasse ja rakkude tuuma.
Tavaliselt surevad otse keskel asuvad rakud volframiosakeste tohutu hulga ja rõhu tõttu, samas kui kõige edukamalt protransformeerunud rakud asuvad tsoonis 0,6-1 cm kaugusel keskusest. Järgmisena kantakse rakud edasiseks kultiveerimiseks ja regenereerimiseks ettevaatlikult söötmesse.
Üheidulehelisi taimi, nagu mais, riis, nisu ja oder, muudeti biolistliku püstoliga. Sel juhul saadi stabiilsed transformanttaimed. Lisaks edule transgeensete üheiduiduliste saamisel kasutatakse biolistlikku transformatsiooni DNA otseseks ülekandmiseks embrüogeensesse õietolmu ja edasiseks kiireks transgeensete dihaploidsete taimede tootmiseks, mis on aretustöös oluline samm. Praegu on tubakataimed selle meetodiga transformeeritud ja pärast haploidsete taimede regenereerimist on saadud stabiilsed transformandid.
2.3 Kuidas geeni otse rakku sisestada
E. coli bakter on praegu kõige enam uuritud rakk. Enamikus enim uuritud faagides on peremeesrakuks ka E. coli.
E. coli protoplast on ümbritsetud välismembraaniga külgnevasse mureiinikotti. E. coli viitab mikroorganismidele, millel puudub füsioloogiline pädevus eksogeense DNA absorbeerimiseks. Seetõttu on vaja luua tingimused, mis võimaldavad ületada rakuseina barjääri. Esiteks saadakse sferoplastid rakkude töötlemisel lüsosüümiga isotoonilises lahuses.
Gramnegatiivsete bakterite välismembraani lipopolüsahhariidkiht on stabiliseerunud kahevalentsed katioonid, mistõttu kasutatakse etüleendiamiintetraäädikhappe (EDTA) kompleksi moodustavat ainet, et vabastada E. coli välismembraan, mis seob kahevalentseid katioone. EDTA-ga töötlemisel vabaneb osa lipopolüsahhariide raku välismembraanist ning lüsosüüm võib jõuda mureiinikotti ja selle hüdrolüüsida. See toob kaasa rakumembraani läbilaskvuse suurenemise. E. coli sferoplastide saamise meetodite ja nende transfektsiooni täiustamine võimaldas saavutada erinevate faagide DNA molekulidega transformatsiooni piisavalt kõrge efektiivsuse.
Leiti, et faagi DNA molekulide kujul, mida nad võtavad in vivo, on märkimisväärne mõju nakkavusele. Ringikujulise või lineaarse, kuid kiiresti sulguva DNA-ga faage (lamboidfaagid) iseloomustab kõrgeim transfektsiooni efektiivsus.
Edukad katsed E. coli-ga andsid stiimuli sarnaste uuringute läbiviimiseks teiste prokarüootsete organismidega. Suurim edu on saavutatud Bacillus subtilis rakkudega. B. subtilis on mittepatogeenne mulla mikroorganism, mis kasvab rangelt aeroobsetes tingimustes. Batsillid ei moodusta toksiine ega ole patogeensed ei loomadele ega inimestele, samas kui E. coli rakusein sisaldab endotoksiini, mida on üsna raske eraldada geneetiliselt muundatud toodetest. Lisaks on batsillide rakusein lihtsa ehitusega ja bakterid suudavad kultuurivedelikku eritada palju valke. 20 erinevat tüüpi batsilli eritavad kultuurivedelikku rohkem kui 40 rakuvälise lokalisatsiooniga ensüümi. E. coli sekreteerib söötmesse suhteliselt vähe valke ning nende eraldamine ja puhastamine on keeruline. Batsillidest on leitud ka plasmiide ja faage, mida on praeguseks juba hästi uuritud.
Võõrgeenid kloonitakse nn süstikvektoritesse. Need vektorid replitseerivad võrdselt edukalt mitme peremehe rakkudes, antud juhul E. coli ja B. subtilis'e rakkudes. Vektorid genereeriti nende plasmiidide in vitro fragmentide kombineerimisel.
E. coli geenid koos nende regulatoorsete piirkondadega B. subtilises ei funktsioneeri, seega kasutati B. subtilise enda homoloogseid piirkondi.
Ekspresseeritavat geeni sisaldava rekombinantse DNA konstrueerimiseks järgitakse järgmist strateegiat. Sünteesitakse cDNA või rakud raamatukogust, mis kannavad soovitud geeniga genoomi fragmenti, ja kloonitakse need sobivasse vektorisse. Genoomse DNA fragmente muudetakse – neist eemaldatakse mittekodeerivad piirkonnad ja naabergeenide piirkonnad. Sageli nõuab see operatsioon selle DNA fragmendi sekveneerimist. Seejärel konstrueeritakse vahepealsed rekombinantsed DNA-d, milles geen asetatakse bakterite regulatoorsete elementide (promootor, operaator, ribosoomi sidumispunkt) kontrolli alla. Need reguleerivad elemendid eraldatakse hübriidplasmiididest, mis on spetsiaalselt loodud regulatoorsete elementide allikateks. Saadud konstrukt sisestatakse sobivasse vektorisse, nt pBR 322, ja geen ekspresseeritakse bakterirakus.
Mugavam on aga sisestada geen spetsiaalsesse ekspressioonivektorisse, mis juba sisaldab regulatoorseid elemente, mis tagavad aktiivse ekspressiooni pärast rekombinantse plasmiidi sisestamist bakterirakku. Sellised tõhusad reguleerimiskohad hõlmavad näiteks beetalaktamaasi geeni tugevat promootorit (penitsilliiniresistentsuse geen, mis on osa pBR 322 plasmiidist). Mitmed geenid, sealhulgas insuliini geen, sisestati Pst I restriktsioonisaiti, mis asub geeni struktuurses osas. Selle geeni promootor tagab tõhusa transkriptsiooni, mis jätkub seni, kuni RNA polümeraas jõuab sisestatud geeni terminatsioonisignaalini.
Gilberti esimesed katsed E. coli-ga ja täpsemalt ühe selle plasmiidiga pBR322, mis viidi läbi insuliini saamiseks, võivad olla vektori märgistamise näited. Plasmiid pBR322 sisaldab 2 geeni, mis määravad resistentsuse ampitsilliini ja tetratsükliini suhtes. Restriktsiooniensüüm PstI lõikab plasmiidi apitsilliiniresistentsust kodeeriva geeni keskmises osas. Pärast plasmiidi lõhustamist lisati selle otstele terminaalse transferaasi abil neljast nukleotiidist koosnev järjestus guaniinijääkidega. Seejärel, nagu tavaliselt, "õmmeldi" ligaaside abil proinsuliini geen, saades rekombinantse DNA. Plasmiidi sisestatud DNA fragment katkestas ampitsilliini lagundava ensüümi sünteesi, kuid tetratsükliini suhtes resistentsust pakkuv geen jäi aktiivseks. Nii transformeeritud E. coli rakud sünteesisid sulandvalgu, mis sisaldas penitsillaasi ja proinsuliini järjestusi, nii et bioloogiliselt aktiivne insuliin saadi penitsillaasi ja proinsuliini keskmise segmendi lõhustamise teel.
Teisest küljest, kui mõnda resistentsusgeeni sisestatakse võõras DNA fragment, inaktiveeritakse viimane. Seetõttu on võõr-DNA fragmendi edukas sisestamine ühte neist geenidest kergesti tuvastatav bakterite resistentsuse kadumise kaudu selle antibiootikumi suhtes.
2.4 Geenide sisestamine imetajarakkudesse
Manipulatsioonid imetajate rakkudega võib jagada 2 suurde rühma: katsed somaatiliste rakkudega ja katsed sugurakkude transformeerimisel. Viimasel juhul on lõpptulemuseks transgeensete organismide tootmine.
Vektorite iseloomustus geeniülekandeks loomarakkudesse
Üheks parimaks kandjaks võõrinformatsiooni loomarakku viimisel on retroviirustel põhinevad vektorid, mis põhinevad näiteks hiire leukeemiaviirusel. Need tagavad ülitõhusa geeniülekande ja stabiilse integratsiooni sihtrakkude kromosoomi. Põhimõtteliselt viiakse loomarakkude transformatsioonid läbi kas retroviiruste abil (umbes 40% kõigist transformatsioonidest) või DNA pakendamisel liposoomidesse (25%), adenoviirusi kasutatakse harvemini, kuna need võivad põhjustada tugevat immuunvastust. Lisaks on nende korduv tutvustamine võimatu.
Kui võõr-DNA in vitro kohaletoimetamise probleem on praktiliselt lahendatud ja selle in vivo erinevate kudede sihtrakkudesse viimine on edukalt lahendatud (peamiselt retseptorvalke, sh teatud kudedele spetsiifilisi antigeene kandvate konstruktsioonide loomisega), siis teised olemasolevate vektorsüsteemide omadused – integratsiooni stabiilsus, reguleeritud ekspressioon, turvalisus – vajavad endiselt tõsist täiustamist.
Esiteks puudutab see integratsiooni stabiilsust. Siiani on integratsioon genoomi saavutatud ainult retroviiruse või adeno-seotud vektorite abil. Stabiilse integratsiooni efektiivsust saab suurendada geenikonstruktsioonide, näiteks retseptorite vahendatud süsteemide täiustamise või piisavalt stabiilsete episomaalsete vektorite (st DNA struktuuride, mis on võimelised tuumades pikaajaliselt püsima) loomisega.
