Доцент по химическо инженерство във Virginia Tech Chang Lu. (Снимка: Virginia Tech)
Доцент по химическо инженерство във Virginia Tech ( Virginia Tech) Чанг Лу и неговият изследователски екип от инженери-химици са открили как "значително да подобрят" доставянето на генетичен материал в клетката - ДНК. Статия, описваща тяхната работа, е публикувана в основното списание за микрофлуидика Лаборатория на чип, както и в Природата .
Крайната цел на д-р Лу е да приложи разработения от тях метод в областта на създаването на генетично модифицирани клетки за имунотерапия на рак, лечение стволови клеткии регенерация на тъканите.
Един от най-широко използваните физически методи за доставяне на гени в клетките е "невероятно неефективен, защото само малка част от общата повърхност на мембраната е пропусклива", казва д-р Лу.
Методът, към който Лу се обърна, се нарича електропорация, по името на известния от десетилетия феномен на увеличаване на пропускливостта на клетките в резултат на прилагане на електрическо поле върху тях, което води до образуването на малки пори в мембраната им.
Д-р Лу обяснява механизма на действие на метода на електропорация, който той и колегите му подобриха по този начин: „Конвенционалните методи на електропорация доставят ДНК само през много ограничена част от клетъчната повърхност, определена от физическите явления, които управляват взаимодействията между електрическите полето и клетката. Нашият метод прави възможно постигането на равномерно доставяне на ДНК по цялата клетъчна повърхност, което, доколкото ни е известно, е демонстрирано за първи път. Резултатът е огромно увеличение на трансфера на генетичен материал.
Новият подход използва „хидродинамични ефекти, които възникват само когато флуидните потоци се движат през извити канали. Известно е, че при такива условия потокът образува вихри. Клетките, носени от такъв поток, се въртят и по-голямата част от тяхната повърхност е изложена на електрическото поле. Доставката на ген чрез поток в извити канали има значителни предимства пред традиционната електропорация в статични разтвори и прави канали.
„Спиралният канал дава двойно увеличение в сравнение с прав канал и дори повече в сравнение със статично решение“, обяснява ученият.
Използвайки флуоресцентна микроскопия, учените успяха да „начертаят“ електропорираните зони на клетъчната повърхност и да определят степента на поглъщане на ДНК.
Снимката е предоставена с любезното съдействие на Lab on a Chip
Конвенционалното доставяне на ДНК с помощта на кюветни устройства със статична клетъчна суспензия се извършва само в тясна ивица от клетъчната повърхност. Когато се извършва електропорация върху клетки, плаващи в спирален или извит канал, изображенията са значително различни, демонстрирайки равномерно разпределение на ДНК трансфера по цялата клетъчна повърхност.
Изобретението се отнася до областта на биотехнологиите, по-специално до метод за целенасочено доставяне на ДНК до туморни и стволови клетки, експресиращи CXCR4 рецептора. Настоящото изобретение може да се използва за целенасочено доставяне на генетични конструкции до стволови и злокачествени туморни клетки с цел коригиране на генни дефекти и предотвратяване на заболявания. Методът включва приготвяне на носители на генетични конструкции чрез включване на сигнални последователности в състава на молекулите носители, които представляват ДНК-свързваща последователност от осем аминокиселинни остатъка на лизин - KKKKKKKKK. Прикрепването на сигналната последователност към ДНК-свързващата последователност се извършва с помощта на линкерна секция от две молекули на ε-аминохексанова киселина. След това се образуват комплекси ДНК/носител. След това трансфекцията се извършва in vitro. Предложеното изобретение дава възможност да се повиши ефективността на доставяне на гена, който представлява интерес, до туморни и стволови клетки. 2 т.п. f-ly, 4 ил.
Изобретението се отнася до генната медицина, генната терапия, биотехнологиите и фармацевтиката и може да се използва за целенасочено доставяне на генетични конструкции до стволови и злокачествени туморни клетки с цел коригиране на генни дефекти и предотвратяване на заболявания. Тъканно-специфичното доставяне на генни конструкции се осигурява чрез използването на сигнални последователности за CXCR4 рецептора, който се експресира в клетки от този тип.
Това, което отличава генната терапия от подходите на конвенционалната медицина, е нейният фокус върху борбата с причината за заболяването, а не със симптомите и последствията. В момента се разработват подходи за генна терапия за лечение или предотвратяване на широк спектър от човешки заболявания. Тези подходи могат да бъдат приложими за in vivo и ex vivo терапия. In vivo терапията се основава на директното въвеждане на генетични конструкции директно в телесните тъкани. Доставката може да се извърши интравенозно с помощта на аерозолни опаковки или инжекции в специфични тъкани. Генната терапия ex vivo се основава на изолирането на специфичен тип клетки от тялото, въвеждането в тях на "терапевтичен" генен конструкт, подбор на трансфектирани клетки и последваща реимплантация в пациент.
Има три основни направления в разработваните към момента подходи за доставка на генетични конструкции:
1) клониране като част от вирусни вектори;
2) използване на физични методи на трансфекция;
3) използването на комплекси от плазмидни експресионни вектори и невирусни молекули-носители.