Viimasel ajal on erilist tähelepanu pööratud imetajate tehiskromosoomidel põhinevate vektorite loomisele (MAC – imetajate tehiskromosoomid). Tänu tavaliste kromosoomide põhiliste struktuurielementide olemasolule säilivad sellised minikromosoomid rakkudes pikka aega ja on võimelised kandma täissuuruses (genoomseid) geene ja nende loomulikke reguleerivaid elemente, mis on vajalikud korrektseks funktsioneerimiseks. geenist, õiges koes ja õigel ajal. Sellised kunstlikud kromosoomid on pärmi (YAK) jaoks juba loodud, kuna pärmi genoom on täielikult kaardistatud.
Modifitseeritud rakkude tuvastamiseks on vaja markereid. Kui somaatilisi rakke transformeeritakse, kasutatakse tavaliselt selektiivseid markereid. Axel ja kolleegid Columbia ülikooli sisehaiguste ja kirurgia kolledžist parandasid sel viisil hiirerakkude geneetilise defekti. Nad võtsid DNA fragmendi, mis sisaldas tümidiini kinaasi (TK) geeni, mis pärineb herpesviirusest, segasid selle DNA mõne milligrammi lõhe spermast pärit kandja DNA-ga ja sadestasid DNA hiire L-rakkude kultuurile, millel puudusid. TK geen (TK-). Sagedusega 1 rakk 100 000 kohta omandas TK geeni, seega selektiivsel söötmel, mis ei võimaldanud TK-rakkudel kasvada, kasvasid ja prolifereerusid TK+ rakud normaalselt.
Metsiktüüpi rakuliinide transformeerimiseks võib kasutada teist selektsioonimarkerit, dihüdrofolaatreduktaasi (DHFR) kodeerivat geeni. Selle geeni paljude koopiate ekspressiooni tõttu muutub loomarakk koos plasmiidiga resistentseks ensüümi inhibiitori kõrgete kontsentratsioonide suhtes ja seega saab transformante selekteerida inhibiitori kõrgete kontsentratsioonide juures.
Välja on töötatud veel kaks universaalset vektorit, mis sisaldavad normaalsetes rakkudes töötavaid geenimarkereid. Need on üles ehitatud samal põhimõttel: transgeensete rakkude fenotüübi määravad prokarüootsed geenid on ühendatud eukarüootsete regulatoorsete signaalidega.
Üks vektoritest koosneb prokarüootsest neomütsiiniresistentsuse geenist, mis on sisestatud SV-40 genoomi varasesse piirkonda. Eukarüootsed rakud on tundlikud neomütsiini analoogi G 418 suhtes, mille geeniprodukt inaktiveerib. Seega omandavad transfekteeritud rakud võime kasvada G 418 sisaldaval söötmel.
2.5 Imetajate somaatiliste rakkude geneetiline transformatsioon
Erinevate ainete saamiseks kasutatakse transformeeritud imetajarakkude kultuure. Kuigi loomsed rakukultuurid, eriti massviljeluses, on palju vähem ökonoomsed kui bakteriaalsed pärmikultuurid, on neil oluline eelis – võimalus teha väikseid, kuid väga olulisi valkude modifikatsioone – imetajate geeniprodukte. Näiteks paljude valkude tõhusaks toimimiseks on vaja nende külge kinnitada süsivesikute või lipiidide molekulide ahelaid. Selliste ahelate moodustumine ja kinnitumine on imetajarakkudes tavaline protsess, samas kui bakterirakk ei ole võimeline selliseid modifikatsioone tegema.
Lisaks produtseerivate rakkude loomisele võimaldab imetajate somaatiliste rakkude transformatsioon uurida geeniekspressiooni regulatsiooni peenmehhanisme ning sihikindlalt modifitseerida loomaraku, vajadusel ka inimese raku geneetilist aparaati, mis on meditsiinigeneetika jaoks väga oluline.
Imetajate rakukultuurid võivad olla tõhus allikas mõnede viirusantigeenide eraldamiseks, et saada loomadele ja inimestele vaktsiine. Selliste vaktsiini rakukultuuride tootmine on teostatav, kasutades rekombinantse DNA tehnikaid ja tõhusaid ekspressioonivektoreid imetajate ja inimese rakkude jaoks. DNA vaktsiinide kasutamisel ei viida kehasse mitte antigeen, vaid geen, mis kodeerib selle antigeeni sünteesi. Geen sisestatakse plasmiidi ja plasmiid viiakse kehasse lihtsa süstiga.
DNA-vaktsiinidel on loomakasvatuses head väljavaated. Kiud on viiruse ümbrise valk. Kiudude epitoop kodeerib kaitsvate antikehade sünteesi. Üks lindude haigusi - munatilku sündroom (ESD) on põhjustatud viirusest. Pärast selle viiruse DNA analüüsimist eraldati kiudu kodeeriv geen, klooniti ja sisestati plasmiidi. Rekombinantne vaktsiin toob kehasse viimisel kiud-DNA rakku, viirusvalgu tootmine kutsub esile spetsiifiliste antikehade sünteesi, st põhjustab immuunvastuse.
Selliste vaktsiinide eeliseks on väga väike maht – ühe hiire immuniseerimiseks piisab 10-50 µg plasmiidist, ühe lehma kohta 200-300 µg. Plasmiidi säilitatakse kehas kuni 1 aasta. Tuberkuloosi, salmonelloosi ja leishmaniaasi tekitaja mükoplasma vastased DNA-vaktsiinid on praegu kliiniliste uuringute faasis.
Pahaloomulise kasvaja tekkimine organismis pärsib tavaliselt immuunsüsteemi. Probleemiks on immuunsüsteemi kui terviku tugevdamine ja selle toime suunamine vähirakkude vastu. Ann Arbori (Michigan) meditsiinikooli teadlased leidsid meetodi vähi vastu võitlemiseks. Eksperimentaalsete hiirte jämesoole kasvajarakkudesse süstiti geene, mis kodeerivad teise hiirte liini valke. Seda saab teha liposoomide või viiruse abil. Pärast nende valkude ilmumist rakumembraani välisküljele ründas immuunsüsteem selliseid rakke. 20% haigetest hiirtest paranes, 70% kasvaja vähenes, kontrollrühmas surid kõik. Lümfotsüüdid võitlesid mitte ainult "märgistatud" kasvajarakkudega, vaid ka metastaasrakkudega, mistõttu immuunsüsteem "ärkas". Praegu tehakse katseid nahavähiga inimestega.
2.6 Geeniteraapia
Haiguste ravi geenide abil nimetatakse geeniteraapiaks. Praegu on maailmas umbes 400 projekti, mis on pühendatud geeniteraapia abil ravile.
Geeniteraapia programmi väljatöötamisele eelneb vastava geeni koespetsiifilise ekspressiooni põhjalik analüüs, esmase biokeemilise defekti tuvastamine, selle valguprodukti struktuuri, funktsiooni ja rakusisese jaotuse uurimine, samuti geenide biokeemiline analüüs. patoloogiline protsess. Kõiki neid andmeid võetakse asjakohase meditsiinilise protokolli koostamisel arvesse.
Päriliku haiguse geenikorrektsiooni protseduuri aprobeerimine viiakse läbi patsiendi primaarsetes rakukultuurides, milles see geen on normaalselt funktsionaalselt aktiivne. Nende rakumudelite abil hinnatakse valitud eksogeense DNA ülekandesüsteemi efektiivsust, määratakse sisestatud geneetilise konstrukti ekspressioon, analüüsitakse selle interaktsiooni raku genoomiga ning töötatakse välja korrektsioonimeetodid biokeemilisel tasemel. Rakukultuure kasutades on võimalik välja töötada süsteem rekombinantse DNA sihipäraseks kohaletoimetamiseks, kuid selle süsteemi töökindlust saab testida vaid kogu organismi tasandil. Seetõttu pööratakse geeniteraapia programmides sellist tähelepanu katsetele in vivo asjakohaste loomade pärilike haiguste looduslike või kunstlikult saadud mudelitega.
Selliste loomade geneetiliste defektide edukas korrigeerimine ja geeniteraapia soovimatute kõrvaltoimete puudumine on kliiniliste uuringute heakskiitmise kõige olulisemad eeldused. Seega sisaldab päriliku defekti geenikorrektsiooni standardskeem mitmeid järjestikuseid etappe. See algab täielikult toimiva (ekspresseeritava) geneetilise konstruktsiooni loomisega, mis sisaldab geeni sensit (valku kodeerivat) ja reguleerivaid osi. Järgmises etapis lahendatakse probleem vektoriga, mis tagab geeni tõhusa ja võimaluse korral sihipärase kohaletoimetamise sihtrakkudesse. Seejärel viiakse läbi transfektsioon (saadud konstrukti ülekandmine) sihtrakkudesse, määratakse transfektsiooni efektiivsus, primaarse biokeemilise defekti korrigeeritavuse määr rakukultuuri tingimustes (in vitro) ja mis kõige tähtsam, in vivo loomsete bioloogiliste mudelite puhul. hinnatud. Alles siis saab alustada kliiniliste uuringute programmiga.
Geeniteraapiat on kahte tüüpi: asendus- ja korrigeeriv.
Asendusgeeniteraapia hõlmab intaktse geeni sisestamist rakku. Sisestatud koopia asendab patsiendi genoomis säilinud defektse geeni funktsiooni. Kõik praegu käimasolevad kliinilised uuringud kasutavad täiendavate koguste DNA sisestamist rakku.
Korrigeeriv ravi hõlmab defektse geeni asendamist normaalsega rekombinatsiooni tulemusena. Siiani on see meetod laboratoorsete katsete staadiumis, kuna selle tõhusus on endiselt väga madal.
Sõltuvalt eksogeense DNA patsiendi genoomi sisestamise meetodist võib geeniteraapiat läbi viia kas rakukultuuris (ex vivo) või otse kehas (in vivo). Rakuline geeniteraapia ehk ex vivo teraapia hõlmab patsiendi spetsiifiliste rakutüüpide isoleerimist ja kultiveerimist, nendesse võõraste geenide sisestamist, transfekteeritud rakkude väljavalimist ja nende uuesti samasse patsienti infundeerimist.
Näiteks on kombineeritud immuunpuudulikkuse ravi. Kombineeritud immuunpuudulikkus võib tuleneda adenosiindeaminaasi geeni defektist. Esimest korda prooviti sellist patsienti geeniteraapia meetoditega ravida USA-s aastal 1990. Haige lapselt ekstraheeriti T-lümfotsüüdid, transformeeriti retroviirusvektoriga, sisestades normaalse adenosiindeaminaasi geeni ja rakud. viidi tagasi kehasse. Sissejuhatust tuleb korrata. Sarnane luuüdi tüvirakkude transformatsioon on tõhusam.
Geeniteraapia in vivo põhineb kloonitud ja spetsiifiliselt pakitud DNA järjestuste otsesel sisestamisel patsiendi konkreetsetesse kudedesse. Praegu ei ole kopsurakkude kultiveerimiseks avalikult kättesaadavat meetodit, mistõttu kopsuhaiguste puhul on ainus viis võõrgeeni kohaletoimetamiseks otse kehasse süstida. Tsüstiline fibroos on valgenahaliste seas väga levinud raske pärilik kopsuhaigus, mis mõjutab Kesk-Euroopa peredes näiteks üht 2500 vastsündinut ja mille puhul on tuvastatud defektne transmembraanset juhtivuse regulaatorvalku kodeeriv geen. Defektse geeni peamine ilming on kopsupõletik. Mõjutatud on kõik epiteelirakud. Peamine probleem seisneb selles, kuidas toimetada geen limaga kaetud rakkudesse, mis takistab transformatsiooni. Adenoviirusvektorisse või liposoomi inkorporeeritud "haiguse geeni" puutumatu koopia muudetakse aerosooliks patsiendi hingamisteedesse.
Progresseeruva Duchenne'i lihasdüstroofia (X-kromosoomi defektidega seotud poiste haigus) häire korrigeerimiseks prooviti normaalset düstroofiavalku kodeerivat geeni otse lihaskiududesse süstida, kasutades kas palja DNA või adenoviirusvektorit. Teised teadlased siirdasid pärast geneetilist korrigeerimist patsiendile müoblastid. Varem liikumatu laps omandas liikumisvõime! Kahjuks on kõigi nende katsetega võimalik saavutada vaid ajutine raviefekt ja geeni sisestamise protseduuri tuleb korrata mitu korda.
Pärilike haiguste loetelu, mida proovitakse või plaanitakse geenidega ravida, on pikk. Need on reumatoidartriit ja fenüülketonuuria ning hormoonide (insuliin, erütropoetiin, kasvuhormoon) puudusega seotud haigused. Erütropoetiini puudulikkusega seotud kroonilise aneemia korral pakutakse loomkatsete põhjal välja põhimõtteliselt uus lähenemine ravile. Kuna iga meie rakk sisaldab sama genoomi, on võimalik sundida naha fibroblaste, mis tavaliselt erütropoetiini ei tooda, seda hormooni sünteesima. Selleks on vaja viia genoomi uus kontrollpiirkond ja sellega kaotada fibroblastides esineva, kuid “vaikiva” erütropoetiini geeni lugemise (ekspressiooni) keeld.
Praktiliselt igas meditsiinivaldkonnas on kas alustatud kliinilisi uuringuid pärilike haiguste raviks geeniteraapia abil või arendatakse sellise ravi lähenemisviise loomkatsetes. Geenide kohaletoimetamise ja ekspressioonikontrolli meetodite paranedes laieneb kindlasti ka nende haiguste loetelu, mille puhul saab geeniteraapiat rakendada.
Tohutuid väljavaateid avab geeniteraapia kasutamine onkoloogiliste haiguste ravis. Teadlaste pikaajalised jõupingutused on viinud arusaamisele, et vähk on geneetiline haigus ja selle areng toimub mitmes etapis rakus akumuleeruvate geneetiliste häirete tagajärjel. Seetõttu võib igaüks neist individuaalsetest geneetilistest mõjudest saada geeniteraapia lähenemisviisi rakenduspunktiks.
2.7 Transgeensete loomade saamine
Kui DNA viiakse mitmerakulise organismi rakkudesse, siis transformatsiooni tulemusena muutuvad omadused vaid vähesel hulgal rakkudel, mis on omandanud uue geeni või geenid. Seetõttu on kogu organismi omaduste muutmiseks vaja muuta sugurakkude genoomi, mis kannab uued omadused üle järglastele. Taimedel ja loomadel on soovitatav muuta selliseid omadusi nagu kasvukiirus, vastupidavus haigustele ja kohanemisvõime uute välistingimustega. Markeritena saab sel juhul kasutada restriktsioonifragmendi pikkuse polümorfismi (AFLP), mini-satelliidi analüüsi, mikrosatelliidi DNA (SSR) analüüsi, hübridisatsiooni jne.
On välja töötatud meetodid geenide sisestamiseks imetajate, kärbeste ja mõnede taimede embrüorakkudesse. Töölt üsna suurte kahepaiksete munadega liikusid nad edasi hiire munade ja embrüote uurimiseni, kes on geneetiliselt enim uuritud imetaja.
Kloonitud geenid mikrosüstitakse äsja viljastatud hiiremuna ühte või mõlemasse protuuma. Sagedamini valitakse spermatosoidi sisestatud meessoost protuum, kuna selle suurus on suurem. Pärast süstimist siirdatakse munarakk kohe lapsendaja ema munajuhasse või lastakse kultuuris areneda blastotsüsti staadiumisse, misjärel see siirdatakse emakasse.
Saate sisestada spermatosoididesse geeni ja seejärel neid viljastada. Seega süstiti inimese interferooni ja insuliini geenid, küüliku β-globiini geen, herpes simplex viiruse tümidiini kinaasi geen ja hiire leukeemiaviiruse cDNA. Ühe süstiga manustatavate molekulide arv on vahemikus 100 kuni 300 000 ja nende suurus on 5 kuni 50 kb. Tavaliselt jääb ellu 10–30% munadest ja muundatud munadest sündinud hiirte osakaal varieerub mõnest kuni 40%-ni. Seega on tegelik efektiivsus umbes 10%.
Võõrgeenide integreerimine on kromosoomide suhtes mittespetsiifiline ja võõra geeni koopiate arv võib varieeruda mõnest 100 või enama. Need geenid moodustavad rühma tandemkordusi, mis on paigutatud pea-saba mustrisse. Pärast süstimist leiti võõr-DNA nii somaatilistes kui ka sugurakkudes. See tähendab, et integratsioon toimub sügootide arengu kõige varasemates staadiumides.
Mitmel juhul oli heteroloogne DNA päritud kolmes hiirte põlvkonnas, mis näitab stabiilset integratsiooni. Sugurakkudesse integreeritud DNA edastatakse Mendeli geenina. On kindlaks tehtud, et võõrgeeni ekspressioonitase sõltub DNA kromosoomidega integreerumise kohast ja selle metüülimise astmest, samuti kudede diferentseerumisest. Mõnel juhul oli võimalik saada koespetsiifilist ekspressiooni. Oluline on märkida, et spetsiifilisi võõrgeene saab sisestada raku genoomi nii, et need alluvad normaalsetele regulatoorsetele signaalidele.
1981. aastal süstisid Constantini ja Lacey (Oxford) hiiremunadesse 19 kiloalust küüliku kromosomaalset DNA-d. Need fragmendid sisaldasid küüliku β-globiini geeni. Munad kultiveeriti blastotsüsti staadiumis ja implanteeriti emakasse. 24 hiirel, kes sündisid siirdatud munarakkude arengu tulemusena, viidi läbi osaline hepatektoomia. Maksarakkude DNA analüüs näitas, et 9 hiirel oli β-globiini geeni raku kohta 1 kuni 20 koopiat. Pärast paaritumist andsid 4 normaalsete emasloomadega transformeeritud isast järglasi 18 loomalt. Neist 6-l oli ka β-globiini geen. On kindlaks tehtud, et geeni integreerumine imetajarakkudesse toimub juhuslikult ega ole seotud kromosoomi spetsiifiliste piirkondadega. Geen on ebastabiilne, võib kaduda või muutuda passiivseks. Reguleerivad järjestused tuleb sisestada koos geeniga.
Geenide embrüorakkudesse sisestamise meetodil on piirangud. Võõr-DNA-d ei ole alati võimalik kromosoomi antud piirkonda integreerida. Seni välja töötatud metoodilised lähenemised ei võimalda genoomis leiduvat geeni asendada, seda välja tõrjuda, alati ei ole võimalik uut geeni organismi regulatsioonisüsteemile allutada.
Transgeneesi ajal võivad tekkida ootamatud probleemid. Näiteks mõned esimesed tööd loomade geneetilise transformatsiooni alal viidi läbi kasvuhormooni geenide sisestamise teel. Roti kasvuhormooni geeni ülekandmine hiirtele kahekordistas hiirte kasvu. Edukad on olnud ka veiste kasvuhormooni geenide transgeneesi katsed küülikutel. Kuid sarnased katsed veiste modifitseerimisel suurendasid kasvu vaid 10–20%. Ilmselgelt on see tingitud asjaolust, et hiirtel säilib lai reaktsioonikiirus ja hormooni kogust suurendavate geenide sisestamine põhjustab genotüübi võimalikult täieliku realiseerumise. Kariloomadel töötavad organismid suunavaliku tulemusena reaktsiooninormi ülempiiril, mistõttu oodatud mõju ei ilmnenud.