Вирус-медиираният трансфер е високоефективен метод за доставяне на ДНК до целевите клетки, тъй като навлизането на модифициран вирусен вектор е подобно на процеса, който се случва естествено, когато вирусният геном се прехвърли в клетките гостоприемници. Най-изследвани са векторите, създадени на базата на ретро-, адено-, адено-асоциирани вируси. Предимствата на вирусите включват, на първо място, комбинацията от свойствата на експресионния вектор и носителя, възможността за специфично доставяне, способността за трансфектиране на делящи се и неделящи се клетки, възможността за вграждане на ДНК в хромозомата, за да се гарантира дългосрочно изразяване. Поради тези предимства, този подход все още се използва широко в изследванията за доставка на гени, въпреки че има някои недостатъци. Ретро- и адено-асоциираните вируси имат ограничен размер на клонирания ДНК фрагмент и риск от инсерционна мутагенеза, когато вирусът се вмъкне в генома на гостоприемника. Сериозен недостатък на аденовирусните вектори е изразеният имунен отговор при високи дози и повтарящи се инжекции на аденовирусни конструкции (Walther W., Stein U. Viral vectors for gen transfer: a review of their use in the treation of human disease // Drugs. - 2000. - v. 60. - P. 249-271, RF патент № 2252255, C12N 15/37, C12N 15/86, C12N 15/861, C12N 15/867, публикуван 2005.05.20).
Инжектирането на голи плазмидни ДНК конструкции беше един от първите подходи в разработването на стратегии за лечение с генна терапия. Ниската ефективност на трансфекцията с помощта на "гола" ДНК даде тласък на разработването на нови методи за доставка на генетични конструкции. Изследвани са различни физически методи за доставяне на ДНК до клетките на тялото. Най-популярни сред тях са методът на балистичната трансфекция и електропорацията, които се използват широко за трансфекция на кожни и мускулни клетки. Методът на балистична трансфекция се основава на проникването в клетката на ДНК, нанесена върху златни или волфрамови микрочастици. Трансфекцията се извършва под налягането на поток от сгъстен газ или течност. Методът на електропорация се основава на локална промяна в електрическия потенциал на клетъчната мембрана поради действието на електрически ток. Електрическите импулси водят до образуването на пори в клетъчната мембрана, като по този начин я правят пропусклива за биомолекулите. За преодоляване на ниската ефективност на голата ДНК трансфекция in vivo се използва и методът на хидродинамичния шок - венозно или интраартериално инжектиране на плазмиден вектор в голям обем разтвор. Основните недостатъци на съществуващите физични методи за трансфекция са ниската ефективност и локалността на ефекта от доставката на ДНК. Те позволяват на плазмида да преодолее клетъчната мембрана и да избегне включването в ендозомите, като по този начин предотвратява ензимното разграждане, но като правило не осигуряват дълготрайна устойчивост на въведените генетични конструкции (Wells D.J. Gene therapy progress and prospects: electroporation and other физични методи // Gene Ther.- 2004. - v.11, No. - 2004. - т. 245. - С. 185-196; Herweijer H., Wolff J. A. Напредък и перспективи: трансфер и терапия на гол ДНК ген // Генна терапия. - 2003. - т. 10, № 6. - С. .453-458).
Невирусните носители са алтернатива на вирусно-медиирания трансфер на генетични конструкции в клетки на бозайници. Невирусните носители се синтезират лесно, лекотата на тяхната модификация позволява да се правят промени в структурата и състава на молекулите, като по този начин се подобряват средствата за доставка. Когато се използва невирусна среда, няма ограничения за размера на доставения експресионен вектор. Освен това те са по-малко токсични, в повечето случаи не предизвикват специфичен имунен отговор и са по-безопасни за използване in vivo от вирусните вектори. Следователно въвеждането на генетичен конструкт, опакован в невирусни носители, може да се повтори. Изследването на невирусни носители се развива в посока на подобряване на трансфекционните свойства на плазмидната ДНК чрез образуване на ДНК комплекси с различни синтетични съединения (липиди, олиго- и полипептиди, полимери и др.) (например RF патент № 2336090 , A61K 39/00, A61K 47/00, публикувано 20.10.2008 г.). Подобряването на невирусните носители до голяма степен зависи от подробното разбиране на бариерите пред проникването на ДНК в клетките на тялото (Schmidt-Wolf GD, Schmidt-Wolf I.G. Невирусни и хибридни вектори в човешката генна терапия: актуализация // Trends Mol Med.- 2003. - v.9, No. - 2005. - v.11, No. 4. - P.110-121; Wiethoff C.M., Middaugh C.R. Бариери пред доставката на невирусен ген // J Pharm Sci. - 2003. - v.92, No. 2. - P .203-217).
Смята се, че невирусният носител трябва да има следните характеристики:
1) да бъде нетоксичен, компактен и да предпазва плазмидната ДНК от ензимно разграждане, да се екскретира от тялото след употреба;
2) осигуряване на проникването на плазмида в клетката чрез специфично свързване към плазмената мембрана на клетката:
3) имат способността да освобождават ДНК от ендозомния компартмент;
осигуряват дисоциацията на ДНК от комплекса за последващ транспорт на плазмида в ядрото.
За целите на генната терапия най-предпочитаният метод за доставяне на генетични конструкции е техният тъканно-специфичен трансфер в клетките и тъканите на тялото.