Meil on somatotropiini geeni kandvad sead saadud. Kasvukiiruselt nad ei erinenud tavaloomadest, kuid ainevahetuse muutus mõjutas rasvasisaldust. Sellistel loomadel olid lipogeneesi protsessid pärsitud ja valgusüntees aktiveeritud. Insuliinitaoliste faktorite geenide kaasamine tõi kaasa ka muutuse ainevahetuses. Sellised transgeensed sead loodi hormooni biokeemiliste muundumiste ahela uurimiseks ja kõrvalmõjuks oli immuunsüsteemi tugevnemine.
Kõige võimsam valke sünteesiv süsteem on leitud piimanäärme rakkudes. Kui panna võõraste valkude geenid kaseiini promootori kontrolli alla, siis on nende geenide ekspressioon võimas ja stabiilne ning valk koguneb piima (käärimisloom). Juba on saadud transgeenseid lehmi, kelle piim sisaldab inimese valku laktoferriini. Seda valku kavatsetakse kasutada madala immuunresistentsusega inimeste gastroenteroloogiliste haiguste ennetamiseks. Need on aidsihaiged, enneaegsed lapsed, kiiritusravi läbinud vähihaiged. Sellise piima kliinilised uuringud on käimas. Genzyme Transgenics Corporation kavandab juba uuringuid, et luua transgeenseid veiseid, mis sisaldavad piimas inimese albumiini. Osteti patent sidekoerakkude (fibroblastide) genoomi sisaldavate embrüote saamiseks, sealhulgas inimese valgu sünteesi eest vastutava geeni. Selline tehnoloogia võimaldab tõsta transgeensete piimaloomade loomise efektiivsust, kuna tavapärase geenide süstimisega viljastatud munarakku sünnib vaid 5-10% transformeerunud loomadest, kellest on mitu isast, kes piima ei anna. .
Uue kloonimistehnoloogia kasutamine võimaldab saada ainult emaseid loomi, kes toodavad transgeenset valku. Albumiini kasutatakse ravis vere osmootse rõhu säilitamiseks. Igal aastal vajab maailm selle valgu eraldamiseks umbes 440 tuhat liitrit vereplasmat (maksumus on umbes 1,5 miljardit dollarit). Iga lüpsilehm suudab aastas toota 80 kg inimese rekombinantset albumiini. Genzyme Transgenics töötab välja sarnaseid meetodeid inimese kasvuhormooni ja β-interferooni tootmiseks.
Inglismaal on loodud transgeensed lambad, kelle piim sisaldab verehüübimisfaktorit.
Meie riigis on püütud luua lambaid, kes toodavad kümosiini (juustu valmistamise ensüüm). Saadi kaks lammast, ühel geen ei ekspresseerunud, teisel küündis kümosiinisisaldus 300 mg/L. Selle lamba järglased andsid aga väikese piimatoodangu – umbes 50 kg laktatsiooniperioodi kohta. Põhjus oli selles, et kümosiini toodetakse eelkäijana prokümosiinina, mis pH=5 juures muudetakse aktiivseks ensüümiks. Plaanis oli saada täpselt prokümosiini, kuid mõnes udara piirkonnas oli pH langus, mis tõi kaasa kümosiini aktiveerumise otse organismis. Aktiivne kümosiin kalgendas piima ja see ummistas udaraid. Nüüd püütakse seda probleemi lahendada.
Moskva piirkonnas saadi küülikuid, kes eritavad γ-interferooni, erütropoetiini, kuid küülikud ei ole traditsioonilised piimatootjad. Põllumajandusloomade ümberkujundamise katsed on väga kallid – üks transgeenne loom maksab kümneid ja sadu tuhandeid dollareid.
Transgeenseid loomi saadakse ka ksenotransplantatsiooni eesmärgil. Ühed lemmikelundidoonorid on sead, kuna seal on elundite anatoomiline sarnasus ja immunoloogiliste omaduste sarnasus. Siirdamise ajal esinevatel äratõukereaktsioonidel on keeruline mehhanism. Üheks signaaliks organismile võõrorgani ründamiseks on membraani välispinnal paiknevad valgud. Transgeensetel sigadel asendatakse need valgud inimese omadega.
Teine transgeneesi suund on haigusresistentsete loomade tootmine. Loomakasvatus põhineb vaktsiinidel, sest selektsioon toimub peamiselt majanduslikult väärtuslike tunnuste järgi - villasus, piimjasus jne. Resistentsuse suurendamine on geenitehnikute asi. Kaitsevalkude hulka kuuluvad interferoonid, mistõttu interferooni geen sisestati erinevatesse loomadesse. Transgeensed hiired said vastupanu, nad ei haigestunud või jäid vähe haigeks, kuid sigadel sellist toimet ei leitud.
Teine suund on antisenss-RNA-d kodeerivate geenide kasutuselevõtt. Loomakasvatuse teravaks probleemiks on RNA viiruste põhjustatud leukeemia. Transgeensed küülikud, kes kandsid rakus antisenss-RNA esinemise eest vastutavaid geene, olid leukeemia suhtes resistentsed.
Transgeenseid loomi saab kasutada aju ja närvisüsteemi pärilike haiguste uurimiseks. Normaalsete loomade genoomi viiakse Alzheimeri tõve geenid (β-amüloidvalgu ladestumine põhjustab iseloomulike naastude moodustumist) ja epilepsia, ajuhaiguste tekke eest vastutavad geenid; sel juhul saadakse transgeensed loommudelid, mille peal saab katsetada erinevaid ravimeetodeid.
Transgeenseid loomi on kasutatud inimeste põletikuliste ja immunoloogiliste haiguste, näiteks reumatoidartriidi uurimiseks. Modelleeritakse lipiidide metabolismiga seotud haigusi.
Järeldus
Kuigi geneetikal ja geenitehnoloogial on meditsiinis ja põllumajanduses juba tohutu roll, on peamised tulemused alles ees. Meil on veel palju õppida selle kohta, kuidas keeruline geneetiline süsteem meie kehas ja teistes elusolendiliikides töötab.
On vaja kindlaks määrata iga geeni funktsioonid ja eesmärk, teha kindlaks, millised on selle aktiveerimise tingimused, millistel eluperioodidel, millistes kehaosades ja millistel asjaoludel see sisse lülitatakse ja viib geeni sünteesini. vastav valk. Lisaks on vaja mõista, millist rolli see valk kehas mängib, kas see väljub rakust, milliseid sõnumeid kannab, milliseid reaktsioone see katalüüsib, kuidas mõjutab bioloogiliste protsesside käivitamist teistes kehaosades, millised geenid see aktiveerub. Eraldi keeruline ülesanne on lahendada valkude voltimise probleem - kuidas, teades valku moodustavate aminohapete järjestust, määrata selle ruumiline struktuur ja funktsioonid. See probleem nõuab uusi teoreetilisi teadmisi ja võimsamaid superarvuteid.
Kuid teadlased ei karda selle ülesande ulatust. Inimese genoomi dešifreerimine võttis aega üle kümne aasta, valgu voltimise probleemi lahendamine võib võtta veidi kauem aega, kuid kui see lahendatakse, suudab inimene täielikult juhtida eluprotsesse mis tahes organismides ja kõigil tasanditel.
Bibliograafia
1. Alberts B., Bray D., Lewis J. jt, Raku molekulaarbioloogia. T. 1 - 3. M .: Mir, 1994.
2. Genoomi analüüs. Meetodid / Toim. K. Davis. M.: Mir, 1990. 246 lk.
3. Atanasov A. Biotehnoloogia taimekasvatuses. Novosibirsk: ICGSO RAN, 1993. - 241 lk.
4. Baranov V.S. Geeniteraapia - XXI sajandi meditsiin // Sorose haridusajakiri. Nr 3. 1999. S. 3 - 68.
5. Beker M.E., Liepinsh G.K., Raipulis E.P. Biotehnoloogia. M.: Agropromizdat, 1990. 334 lk.
6. Borisjuk N.V. Somaatiliste hübriidide molekulaarne - geneetiline konstitutsioon // Biotehnoloogia. Teaduse ja tehnika tulemused VINITI AS NSVL. M., 1988. T. 9. S. 73-113.
7. Valihanov G.Zh. Taimede biotehnoloogia. Almatõ: Konzhyk, 1996. 272 lk.
8. Gleba Yu.Yu. Taimede biotehnoloogia // Sorose õppeajakiri. Nr 6. 1998. S. 3 - 8.
9. Glebov O.K. Somaatiliste rakkude geneetiline transformatsioon // Rakkude kasvatamise meetodid. L.: Nauka, 1988.
10. Goldman I.L., Razin S.V., Ernst L.K., Kadulin S.G., Graštšuk M.A. Võõrgeenide positsioonist sõltumatu ekspressiooni probleemi molekulaarbioloogilised aspektid transgeensete loomade rakkudes // Biotehnoloogia. 1994. nr 2.
11. Dyban A.P., Gorodetsky S.I. Võõrgeenide sissetoomine imetajate genoomi: viisid ja väljavaated // Biotehnoloogia molekulaarsed ja rakulised aspektid. L .: Nauka, 1986. S. 82-97.
12. Egorov N.S., Samuilov V.D. Kaasaegsed meetodid mikroorganismide tööstuslike tüvede loomiseks // Biotehnoloogia. Raamat. 2. M.: Kõrgkool, 1988. 208 lk.
13. Zvereva S.D., Romanov G.A. Taimede geenitehnoloogia reportergeenid: iseloomustus ja testimismeetodid // Taimefüsioloogia. 2000. V. 47, nr 3. S. 479-488.
14. Leštšinskaja I.B. Geenitehnoloogia // Sorose haridusajakiri. 1996. nr 1. lk 33-39.
15. Lee A., Tinland B. T-DNA integreerimine taimegenoomi: prototüüp ja tegelikkus // Taimefüsioloogia. 2000, 47. köide, nr 3, lk 354-359
16. Lutova L.A., Provorov N.A., Tihhodeev O.N. ja muud taimede arengu geneetikad. Peterburi: Nauka, 200. 539 lk.
17. Lewin B. Genes. M.: Mir, 1987. 544 lk.
18. Piruzyan E.S., Andrianov V.M. Agrobacterium plasmiidid ja taimede geenitehnoloogia Moskva: Nauka, 1985. 280 lk.
19. Piruzyan E.S. Taimede geenitehnoloogia M.: Znanie, 1988. 64 lk.
20. Piruzyan E.S. Taimede geenitehnoloogia alused M.: Nauka, 1988. 304 lk.
21. Piruzyan E.S. Võõrgeenide ekspressiooniprobleemid taimedes // Itogi nauki i tekhniki VINITI. Ser. Biotehnoloogia. 1990. T. 23. 176 lk.
22. Popov L.S., Yazykov A.A. Transgeensed loomad kui mudelid embrüonaalse arengu paljunemise ja inimeste haiguste uurimisel // Advances in Modern Biology. 1999. T 119, nr 1. S. 30-41.
23. Romanov G.A. Taimede geenitehnoloogia ja bioloogilise ohutuse probleemi lahendamise viisid // Taimefüsioloogia, 2000. Kd 47, nr 3. Lk 343-353
24. Põllumajanduse biotehnoloogia: Proc. / V.S. Shevelukha, E.A. Kalašnikova, S.V. Degtyarev ja teised: Ed. V.S. Shevelukhi. M.: Kõrgem. kool, 1998. 416 lk.
25. Singer M., Berg P. Geenid ja genoomid. T. 1-2. M.: Mir, 1998.
26. Tomilin N.V., Glebov O.K. Imetajate rakkude geneetiline transformatsioon // Biotehnoloogia molekulaarsed ja rakulised aspektid. L.: Nauka, 1986. S. 62 - 82.
27. Favorova O.O. Ravi geenidega – väljamõeldis või reaalsus? // Sorose haridusajakiri. Nr 2. 1997. S. 21 - 27.
28. Štšelkunov S.N. geenitehnoloogia. 1. osa. Novosibirsk: Novosibirski ülikooli kirjastus, 1994. 304 lk.
Rekombinantse DNA sisestamise protsessi bakterirakku nimetatakse muutumine. Transformatsiooni tulemusena omandab peremeesrakk uusi DNA järjestusi ja sellest tulenevalt uusi fenotüüpseid tunnuseid, näiteks resistentsust teatud antibiootikumide suhtes. Sellistes katsetes kasutataval peremeesrakul peab eelkõige olema teatud fenotüüp r-, st. see ei tohiks sisaldada restriktsiooniensüüme; see peab olema võimetu üldiseks rekombinatsiooniks ( recA-) et eksogeenne DNA ei muutuks homoloogse rekombinatsiooniga. Üks sel eesmärgil enim kasutatavaid kultuure on laboratoorsed bakteritüvi. E. coli- tüvi K12.
Nimetatakse rakke, mis suudavad võõr-DNA-d absorbeerida pädev. Pädevus E. coli seda on vaja esile kutsuda ja see omadus on esialgu ka mõnel teisel bakteril. Pädevate rakkude osakaalu saab suurendada spetsiaalse toitesöötme või kultiveerimistingimuste abil. Bakterite puhul, mis on resistentsed keemiliste indutseerijate suhtes või millel puudub loomulik pädevus, kasutatakse teisi DNA kohaletoimetamise süsteeme.
Kõige sagedamini kasutatavad meetodid bakterirakkude transformeerimiseks laboripraktikas on:
Muutumine E. coli töötlemisel kaltsiumkloriidiga;
elektroporatsioon– raku läbilaskvuse suurenemine vooluimpulsi mõjul kestusega ~4,5 ms;
Teisenduse tulemusi saab kvantifitseerida: määrates kas sagedus, või tõhusust teisendusi.
Transformatsiooni sagedus on võõra DNA saanud rakkude osakaal rakupopulatsioonis; väljendatud transformantide arvuna rakkude koguarvu suhtes.
Transformatsiooni efektiivsus- transformantide arv 1 µg transformeerimiseks võetud DNA kohta.
Selles jaotises esitatud teave rekombinantse DNA kloonimise kohta, kasutades pBR322 plasmiidvektorit, on kokku võetud katseskeemi kujul ja esitatud joonisel 20.
Riis. 20. DNA kloonimine plasmiidvektoris pBR322
1, 2, 3, 4 ja 5 – kloonimisprotseduuri etapid (vt teksti).
1. pBR322 DNA lõigatakse restriktsiooniendonukleaasiga PstI ampitsilliiniresistentsuse kohas.
2. Doonor-DNA fragmendid, mis on samuti saadud kasutades PstI ja millel on kleepuvad otsad, nagu lineariseeritud pBR322 vektor, ligeeritakse vektori DNA-ga, kasutades DNA ligaasi. Sellise konstruktsiooni moodustumise tagajärg on ampitsilliini suhtes resistentsust tagava geeni destruktureerimine. Seega loodi rekombinantne DNA rakkudesse sisestamisel E. coli ei suuda tagada nende ellujäämist ampitsilliini söötmel.
3. Rakud E. coli transformeerida rekombinantse DNA-ga.
4. Pärast transformatsiooniprotseduuri plaaditakse rakususpensioon agariplaatidele ja toitesöötmele, mis sisaldab antibiootikumi tetratsükliini. Selles etapis toimub selektsioon, st. rakkude valik, mis on võimelised kasvama tetratsükliiniga söötmel. Sellel agaril kasvatatud rakud sisaldavad rekombinantset DNA-d ja pBR322 DNA-d, mis ei sisaldanud doonor-DNA inserti; taastas vektori algse struktuuri.
5. Üksikud rakukolooniad E. coli kasvatatud tassil tetratsükliini subkultuuriga kaks tassi tassi peal, millest üks sisaldab agarit ampitsilliiniga ja teine tetratsükliini. Rekombinantset plasmiidset DNA-d sisaldavad rakud kasvavad ainult tetratsükliini agaril, kuna ampitsilliini suhtes resistentsust tagav geen on doonor-DNA sisestamise tõttu struktureeritud. Samas kui rakud originaalist, s.o. taaskasutatud pBR322 vektori DNA kasvavad mõlemal plaadil, kuna mõlema antibiootikumi suhtes resistentsuse geenid on natiivses, st. algses seisukorras.
Valitud kloonide rakkudest E. coli ekstraheerida plasmiidne DNA ja analüüsida selle struktuuri.
Muud plasmiidvektorid
Vektori pBR322 ajastu, mille Bolivar ja Rodriguez alustasid 1980. aastate alguses, jätkub tänapäevani. Vaatamata kogu oma usaldusväärsusele ja klassikalisele vastavusele kõigile vektorite nõuetele, on sellel vektoril aga vaid mõned mugavad kloonimise saidid. Lisaks võtab sellel põhineva rekombinantse DNA-ga katsetes transformeeritud rakkude valimine kaua aega. Oli vaja välja töötada alternatiivsed, arenenumad kloonimissüsteemid. Seega loodi pUC perekonna vektorite rühm. Selle perekonna vektorite nimes on tähed "U" ja "C" sõnade esimesed tähed California ülikool. Selle ülikooli teadlased on loonud rea vektoreid, millel on oluline omadus - integreeritud sünteetilise aine olemasolu DNA struktuuris. polülinker, mis on nukleotiidjärjestus, mis koosneb mitmete selle vektori jaoks ainulaadsete restriktsiooniendonukleaaside – MCS (Multiple Cloning Sites) – äratundmiskohtadest. PUC perekonnast pärinevate üksikute vektorite nimed erinevad kahekohalise numbri võrra ja erinevate vektorite primaarstruktuur erineb MCS saitide MCS - Multiple Cloning Sites in polülinkeris koostiselt.
Vaatleme üksikasjalikumalt sellesse rühma kuuluvate vektorite omadusi, kasutades näitena pUC19 vektorit (joonis 21).
Plasmiid pUC19 on 2686 aluspaari pikkune. ja sisaldab: ampitsilliiniresistentsuse geeni; β-galaktosidaasi geeni reguleeritud segment (lacZ") laktoosi operon E. coli geen lacI, kodeeriv repressor, mis kontrollib geeniekspressiooni lacZ"; polülinker – lühike järjestus paljude ainulaadsete endonukleaaside (EcoRI, SacI, KrpI, XmaI, SmaI, BamHI, XbaI, SalI, HincII, AccI, BspMI, PstI, SphI ja HindIII) äratundmiskohtadega; ColE1 plasmiidi replikatsiooni alguspunkt.
Riis. 21. Plasmiidvektor pUC19
Kaarti selgitatakse tekstis.
Ampitsilliini suhtes resistentsust tagava geeni olemasolu pUC19 plasmiidis võimaldab valida seda vektorit või selle alusel rekombinantset DNA-d sisaldavaid E. coli kloone selle antibiootikumiga toitesöötmel. Vaadeldava vektori struktuuri sellised modulaarsed elemendid nagu lacZ", lacI ja MCS võimaldavad kiirendada ja intensiivistada rekombinantse DNA-ga kloonide valikut.