Първата бариера за вътреклетъчното проникване на комплексите е плазмената мембрана. Повечето комплекси взаимодействат с клетъчната повърхност чрез електростатични сили. Възможен механизъм за свързване на комплексите с клетката е тяхното взаимодействие с протеини на клетъчната повърхност, гликозаминогликани. При този механизъм на проникване на комплексите обаче няма тъканно-специфичен трансфер на генни конструкции. В същото време проблемът за тъканно-специфичното доставяне на генетични конструкции е актуален за генната терапия на редица заболявания. За специфично взаимодействие с клетъчната повърхност, комплексите включват лиганди към рецепторите на клетъчната повърхност. Към днешна дата са характеризирани редица интегринови пептидни лиганди. Те включват по-специално трипептидния фрагмент RGD (интегрините присъстват на повърхността на много клетки), трансферин (рецепторът му има повишена експресия в пролифериращи клетки), асиалорозомукоид (асиалогликопротеиновият рецептор има специфична експресия в хепатоцитите на черния дроб).
За специфично доставяне на генетичен материал в нервните клетки, Зенг и колеги предложиха да се използва носител, състоящ се от сигнална област за TrkA рецептора (80-108 аминокиселини от нервния растежен фактор) и ДНК-свързваща последователност от 10 лизинови аминокиселинни остатъка. Този носител, в присъствието на ендозомолитичния агент хлорохин, който насърчава освобождаването на комплекси от ендозомалното отделение на клетката, е в състояние да достави тъканно-специфично маркерния ген само до клетки, експресиращи TrkA рецептора. Този носител може да се използва за лечение на генна терапия на различни неврологични заболявания като епилепсия, болести на Паркинсон и Алцхаймер. Той обаче не е подходящ за доставяне на генетичен материал до други типове клетки (Zeng J, Too HP, Ma Y, Luo E, Wang S. Синтетичен пептид, съдържащ верига 4 от нервен растежен фактор за насочена доставка на ген // J Gene Med 2004; 6 : 1247 -1256).
Човешките стволови клетки се считат за обещаващи средства за клетъчна и генна терапия за различни човешки заболявания. В същото време те са сред най-трудните за трансфектиране видове клетки. При лечението на рак с генна терапия е необходимо да се осигури доставянето на гени директно до туморните клетки.
CXCR4 е рецептор на миграционен фактор на стволови клетки за хемокина SDF-1α. CXCR4 се експресира в хемопоетични клетки, съдов ендотел и мускулни сателитни клетки. Високо ниво на експресия на този ген е отбелязано в повече от 20 вида ракови тумори (рак на гърдата, рак на простатата и др.), Както и в мигриращи стволови клетки. Рецепторът CXCR4 също е способен да се свързва с вирусния хемокин vMIP-II (вирус на саркома на Капоши). По този начин, включването на сигнални последователности за свързване към CXCR4 рецептора в молекулите на носителя е обещаващ начин за създаване на системи за насочена доставка на ген към туморни и стволови клетки.
За да доставят генетичен материал на клетки, експресиращи рецептора CXCR4, Le Bon и колеги са използвали синтетичен лиганд за този рецептор, AMD3100, който е свързан с полиетиленимин или катионни липиди. Комплексите от генетичен материал с тези съединения не водят до значително повишаване на ефективността на доставяне на маркерен ген до CXCR4+ клетки в сравнение със съединения без сигнали. Носителите, използвани от Le Bon, не са ефективни, тъй като специфичното доставяне с тяхна помощ е възможно само когато към трансфекционната среда се добави вещество, което насърчава интернализацията на рецептора CXCR4 (форболов естер). (Le Bon B, Van Craynest N, Daoudi JM, Di Giorgio C, Domb AJ, Vierling P. AMD3100 конюгати като компоненти на насочени невирусни системи за доставяне на гени: Синтез и in vitro трансфекция Ефикасност на CXCR4-експресиращи клетки // Bioconjugate Chem 2004 , 15: 413-423).
По този начин има нужда да се създаде носител на генетични конструкции, който може да осигури специфична доставка до CXCR4(+) клетки и да не засяга близките тъкани. Такъв метод е осигурен от настоящото изобретение.
Изобретението се основава на задачата да се разработи метод за специфично доставяне на генетични конструкции до клетки, експресиращи CXCR4 рецептора, при който чрез използване на носители на генетични конструкции, съдържащи сигнални последователности за CXCR4 рецептора, се повишава ефективността на доставяне на генът "интерес" се постига. Важно е да се отбележи, че синтезата на претендираните носители може да бъде извършена с помощта на всеки от известните методи за твърдофазов пептиден синтез.
Решението на техническия проблем се осигурява от факта, че в метода за целенасочена доставка на ДНК до туморни и стволови клетки, експресиращи рецептора CXCR4, включващ подготовката на носители на генетични конструкции чрез включване в състава на молекулите на носителя, което е ДНК-свързваща последователност от осем лизинови аминокиселинни остатъка - KKKKKKKK, сигнални последователности, образуване на комплекси ДНК/носител, извършване на трансфекция in vitro, сигналната последователност е избрана от групата: фрагмент от 1 до 8 аминокиселини на последователност на N-края на протеина SDF-1α - KPVSLSYR; фрагмент от 1 до 17 аминокиселини от последователността на N-края на SDF-1α протеина - KPVSLSYRCPCRFFESH, където 9 и 11 аминокиселини са заменени със серин; или фрагмент от 1 до 10 аминокиселини от N-терминалната последователност на вирусния хемокин vMIP-II - LGASWHRPDK; прикрепването на сигналната последователност към ДНК-свързващата последователност се извършва с помощта на линкерно място от две молекули на ε-аминохексанова киселина.