Kui modifitseerimata pUC19 plasmiidi sisaldavaid rakke kasvatatakse isopropüül-β-D-tiogalaktopüranosiidi (IPTG) juuresolekul, mis on indutseerija lakk- operon, seejärel geeniprodukt lacI, nö repressor, ei suuda seonduda geeni promootor-operaatorpiirkonnaga lacZ", ja selle tulemusena toimub geeni plasmiidi fragmendi transkriptsioon ja translatsioon lacZ". Selle fragmendi saadus seostub valguga, mida kodeerib kromosomaalne DNA ( α-komplementatsioon) ja selle tulemusena moodustub aktiivne ß-galaktosidaas. Mitme restriktsioonikohaga järjestus (polülinker) sisestatakse geeni lacZ" nii et see ei mõjuta funktsionaalse β-galaktosidaasi tootmist ja kui söötmes on selle substraat 5-bromo-4-kloro-3-indolüül-β-D-galaktopüranosiidi (X-Gal), siis on see hüdrolüüsitakse selle ensüümi toimel, moodustades sinise produkti, mis värvib rakkude kolooniaid, mis sisaldavad modifitseerimata, st. ilma võõr-DNA sisestamiseta, pUC19 plasmiid (joonis 22).
Riis. 22. DNA kloonimise protseduuride järjestus pUC19 vektoris.
1, 2, 3 ja 4 – kloonimise etapid (vt teksti)
1. Doonor-DNA-d töödeldakse ühe restriktsiooniendonukleaasiga, mille jaoks polülinkeris on sait. pUC19 vektori DNA-d töödeldakse sama ensüümiga
2. Lineariseeritud vektori ja inserti ligeerimine T4 DNA ligaasiga.
3. Pärast inkubeerimisseguga ligeerimist transformeeritakse α-komplementatsioonivõimelised rakud, mis suudavad sünteesida seda osa ß-galaktosidaasist (LacZα), mis on seotud geeniproduktiga. lacZ" aktiivse ensüümi moodustumisega.
4. Töödeldud rakud külvatakse ampitsilliini, IPTG ja ß-galaktosidaasi substraadiga toitesöötmele. Transformeerimata rakud ei saa ampitsilliini juuresolekul kasvada ja tervet plasmiidi kandvad rakud moodustavad ampitsilliiniga söötmel siniseid kolooniaid. Hübriidi kandvad peremeesrakud, s.o. rekombinantne, plasmiid, moodustavad samal söötmel valgeid kolooniaid. See on tingitud asjaolust, et tavaliselt ei saa polülinkerisse võõra DNA sisestamisel terviklikku geeniprodukti moodustada. lacZ", ja sellest tulenevalt ei moodustu α-komplemendi protsessis aktiivset ß-galaktosidaasi, mis lõhustab X-Gal substraadi tooteks, mis tagab kolooniarakkude sinise värvimise.
Bakteriofaagil λ põhinevad vektorid
Plasmiidvektorid võimaldavad kloonida DNA fragmente, mille suurus ei ületa 10 kb. Kuid isegi väikese organismi, näiteks bakteri, kromosomaalse DNA kloonimise probleemi lahendamiseks on vaja luua nendest DNA fragmentidest täielikud kogud, seetõttu on sageli vaja töötada suuremate fragmentidega. Selleks kasutatakse bakteriofaagil λ põhinevaid vektoreid E. coli.
Kui faag λ tungib E. coli rakkudesse. Sündmuste arendamiseks on kaks alternatiivset teed:
1. lüütiline tsükkel- faag hakkab aktiivselt paljunema ja umbes 20 minuti pärast rakk hävib kuni 100 uue faagiosakese vabanemisega.
2. Lüsogeneesi seisund– Faagi DNA sisaldub E. coli kromosoomi profaagina ja paljuneb rakus koos normaalsete bakterirakkudega. Kuid ebasoodsates tingimustes (toitumise puudumine) algab lüütiline tsükkel (joonis 23):
1. Bakteriofaagi λ cDNA replikatsiooni käigus moodustub lineaarne molekul, mis koosneb ligikaudu 50 kb pikkustest korduvatest segmentidest. Kõik need segmendid on täispikk faagi DNA, mida ümbritseb kleepuv cos-saidid - üheahelalised 5 "-"saba" 12 nukleotiidist. Neid nimetatakse kleepuvateks ( cos) lõpeb, kuna need on üksteist täiendavad ja võivad üksteisega paarituda nagu restriktsioonifragmentide kleepuvad otsad.
2. Faagipea sisaldab ühte sellist segmenti, seejärel kinnitatakse pea külge juba kokkupandud protsess.
Riis. 23. Bakteriofaagi λ lüütiline arengutee
1 - täispika faagi DNA ühe segmendi pakend faagipeas; 2 - täisväärtusliku faagiosakese kokkupanek.
Faagi λ DNA suurus on ligikaudu 50 kb ja märkimisväärne osa sellest (umbes 20 kb) ei ole faagi paljunemiseks hädavajalik ja vastutab selle peremees-DNA-sse lülitamise eest. Sellega seoses tekkis mõte, et selle võiks asendada samaväärse suurusega teise DNA fragmendiga. Saadud rekombinantne molekul replitseerub rakus "rekombinantse" faagi DNA-na, mis on "sisendunud" lüütilisele arenguteele. Rekombinantsed molekulid pakitakse bakteriofaagi λ peadesse in vitro ja pärast protsesside lisamist saadakse nakkusohtlikud faagiosakesed (joonis 24).
Riis. 24. λ-faagivektorite kasutamine DHA fragmentide kloonimiseks rakkudes E. coli.
Ekstraktide ettevalmistamine faagi λ DNA in vitro pakendamiseks viiakse läbi kahe tüve abil E. coli, millest igaüks on lüsogeenne faagi λ teatud mutantse tüve suhtes (joonis 25). Üks mutantidest ei suuda sünteesida valku A (üks faagiterminaasi polüpeptiididest), teine ei suuda sünteesida valku E (faagi peavalk). Mõlemad need valgud on vajalikud faagi λ DNA pakendamiseks. “A”- ja “E”-ekstraktid segatakse ja lisatakse konkatemeerne (täispika faagi DNA segmendid polümeriseeritakse vastavalt cos-saidid) faagi DNA, mis seondub terminaasiga enne selle lõikamist cos saidid ja pakendatakse faagipeadesse.
Riis. 25. Pakkimine in vitro Faagi λ DNA
Alla 38 kb pikkuse DNA molekuli pakkimisel. saadakse mitteinfektsioosne faagiosake ja fragmendid pikkusega üle 52 tonni, b.p. ei mahu pähe. Segmendid pikkusega 50 kb. lineaarses DNA molekulis eraldavad need cos-saidid ja just nendes kohtades lõigatakse molekul läbi, kui järgmine segment pea täidab. Lõikamine toimub ensüümi abil, mis asub pea sissepääsu juures.
Võõra geneetilise informatsiooni fragmendiga rekombinantse faagi DNA sisestamise protsess retsipientrakkudesse põhineb looduslikul nähtusel – faagi DNA transduktsioonil.
transduktsioon(lat. transduktsioon- liikumine) on bakteriaalse DNA ülekandmine ühest rakust teise bakteriofaagi abil. Seega ei nõua bakterirakkude transformatsioon faagi DNA-l põhineva rekombinantse DNA abil retsipientrakkude erilist ettevalmistust ega mingeid spetsiaalseid instrumente.
Rekombinantse DNA-ga faage sisaldavate rakkude otsimiseks kasutatakse molekulaarset hübridisatsiooni ja immunoloogilisi skriinimismeetodeid, millest tuleb juttu järgmises osas.
Üks paljutõotavamaid geenide rakkudesse sisestamise süsteemide variante on polüpleksid, mis on ülekantud DNA ja erineva iseloomuga katioonsete polümeeride kompleksid. Selles artiklis kirjeldatakse mitut tüüpi katioonsetel polümeeridel põhinevate polüplekside omadusi, nende transportimist sihtrakkude tuumadesse, samuti ühte lähenemisviisi pahaloomuliste kasvajate raviks nende konstruktsioonide abil.
Sissejuhatus
Geeniteraapia on pärilike, onkoloogiliste ja muude haiguste ravimine patsiendi rakkudesse vajaliku geneetilise materjali viimisega, et muuta geenidefekte või anda rakkudele uusi funktsioone [Gorbunova et al., 1997]. DNA või RNA toimetamiseks sihtrakkudesse luuakse kandjad (vektorid), et tagada transfektsiooni kõrge tase, s.t. eksogeense (võõra) DNA või RNA ülekandmine teatud tüüpi rakkudesse. Lisaks peavad vektorid tagama geneetilise informatsiooni kaitse, kuna in vivo tingimustes on võõr-DNA ebastabiilne kiire lagunemise tõttu seerumi nukleaaside, nukleiinhappeid lagundavate ensüümide poolt.
Geneetilise materjali transportijate tüübid
Looduses on geneetilise teabe rakkudesse edastamiseks spetsiaalsed struktuurid - viirused. Seetõttu hakati neid kasutama geenitransportööridena. Samal ajal on viirusvektorite kasutamisel mitmeid piiranguid. Esiteks on see ülekantud geneetilise materjali väike maht ja viirustele omane rakuline spetsiifilisus. Teiseks on see võimalus, et viirused naasevad metsiktüüpi rekombinatsiooni tulemusena sama tüüpi nakkuse läbimise ajal. Kolmandaks on viirusosakeste valgud väga immunogeensed, mistõttu nende korduv manustamine põhjustab immuunvastuse. Lõpuks on viirusvektorite masstootmine endiselt üsna problemaatiline ja kulukas. Praegu arendatakse aktiivselt katioonsetel lipiididel ja katioonsetel polümeeridel põhinevaid mitteviiruslike kandjate erinevaid variante. Need katioonsed molekulid on elektrostaatiliste interaktsioonide tõttu võimelised spontaanselt moodustama negatiivselt laetud DNA molekuliga isekoosnevaid nanokomplekse. Katioonsetest lipiididest ja DNA-st koosnevaid isekoosnevaid komplekse nimetatakse lipoplexideks, mis koosnevad katioonsetest polümeeridest ja DNA - polüpleksidest.