В този случай сигналната последователност може да бъде фрагмент от аминокиселини 1 до 8 от последователността на N-края на протеина SDF-1α-KPVSLSYR.
Алтернативно, сигналната последователност може да бъде фрагмент от 1 до 17 аминокиселини от последователността на N-края на SDF-1α протеина - KPVSLSYRCPCRFFESH, където 9 и 11 аминокиселини са заменени със серин.
Фрагмент от аминокиселини 1 до 10 от N-терминалната последователност на vMIP-II вирусния хемокин, LGASWHRPDK, синтезиран от D-аминокиселини, може също да се използва като сигнална област.
Глицеролът или хлорохинът могат да се използват като компонент, осигуряващ изхода от ендозоми на комплекси, състоящи се от носители и генетичен материал.
Плазмидната ДНК може да се използва като генетичен материал за носители.
Посоченият технически резултат в настоящото изобретение се постига чрез използването на олиголизинови молекули - KKKKKKKK (K8) като носител, конюгиран със сигнални последователности към CXCR4 рецептора от SDF-1 или vMIP-II протеини, а именно N-терминалната последователност на хемокина SDF-1 (с 1 до 8 аа) или N-терминалната последователност на хемокина SDF-1 (от 1 до 17 аа, със заместване на 9 и 11 аа със серин) или N-терминалната последователност на vMIP-II вирусен хемокин (от 1 до 10 аа в D-конформация). Наличието на олиголизин KKKKKKKK в състава на носителя позволява на конюгатите да образуват комплекси с нуклеинови киселини, по-специално с плазмидна ДНК, поради електростатично взаимодействие.
Посоченият технически резултат се постига чрез три варианта на предложената среда.
Посоченият технически резултат съгласно първия вариант се постига с факта, че в късия CDP носител на базата на синтетични аналози на хемокина SDF-1, който включва катионен компонент, който е К8 олиголизин, използван за кондензация на плазмидна ДНК, и лиганд компонент за взаимодействие с рецептора CXCR4, съгласно изобретението, фрагмент (1-8 аа) от последователността на N-края на протеина SDF-1, имащ структурата KPVSLSYR и притежаващ активността на агонисти на рецепторът CXCR4, се използва като компонент на лиганда, а катионният компонент на конюгата има структурата KKKKKKKK и е прикрепен към компонента на лиганда чрез спейсер - две молекули ε-аминохексанова киселина (Ahx).
Посоченият технически резултат по втория вариант се постига чрез факта, че в носителя (дълъг CDP) на базата на синтетични аналози на хемокина SDF-1, който включва катионен компонент, който е К8 олиголизин, използван за кондензация на плазмидна ДНК, и лиганден компонент за взаимодействие с CXCR4 рецептора, в съответствие с претендираното изобретение, фрагмент (1-17 аа; аа9 и аа11 заместени със серин) от последователността на N-края на SDF-1 протеина, имащ структурата KPVSLSYRSPSRFFESH и притежаваща активността на агонисти на рецептора CXCR4, се използва като лиганден компонент, а катионният компонент на конюгата има структурата KKKKKKKK и е свързан към лигандния компонент чрез спейсер - две молекули ε-аминохексанова киселина.
Посоченият технически резултат по третия вариант се постига с факта, че в носителя (вирусен CDP) на базата на синтетични аналози на протеина на вируса на саркома на Капоши vMIP-II, който включва катионен компонент, който е К8 олиголизин, се използва за кондензация на плазмидна ДНК и лиганден компонент за взаимодействие с рецептора CXCR4, в съответствие с заявеното изобретение, фрагмент (1-10 Daa - синтезиран от D-аминокиселини) от последователността на N-края на vMIP -II протеин, имащ LGASWHRPDK структура и притежаващ активността на антагонисти на CXCR4 рецептора, се използва като лиганден компонент, а катионният компонент на конюгата има структурата KKKKKKKKK и е свързан към лигандния компонент чрез спейсер - две молекули от ε-аминохексанова киселина.
И трите варианта на претендирания носител могат да бъдат синтезирани, като се използват известни методи за синтез на пептиди, например методът Boc на твърдата фаза (Merrifield, R.B. Solid phase peptide synthesis. I. The synthesis of a tetrapeptide // Journal of the American Chemical Society. 1963. V.85 (14), pp.2149-2154).
Конкретни примери за изпълнение
Изобретението е илюстрирано с позоваване на Фигура 1, която показва промяната в интензитета на флуоресценция на етидиев бромид с увеличаване на съотношенията на заряда носител/ДНК в къси CDP/ДНК, дълги CDP/ДНК и вирусни CDP/ДНК комплекси. Намаляването на интензитета на флуоресценцията показва увеличаване на плътността на образуваните комплекси. Платото на флуоресцентните криви показва, че комплексите са достигнали плътност, достатъчна за потушаване на флуоресценцията на етидиев бромид.
Фигура 2 показва зависимостта на луциферазната активност в HeLa (CXCR4+) клетки след трансфекция с къси CDP/DNA, дълги CDP/DNA и вирусни CDP/DNA комплекси в присъствието на ендозомолитичния агент глицерол. В този случай бяха използвани комплексите, образувани при следните съотношения на заряда носител/ДНК: 3/1, 6/1, 9/1, 12/1. Интактната молекула, ДНК, PEI/DNA 1/8 комплекси (положителна контрола на експеримента - търговски носител разклонен полиетиленимин 25 kDa - PEI) и комплекси, съдържащи ДНК и контролен пептид (СР) служат като експериментални контроли. СР се различава от носителите в настоящото изобретение по липсата на сигнал за свързване към CXCR4 рецептора и е структурно олиголизин KKKKKKKK. Ефективността на доставяне на маркерен ген от носители на къс CDP, дълъг CDP и вирусен CDP е 10–100 пъти по-висока от тази на контролния CP.
Фигура 3 показва зависимостта на луциферазната активност в A172 (CXCR4+) клетки след трансфекция с къси CDP/DNA, дълги CDP/DNA и вирусни CDP/DNA комплекси в присъствието на ендозомолитичния агент глицерол. Тук използвахме комплекси, образувани при следните съотношения на заряда на носител/ДНК: 9/1, 12/1. Интактна ДНК молекула, PEI/DNA 1/8 комплекси и комплекси, съдържащи ДНК и CP пептид, служат като експериментални контроли. Ефективността на доставяне на маркерен ген от носители на къс CDP, дълъг CDP и вирусен CDP е 10 пъти по-висока от тази на контролния CP.
Резултатите на Фигура 2 и Фигура 3 подкрепят специфичността на носителите в настоящото изобретение за CXCR4 рецептора.
Фигура 4 показва зависимостта на луциферазната активност в СНО (CXCR4-) клетки след трансфекция с къси CDP/ДНК, дълги CDP/ДНК и вирусни CDP/ДНК комплекси в присъствието на ендозомолитичния агент глицерол. Използвани са комплексите, образувани при следните зарядни съотношения носител/ДНК: 9/1, 12/1. Интактна ДНК молекула, PEI/DNA 1/8 комплекси и комплекси, съдържащи ДНК и CP пептид, служат като експериментални контроли. Ефективността на доставяне на маркерен ген чрез къси CDP, дълги CDP и вирусни CDP носители е почти същата като при използване на контролния CP.
Носителите със сигнал не са в състояние да осигурят значително по-високо ниво на доставка на генетичен материал в клетки без рецепторна експресия в сравнение с контролата.
Изпълнението на изобретението може да бъде обяснено по следния начин. Целта на настоящото изобретение е да осигури насочена доставка на генетични конструкции към клетки, експресиращи CXCR4 рецептора, използвайки носители на генетичен материал, съдържащ сигнални последователности за този рецептор.
На първия етап се извършва образуването на комплекси на едно от изпълненията на носителя с генетична конструкция, съдържаща "интересния" ген. Образуваните комплекси се използват за доставяне на генетичния материал до съответните целеви клетки. Анализът на ефективността на клетъчното проникване се оценява чрез ензимни или имунохистохимични методи.
Образуването на комплекси се извършва в изотоничен разтвор. Предпочита се безсолен буфер HBM (Hepes-буфериран манитол). Размерът на получените комплекси е 170–230 nm.
Като генетични конструкции в едно от изпълненията, използващи плазмидна ДНК.
Плазмидната ДНК съдържа маркер (luc, lacZ) или терапевтичен ген (в зависимост от заболяването), под контрола на съответните промотори и енхансери (CMV, SV40 и др.) и други елементи, необходими, например, за репликация в гостоприемника клетка или интегриране в генома. При геннотерапевтично лечение на рак могат да се използват гените за HLA-B7, IL-2, IL-4, TNF, IFN, P53, тимидин киназа и др.
В друго изпълнение, олигонуклеотиди, състоящи се от малка ДНК или РНК, комплементарна на специфична последователност в иРНК или нейния прекурсор, се използват като генетичен конструкт за потискане на синтеза на протеинов продукт или за изхвърляне на екзон, носещ мутация от иРНК. Образуваните комплекси се използват за доставяне на генетичен материал до клетки, експресиращи CXCR4 рецептора. Проникването на носещите комплекси от настоящото изобретение се осъществява предимно чрез рецептор-медииран транспорт чрез свързване към екстрацелуларните домени на CXCR4 рецептора и последващо интернализиране на рецептора.
Дозата на носителите и генетичния материал се определя индивидуално и зависи от вида на клетките, количеството CXCR4 рецептор на повърхността им и сложността на трансфектирането на тези клетки.
За да се повиши ефективността на тези носители, трансфекцията на клетките за предпочитане се извършва с помощта на ендозомолитичен агент. Те включват глицерол, хлорохин и др.. Тези вещества се добавят към трансфекционната среда непосредствено преди комплексите да се добавят към клетките. Те остават несвързани с комплексите и следователно не засягат тяхната структура.
Пептиди, други полимерни съединения, липозоми, способни да уплътняват нуклеинови киселини, могат да се използват като ДНК-свързваща част на носителя. В допълнение, те могат да имат ендозомолитични свойства (няма нужда да се използва допълнителен ендозомолитичен агент) и, когато е необходимо (например за доставяне на терапевтични или маркерни гени), доставят генетичен материал до ядрото.
Когато се избират условията на трансфекция, те са проектирани да осигурят най-висока ефективност на доставяне. За предпочитане е да се инкубират комплекси с клетки в продължение на 4 часа. Можете обаче да варирате това време от 3 до 6 часа. След изтичане на инкубационното време, средата се сменя и клетките се оставят за 24-48 часа (в зависимост от вида на клетката и генетичния материал) за експресия на въведените конструкции с интересния ген или проява на терапевтичния ефект. на олигонуклеотиди.