Katioonsed polümeerid, mida kasutatakse polüplekside loomiseks
Geeniteraapia ja biotehnoloogia eesmärkidel pakuti välja suur hulk katioonseid polümeere või polükatioone. Polükatsioonid kondenseerivad DNA kompaktseteks nanokompleksideks, tagades DNA stabiilsuse ja kaitse nukleaaside eest. DNA-d siduvate polümeeridena võivad olla katioonsed valgud, sünteetilised aminohapete homopolümeerid (polülüsiinid, polüarginiinid), kitosaanpolüsahhariid, polüetüleenimiin, erineva koostisega dendrimeerid ja muud modifitseeritud polümeerid. DNA tihendamise astme määrab kompleksi kogulaeng, mis omakorda sõltub positiivsete polümeerirühmade arvu ja negatiivsete DNA fosfaatrühmade arvu suhtest. Polükatsiooni on polüplekside koostises tavaliselt liialdatud, mille tulemusena tekivad nanosuuruses kompleksid (mitu kümneid kuni mitusada nm), mis lahustuvad vees ja on positiivselt laetud (joon. 1, 2). Vastasel juhul on kompleksid ebastabiilsed.
Riis. 1. Polüplekside moodustumise skeem katioonsetest polümeeridest ja ringikujulisest DNA molekulist (plasmiidist). Riis. 2. Tabil saadud polüplekside kujutis substraadil (skaalajaotus 200 nm), .
Üks esimesi polükatione, mida geeni kohaletoimetamiseks kasutati, oli polü-L-lüsiin (PL, joonis 3), mis oma peptiidse olemuse tõttu on biolagunev, mis teeb selle in vivo kasutamiseks äärmiselt mugavaks. Sageli kasutatakse PL kopolümeeri polüetüleenglükooliga (PEG), et kõrvaldada suure pinnalaengu tihedusega seotud soovimatud mõjud. Selle modifikatsiooni tulemusena väheneb kompleksi pindlaeng, mis takistab negatiivselt laetud vereseerumi valkude mittespetsiifilist adsorptsiooni polüpleksidele ning vähendab ka komplekside tsütotoksilisust.
Polüetüleenimiini (PEI, joon. 3) peetakse üheks kõige lootustandvamaks polükatioonide variandiks sellel põhinevate polüplekside loomiseks. PEI sünteesitakse kahel kujul: lineaarne ja hargnenud. PEI-l on suur hulk protoneerumisvõimelisi amino- ja iminorühmi, mille tulemusena on sellel füsioloogilistes tingimustes puhverdavad omadused. PEI-põhised polüpleksid eristuvad teiste polükatioonidega võrreldes tõhusama transfektsiooni ja kaitsega nukleaaside eest, mis on seotud PEI kõrge laengutihedusega ja kompaktsema DNA voltimisega. Tugev positiivne laeng põhjustab PEI toksilisust, mis koos PEI biolagunemise puudumisega on PEI in vivo kasutamist piiravad tegurid. Tsütotoksilisuse vähendamiseks on PEI modifitseeritud polüetüleenglükooliga, millel on madal toksilisus ja kõrge hüdrofiilsus.
Riis. 3. Polüplexide loomiseks kasutatavad katioonsed polümeerid ja.
Teiseks geneetilise teabe edastamisel kasutatavate polükatioonide esindajaks on polüamidoamiinid (PAMAM, joonis 3). Need ühendid on tugevalt hargnevad dendrimeerid. Tänu hargnemisele on PAMAM-idel suur paindlikkus, suuremal määral kompaktne DNA, nendel põhinevad polüpleksid on stabiilsemad kui kõik teised, . Oma omaduste poolest on sellel palju ühist PEI-ga.
Kitosaanid (joonis 3) on polüsahhariidid, mis on ehitatud D-glükosamiinist ja N-atsetüül-D-glükosamiinist, mis on seotud (1>4) glükosiidsidemetega. Sõltuvalt molekulmassist ja deatsetüülimise astmest moodustavad kitosaanid ülekantud DNA-ga erineva suurusega stabiilseid komplekse. Väikesed või vastupidi liiga suured kitosaani polümeerid põhjustavad ülekantud geeni ekspressiooni vähenemist. Kitosaani baasil valmistatud polüplekside peamine eelis on biolagunevus, .
Polüplekside kohaletoimetamise efektiivsust mõjutavad paljud tegurid: molekulmass, hargnemisaste, polümerisatsioon ja polümeeri tüüp, osakeste suurus, lahuse ioontugevus, komplekside pinnalaengud, aga ka katse tingimused. Optimaalne lähenemine peaks võtma arvesse kõiki neid tegureid ja nende mõju kompleksi omadustele, komplekside omastamisele sihtrakkude poolt ja toksilisusele.
Polüplekside toime spetsiifilisuse tagamiseks sihtrakkudele on mitu lähenemisviisi. Üks neist hõlmab nanokomplekside sihipärast kohaletoimetamist teatud tüüpi rakkudesse. Seda lähenemist seostatakse komponentide (ligandide) kinnitumisega polüpleksidele, mille retseptoreid leidub sihtrakkude pinnal suurel hulgal. Spetsiifiliste ligandidena kasutatakse erinevaid valke, suhkruid, peptiide, antikehi jne. Teine strateegia on kasutada selliseid transporditavaid geene, mis oleksid aktiivsed ainult teatud rakkudes, samas kui komplekside kohaletoimetamine toimub mittespetsiifiliselt, st mis tahes rakkudesse.
Polüplekside tungimine sihtrakkudesse
Geneetilise materjali kohaletoimetamise protsess hõlmab kahte etappi: ekstratsellulaarne (tee süstekohast sihtrakkudeni) ja rakusisene (koostoime sihtrakkudega, endotsütoos, väljumine endosoomidest, kohaletoimetamine tuuma). Polüplekside rakusisesed transporditeed on näidatud joonisel 4.
Esimene barjäär, mille polüpleks peab ületama teel sihtrakku, on veri ja rakuväline maatriks. Sellepärast on vaja valida kompleksi sellised füüsikalis-keemilised parameetrid, et suurendada selle stabiilsust, vältida mittespetsiifilisi koostoimeid ja immuunvastuse võimalust. Esiteks peab polüpleksis olev DNA olema kaitstud ekstratsellulaarsete nukleaaside toime eest. Teiseks on negatiivse laenguga vereseerumi valgud (albumiin, fibrinogeen, immunoglobuliinid jne), aga ka ekstratsellulaarsed maatriksvalgud (kollageenid) võimelised adsorbeeruma laetud nanokomplekside pinnale, mis toob kaasa polüplexide pinnalaengu muutumise. viib komplekside suuruse suurenemiseni ja nende agregeerumiseni. Kui polüpleksid viiakse kehasse, kogunevad need osaliselt kudedesse ja läbivad fagotsütoosi. Nendel põhjustel kasutatakse polüplekside kohalikku manustamist sageli (näiteks vähi korral kasvajasse) nende mittespetsiifilise interaktsiooni arvutamiseks koerakkudega.
Riis. 4. Polüplekside rakusisesed transporditeed,.
Polüpleksid adsorbeeritakse esmalt plasmamembraanile, neelatakse endotsütoosi teel, seejärel peavad nad lahkuma endolüsosoomidest ja ületama tuuma ümbriku, et siseneda tuuma. On ka alternatiivseid transporditeid, mis ei vii alati komplekside tuumani toimetamiseni. Lisaks nõuab ülekantud geeni ekspressioon polüpleksi dissotsieerumist katioonseks polümeeriks ja vabaks DNA-ks.
Järgmine samm geneetilise materjali kohaletoimetamisel sihtrakkudesse on nende interaktsioon plasmamembraaniga ja neeldumine rakus. Nagu ülalpool märgitud, toimub polüplekside seondumine rakkudega ligandi puudumisel mittespetsiifiliselt elektrostaatilise interaktsiooni tulemusena negatiivselt laetud plasmamembraaniga. Enamikul juhtudel võetakse sellised polüpleksid kinni mittespetsiifilise adsorptiivse endotsütoosi käigus. Lisades kompleksi ligandi, saab omastamist saavutada klatriinist sõltuva retseptori vahendatud endotsütoosiga. Teised omastamisteed on rakutüübist sõltuvad ja hõlmavad fagotsütoosi ja kaveoliinist sõltuvat endotsütoosi. Üks strateegia polüplekside rakkudesse kohaletoimetamise parandamiseks hõlmab viirusesse sisenevate peptiidide, nagu TAT-peptiidi, kasutamist, mis eraldati esmalt HIV-1 viirusest. Nende järjestuste kasutamine tagab konstruktsioonide sisenemise rakku ja polüplekside tarnimise raku tuuma.
Polüplekside transporditee üks olulisemaid etappe on nende väljumine endosoomidest. Teatavasti on endosoomid tuubulite ja vesiikulite süsteem, mis on vajalik imendunud makromolekulide sorteerimiseks. Sorteerivad endosoomid asuvad plasmamembraanile lähemal. Prootonpumpade töö tõttu langeb neis pH (endosoomide sorteerimisel umbes 6,5). Edasine transport võib kulgeda kas retsirkulatsiooni teed mööda neeldunud molekulide vabanemisega membraanivälisesse ruumi või mööda poliitilist teed, kui hilistes endosoomides toimub keskkonna edasine hapestumine ja makromolekulid sisenevad lüsosoomidesse. Lüsosoomides hapestatakse sisaldus pH 5-ni ja imendunud molekulid lagundatakse hüdrolüütiliste ensüümide toimel, mis aktiveeruvad madalal pH-l. Laguproduktid eemaldatakse rakust eksotsütoosi teel või viiakse tsütoplasmasse, kus neid kasutatakse ehitusmaterjalina.