Анализът на ефективността на доставяне се извършва чрез ензимни или имунохистохимични методи, в зависимост от вида на въведената генна конструкция.
Пример 1 Образуване на комплекси ДНК/носител и изследване на процеса на комплексообразуване.
Плазмидът pCLUC4, съдържащ гена на луциферазата на светулка под контрола на цитомегаловирусния промотор, беше използван като генетичен материал за целево доставяне на гени в клетките. Използвано е едно от изпълненията на носача.
Разтвори на 1 μg ДНК в 40 μl 1X HBM буфер (5% w/v манитол, 5 mM Hepes, рН 7,5) и разтвори на носители, съответстващи на различни съотношения на заряд на ДНК/носител, се приготвят в равен обем буфер. Разтворът на носителя се добавя постепенно към епруветката Eppendorf с ДНК разтвора и се разбърква енергично в продължение на 20 секунди. Получената смес се оставя за 30 минути при стайна температура, за да завърши образуването на комплексите.
Резултатите от комплексообразуването се анализират чрез метода на изместване с етидиев бромид. Флуоресценцията на етидиев бромид се измерва с помощта на многорежимен четец за спектрално сканиране Varioscan Flash (Thermo, Финландия). Изместване на етидиев бромид се наблюдава при 590 nm (възбуждане при 544 nm) след добавяне на носител към ДНК (20 μg/ml), предварително инкубирана с интеркалиращ агент етидиев бромид (400 ng/ml). Изместването се изчислява с помощта на формулата (F-Ff)/(Fb-Ff), където Ff и Fb са интензитетите на флуоресценция на етидиев бромид съответно в отсъствие и присъствие на ДНК.Резултатите са показани на ФИГ.
Пример 2 Провеждане на in vitro трансфекция.
HeLa, A172 и CHO клетки се поставят в 48-ямкови културални плаки (Nunc) 24 часа преди трансфекцията при 50 000 клетки на ямка, съдържаща 500 µl стандартна културална смес, състояща се от DMEM културална среда (GIBCO), 10% фетален говежди серум (GIBCO), 2 mM глутамин, допълнен с пеницилин (50 U/ml), стрептомицин (50 ug/ml) и 1 mM натриев пируват. Суспензията на комплексите се приготвя съгласно метода, описан в пример 1 при скорост от 2 μg ДНК на ямка на културалната плака. 10 минути преди добавянето на суспензията от комплекси ДНК/носител, клетките се промиват няколко пъти с DMEM и към всяка ямка се добавят 500 ul среда, съдържаща 15% глицерол и 1.5% етанол. Трансфекцията се извършва чрез добавяне на суспензия от комплекси ДНК/носител към средата. След направата на комплексите, плаките с клетките се поставят в термостат с температура 37°C и 5% CO 2 за 4 часа. След времето на инкубация, клетките се промиват с DMEM среда и към всяка ямка се добавят 500 ul от стандартната културална смес. Културалната плака се инкубира в термостат при температура 37°С и 5% СО2 за 48 часа, след което се открива експресията на маркерния ген.
Пример 3 Откриване на експресия на луциферазен ген след трансфекция in vitro.
Средата се отстранява от културалните плаки, клетките се промиват в 1x PBS (рН 7.2). 80 μl лизисен буфер (25 М Gly-Gly, 15 mM MgS04, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF; рН 7.8) се добавя към всяка ямка. 50 μl лизат се прехвърлят в полистиренови плаки с непрозрачни стени за измерване на луциферазната активност. Измерването беше извършено с помощта на спектрално сканиращ многорежимен четец Varioscan Flash (Thermo, Финландия). Измерването беше извършено с помощта на разтвор на луциферазна флаш микс (20 mM Tricine, 1.07 mM (MgCO 3) 4 Mg(OH) 2 × 5 H 2 O, 2.67 mM MgSO 4 , 0,1 mM EDTA, 33.3 mM DTT, 530 μM ATP , 270 μM ацетил коензим А, 470 μM луциферин). Всяко измерване се извършва за 10 секунди. Показанията на инструмента бяха получени в относителни светлинни единици (RLU). Резултатите от експеримента бяха оценени в относителни светлинни единици за 1 mg общ протеин от клетъчни екстракти в ямката на културалната плака. Общото количество протеин във всяка ямка се измерва с помощта на комплект за анализ на протеин (Bio-Rad), спрямо стандартна крива за говежди серумен албумин. Резултатите са представени на фигури 2, 3, 4.
Начини за директно въвеждане на гени в клетка
Директното въвеждане на ген в клетка се извършва по няколко начина:
Трансфекция
микроинжектиране
електропорация
Метод на мини клетка
Опаковка в липозоми
електронна пушка
При трансфекцияДНК се адсорбира върху кристали на калциев фосфат (Graham van der Eb, 1973). Образуват се частици калциева утайка. Те се поемат от клетката чрез фагоцитоза.
За да се увеличи ефективността на трансформацията, към специфичната ДНК, съдържаща гена, за който ще бъде направена селекция, се добавя неспецифична носителска ДНК. Обикновено за тази цел се взема ДНК от тимус на теле или сперма на сьомга. Част от ДНК се свързва с мембраната и не навлиза в клетките. ДНК се приема от 15 до 90% от клетките. Няколко дни след приложението малка част от клетките са в състояние да експресират чужди гени, но след това нивото на експресия спада и 10 -3 - 10 -5 клетки претърпяват повече или по-малко стабилна трансформация.
DEAE-декстран, полимер, който адсорбира ДНК, също се използва за трансфекция. Ефектът на влизане в клетката и времето за експресия са високи, но честотата на стабилна трансформация е по-ниска, отколкото когато се използва калциева утайка. Честотата на трансфекция се увеличава чрез глицеринов шок (4 минути в 15% глицерол в HEPES буфер).
Всеки ген може да бъде въведен в клетките, ако се лигира предварително с клониран избираем маркер. По-нататъшни проучвания обаче показват, че не е необходимо лигиране извън клетката. Клетките, които абсорбират селективния ген, заедно с него, също абсорбират друга ДНК, присъстваща в калциевата утайка. По този начин, използвайки метода ко-трансформации, почти всеки клониран ДНК сегмент може да бъде въведен в култивирани еукариотни клетки, ако тази ДНК, заедно с избираем маркер, е включена в състава на сместа за образуване на калциева утайка.
Хромозоми или фрагменти от хромозоми могат да се използват за трансфекция. Донорните клетки се блокират на етапа на митоза. Митотичните хромозоми се освобождават под въздействието на осмотичен шок и хомогенизация. Те се пречистват чрез диференциално центрофугиране. Хромозомите се отлагат върху повърхността на клетките с калциев хлорид и след няколко часа се третират с реагент, способен да перфорира мембраните (например глицерол).
Грубо пречистени препарати от хромозоми се използват за обработка на реципиентните клетки, тъй като в този случай хромозомите се унищожават най-малко. Броят на хромозомите за обработка на 1 клетка е ограничен. По-добре е да се използват не повече от 20 хромозоми на 1 реципиентна клетка, тъй като при високи концентрации на хромозоми в суспензията те аглутинират. Реципиентната клетка съдържа фрагменти от донорни хромозоми, които могат да бъдат интегрирани в генома и могат да се репликират независимо. Често се наблюдават делеции във въведените фрагменти.
Не всички клетки са способни да трансформират геномна ДНК при висока честота. Човешките фибробласти ефективно включват плазмидна ДНК и почти никаква геномна ДНК.
ДНК микроинжекцияв клетки на бозайници стана възможно с появата на устройство за производство на микропипети с диаметър 0,1-0,5 микрона и микроманипулатор (фиг. 45). По този начин, плазмиди, съдържащи фрагмент от херпесния вирус с гена на тимидин киназата (TK) и плазмида pBR322, бяха инжектирани в TK - клетки и беше показано, че TK - генът прониква в ядрата и се репликира нормално в тях. Методът на микроинжектиране за въвеждане на ДНК е разработен в началото на 70-те години от Андерсън и Диакумакос. Принципно при добро оборудване за 1 час могат да се инжектират 500-1000 клетки, като при най-добрите експерименти се наблюдава стабилна интеграция и експресия на инжектираните гени в 50% от клетките. Предимството на описания метод е също, че позволява въвеждането на всякаква ДНК във всякакви клетки и не е необходим селективен натиск за запазване на въведения ген в клетките.
Ориз. 45. Въвеждане на ДНК чрез микроинжектиране
електропорациясе основава на факта, че високоволтовите импулси обратимо увеличават пропускливостта на биомембраните. Към средата за електропорация се добавят клетки и ДНК фрагменти, които трябва да бъдат въведени в клетките (Фиг. 46). Импулси с високо напрежение (напрежение 200 - 350 V, продължителност на импулса 54 ms) преминават през средата, което води до образуване на пори (електрически разпад) в цитоплазмената мембрана, чийто живот и размер са достатъчни за макромолекули като ДНК да навлезе в клетката от външната среда поради действието на осмотичните сили. В същото време обемът на клетката се увеличава.
Силата на електрическото поле и продължителността на действието му, концентрацията на трансформиращата ДНК и реципиентните клетки за всяка клетъчна система се избират експериментално, за да се постигне висок процент на усвояване на ДНК от оцелелите клетки. Доказано е, че при оптимални условия на електропорация броят на трансформантите може да достигне 80% от оцелелите клетки.
Електропорацията е по-скоро физичен, отколкото биохимичен метод и изглежда това е причината за широкото му използване. Многобройни проучвания показват, че електропорацията може успешно да се използва за въвеждане на ДНК молекули в различни типове клетки като култивирани животински клетки, протозои, дрожди, бактерии и растителни протопласти. Електропоративният ефект на разряд с високо напрежение върху двуслойна липидна мембрана очевидно зависи от радиуса на нейната кривина. Следователно малките бактериални клетки ефективно абсорбират ДНК при много по-висока напрегнатост на полето (10 kV/cm и повече), отколкото големите животински и растителни клетки, които ефективно абсорбират ДНК при напрегнатост на полето от 1–2 kV/cm.
Електропорацията е най-простият, най-ефикасен и възпроизводим метод за въвеждане на ДНК молекули в клетките. Въпреки това доскоро този метод се използваше в ограничен брой лаборатории поради липсата на серийни устройства - електропоратори. Появата и усъвършенстването на такива устройства през следващите години ще доведе до широкото използване на този подход в генното инженерство на различни видове клетки.