Arvatakse, et PEI-põhised polüpleksid on oma omaduste tõttu võimelised endosoomidest lahkuma nn prootonkäsna efekti tõttu. See hüpotees põhineb asjaolul, et katioonsed polümeerid tekitavad protoneerimata sekundaarsete ja tertsiaarsete amiinide olemasolu tõttu puhverefekti, mille tulemusena hakkab aktiivsemalt tööle prootoneid endosoomidesse pumpav H±ATPaas. Sel juhul kogunevad endosoomidesse kloriidi anioonid. Selle tulemusena tekib osmootse rõhu järsu suurenemise tõttu turse ja lüüs, mis võimaldab polüpleksidel tervena tsütosooli siseneda. Välja on pakutud ka teine mehhanism polüplekside vabastamiseks endosoomidest, mis seisneb endosomaalse membraani destabiliseerimises nanokomplekside kõrge pinnalaengu tiheduse tõttu. PL-l ja kitosaanil põhinevad kompleksid ei põhjusta "prootonkäsna" efekti ja on vähem võimelised endosoomi membraani destabiliseerima, mis toob kaasa palju madalama transfektsiooni efektiivsuse.
Pärast lüsosoomidest lahkumist satuvad polüpleksid perinukleaarsesse ruumi, misjärel kompleks dissotsieerub vabaks polükatiooniks ja DNA-ks. Arvatakse, et see on tingitud konkurentsist katioonrühmade pärast DNA fosfaatrühmade ning madala molekulmassiga ühendite ja tsütoplasma anioonide vahel. Mõnel juhul toimub kompleksi dissotsiatsioon ilmselt tuumas. Peamine barjäär plasmiidse DNA teel rakutuuma on kahekordne tuumaümbris. Makromolekulide tuuma edastamiseks sisaldavad need tuuma lokaliseerimise järjestust (NSL), mis koos β- ja β-importiinidega tunneb ära tuumapooride kompleksi (NPC) poolt ja tungib aktiivselt tuuma. Passiivse difusiooni teel saavad NPC-st läbida ainult väikesed molekulid (<40 кД, ~10 нм). Так как освободившаяся после распаковывания комплекса свободная плазмидная ДНК не имеет последовательности ядерной локализации, то в ядро будет проходить очень незначительная часть плазмид (не более 0,1–0,001%). Кроме того, установлено, что около 50% инъецированной ДНК деградирует в цитозоле уже через 1–2 часа после введения . Но т.к. клетки опухолей, против которых и направлена генная терапия, отличаются активной пролиферацией, то ДНК без труда проникает в ядра дочерних клеток во время митотического цикла, когда ядерная оболочка демонтирована.
Terapeutiliste geenide toimemehhanismid
Pärast plasmiidi tungimist tuuma algab terapeutilise geeni ekspressioon. Polüplekside toimele spetsiifilisuse andmiseks asetatakse plasmiidis olev terapeutiline geen promootori (geeni piirkond, millel RNA polümeraas asub enne transkriptsiooni) kontrolli alla, mis on aktiivne ainult kasvajakudedes. Näideteks on apoptootilise valgu surviviini geeni või ensüümi telomeraasi geeni promootor. Terapeutilise geenina võib kasutada herpes simplex viiruse tümidiini kinaasi (HSVtk) geeni, millel on võime fosforüülida herpesevastaseid ühendeid atsükloviiri ja gantsükloviiri. Need ühendid süstitakse mõne aja pärast kasvajasse. Lisaks muudavad raku kinaasid (fosforüülivad ensüümid) fosforüülitud atsükloviiri või gantsükloviiri trifosfaatideks, mis on võimelised sisalduma äsja sünteesitud DNA-s raku jagunemise ajal kahekordistudes ja lõpetama selle sünteesi. Selle tulemusena hävivad nende ainete juuresolekul rakud, mille tuumadesse on sisenenud tümidiini kinaasi geen. Sel juhul surevad jagunevad rakud, mitte puhkerakud, mis ei sünteesi DNA-d ega sisalda gantsükloviiri ega atsükloviiri. Seda terapeutilise geeni toimemehhanismi saab kasutada vähkkasvajate geeniteraapias, mille rakud jagunevad kiiresti.
Bibliograafia:
- Gorbunova V.N., Baranov V.S. Sissejuhatus pärilike haiguste molekulaardiagnostikasse ja geeniteraapiasse. S.-Pb., "Erikirjandus", 1997, lk 287.
- Dunlap D.D., Maggi A., Soria M.R., Monaco L. Geeni kohaletoimetamiseks kondenseeritud DNA nanoskoopiline struktuur. //Nucl. Happed. Res., 1997, kd. 25, 3095–3101.
- Park T.G., Jeong J.H., Kim S.W. Polümeersete geenide kohaletoimetamise süsteemide hetkeseis. // Adv. narkootikumide tarnimine. Rev., 2006, kd. 58, 467–486.
- Pack D. W., Hoffman A. S., Pun S. ja Stayton P. S. Geeni kohaletoimetamiseks mõeldud polümeeride kavandamine ja arendamine. // Nature Rev., Drug Discovery, 2005, kd. 4,581.
- Lechardeur D., Verkman A.S., Lukacs G. L. Plasmiidse DNA rakusisene marsruutimine mitteviiruse geeniülekande ajal. // Adv. narkootikumide tarnimine. Rev., 2005, kd. 57, 755–767.
- Maxfield F.R. ja McGraw T.E. Endotsüütiline ringlussevõtt. // Nature Rev. Mol. kamber. Biol., 2004, kd. 5, 121-132.
- Reid R., Eng-Chung M., Eng-Chang H. ja Topal M.D. Atsükliliste, dideoksü- ja aranukleotiidide sisestamine ja pikendamine herpesviridae, inimese alfa- ja beetapolümeraaside poolt. // J. Biol. Chem., 1988, kd. 263, 3898-3904.
Durimanov Mihhail, Moskva Riikliku Ülikooli bioloogiateaduskonna üliõpilane
Artikkel on populaarteadusliku konkursi võitja konverentsil "Lomonossov 2009" (bioloogiateaduskond, rubriigid "Nanobiotehnoloogia", "Biotehnika", "Biofüüsika".
Paljud uuringud näitavad, et erinevate viiruste kasutamine on väga tõhus lahendus, mis võimaldab läbida organismi immuunkaitse ja seejärel nakatada rakke, kasutades neid viiruse levitamiseks. Selle protseduuri läbiviimiseks valisid geenitehnoloogid retroviiruste ja adenoviiruste rühmast välja sobivaimad viirused. Retroviirused toovad geneetilist teavet ribonukleiinhappe (RNA) kujul, mis on DNA-laadne molekul, mis aitab töödelda DNA-sse salvestatud geneetilist teavet. Niipea, kui on võimalik tungida sügavale nn sihtrakku, saadakse RNA molekulist DNA molekuli koopia. Seda protsessi nimetatakse pöördtranskriptsiooniks. Kui uus DNA molekul on rakule kinnitatud, sisaldavad kõik raku uued koopiad seda modifitseeritud geeni.
Adenoviirused kannavad geneetilist teavet koheselt DNA kujul, mis toimetatakse mittejagunevasse rakku. Kuigi need viirused viivad DNA otse sihtraku tuuma DNA ei sobitu raku genoomi. Seega ei kandu modifitseeritud geen ja geneetiline informatsioon edasi tütarrakkudele. Adenoviirustega läbiviidava geeniteraapia eeliseks on see, et geenid on võimalik viia närvisüsteemi rakkudesse ja hingamisteede limaskestale, taaskord vektori abil. Lisaks on veel kolmas geeniteraapia meetod, mis viiakse läbi nn adeno-assotsieerunud viiruste kaudu. Need viirused sisaldavad suhteliselt väike kogus geneetilist teavet ja neid on palju raskem eemaldada kui retroviiruseid ja adenoviiruseid. Adeno-assotsieerunud viiruste eeliseks on aga see, et nad ei põhjusta inimese immuunsüsteemi reaktsiooni.
Antropogeneetika genealoogiline meetod
Selle meetodi aluseks on sugupuude koostamine ja analüüs. Seda meetodit kasutatakse laialdaselt iidsetest aegadest tänapäevani hobusekasvatuses, veiste ja sigade väärtuslike liinide valikul, tõukoerte hankimisel, aga ka uute karusloomatõugude aretamisel.
Inimese geneetika uurimise meetodina hakati genealoogilist meetodit kasutama alles 20. sajandi algusest, kui selgus, et sugupuude analüüs, milles mõne tunnuse (haiguse) edasikandumine põlvest põlve saab asendada. hübridoloogilisel meetodil, mis tegelikult pole inimestele rakendatav.
Tõupuude koostamisel on allikaks inimene - proband, kelle sugupuud uuritakse. Tavaliselt on see kas patsient või teatud tunnuse kandja, mille pärilikkust tuleb uurida. Genealoogiliste tabelite koostamisel kasutatakse G. Yusti poolt 1931. aastal välja pakutud sümboleid (joon. 6.24). Põlvkondi tähistatakse rooma numbritega, antud põlvkonna üksikisikuid tähistatakse araabia numbritega.
Genealoogilise meetodi abil saab kindlaks teha uuritava tunnuse päriliku tinglikkuse, samuti selle pärilikkuse tüübi (autosoomne dominantne, autosoomne retsessiivne, X-seotud dominantne või retsessiivne, Y-seotud). Mitme tunnuse sugupuu analüüsimisel võib ilmneda nende pärilikkuse seos, mida kasutatakse kromosoomikaartide koostamisel. See meetod võimaldab uurida mutatsiooniprotsessi intensiivsust, hinnata alleeli ekspressiivsust ja läbitungimist. Seda kasutatakse laialdaselt meditsiinilises geneetilises nõustamises järglaste ennustamiseks. Siiski tuleb märkida, et sugupuu analüüs muutub palju keerulisemaks, kui peredes on vähe lapsi.