Ориз. 46. Метод на електропорация
"Мини клетки"получен чрез блокиране на митотични донорни клетки с колцемид. При продължително третиране на клетки с колцемид се образува нова ядрена мембрана около всяка хромозома. Третирането с цитохалазин В и центрофугирането води до образуването на мини клетки, които представляват микроядра, капсулирани в цитоплазмената мембрана.
Получените мини-клетки са много чувствителни към различни видове влияния, така че за синтез се избират специални меки условия. Методът е труден, капризен, ефективността е ниска - 10 -6 - 10 -7.
Опаковка в липозомиизползвани за защита на екзогенен генетичен материал от разрушителното действие на рестриктазите.
Липозомите са сферични черупки, състоящи се от фосфолипиди. Получават се чрез рязко разклащане на смес от воден разтвор и липиди или чрез ултразвук на водни емулсии на фосфолипиди. Липозомите, състоящи се от фосфатидилсерин и холестерол, са най-подходящи за въвеждане на ДНК в животински и растителни клетки. Подпомаганите от липозоми транспортни системи са слабо токсични за клетките.
Метод на биологичната балистика (биолистика)е един от най-ефективните методи за трансформация на растения днес, особено едносемеделни.
Същността на метода се състои в това, че най-малките частици волфрам с диаметър 0,6-1,2 микрона се напръскват с ДНК на вектор, съдържащ необходимата за трансформацията генна конструкция. Волфрамови частици, носещи ДНК, се отлагат върху целофанов субстрат и се поставят вътре в биолистичния пистолет. Калусът или клетъчната суспензия се нанасят върху петриево блюдо с агарна среда и се поставят под биолистичния пистолет на разстояние 10-15 см. Налягането в пистолета се намалява до 0,1 atm чрез вакуумна помпа. В момента на освобождаване на налягането волфрамовите частици се изхвърлят от биолистичния пистолет с голяма скорост и, разкъсвайки клетъчните стени, навлизат в цитоплазмата и ядрото на клетките.
Обикновено клетките, разположени директно в центъра, умират поради огромното количество и налягане на волфрамови частици, докато най-успешно протрансформираните клетки се намират в зоната 0,6-1 cm от центъра. След това клетките се прехвърлят внимателно в средата за по-нататъшно култивиране и регенериране.
Едносемеделни растения като царевица, ориз, пшеница и ечемик бяха трансформирани с биолистичния пистолет. В този случай се получават стабилни трансформирани растения. В допълнение към успеха при получаване на трансгенни едносемеделни растения, биолистичната трансформация се използва за директен трансфер на ДНК в ембриогенен прашец и по-нататъшно бързо производство на трансгенни дихаплоидни растения, които са важен етап в селекционната работа. Понастоящем по този метод са трансформирани тютюневи растения и след регенериране на хаплоидни растения са получени стабилни трансформанти.
8860 0
Понастоящем са известни около 40 различни метода за доставяне на рекомбинантна ДНК в клетките, които решават проблема с преминаването през плазмената мембрана по различни начини. Досега няма единна класификация на методите за доставяне на рекомбинантна ДНК в клетките. Всеки автор на прегледите класифицира по свой начин, може би защото за много емпирично открити методи механизмът за преодоляване на мембраната все още не е ясен, например за трансформация. Съществува и неяснота с терминологията, което не е изненадващо за една бързо развиваща се нова област на науката и практиката.
Всеки от методите за доставяне на чужда ДНК в клетките има свои собствени характеристики, предимства и недостатъци по отношение на клетъчното оцеляване, ефективността на администрирането, гъвкавостта и възможностите за техническо изпълнение. Изборът на метод зависи от вида на клетките гостоприемници и вида на използвания вектор, както и от личните предпочитания и възможности на експериментатора. Някои от най-известните методи за доставяне на ДНК до целевите клетки са обсъдени подробно по-долу.
Трансформацията в нейния най-общ смисъл е процесът на въвеждане на свободна ДНК в клетка. В по-тесен смисъл терминът се използва главно по отношение на бактерии, като се обозначава процесът на абсорбция на рекомбинантна ДНК от компетентни клетки, предизвикан от температурния фазов преход на клетъчната мембрана. Е. coli е най-често срещаният организъм при работа с рекомбинантна ДНК и за да се осигури въвеждането на плазмидна ДНК в клетките, клетките се държат с ледено студен разтвор на CaCl2 и ДНК и след това се подлагат на топлинен шок при 42 °C за ~1 мин.
Очевидно в резултат на такова лечение настъпва локално разрушаване на клетъчната стена. Ефективност на трансформация, която се определя като брой трансформанти на 1 µg добавена ДНК,
докато е приблизително 10000 - 10000000 . Ефективността на този метод е ниска, приблизително по-малко от 0,1% от клетките се трансформират, но този недостатък се компенсира от използването на схеми за селекция, които ви позволяват бързо да идентифицирате желаните клонове.
Клетките, способни да абсорбират чужда ДНК, се наричат компетентни. Делът на тези клетки в популацията обикновено е много малък, но може да бъде увеличен с помощта на специална хранителна среда, условия на култивиране и индуктори на химическа компетентност (избрани, като правило, емпирично). Често използван етап в подготовката на компетентни клетки е производството на сферопласти - клетки, частично или напълно (протопласти), лишени от външна твърда клетъчна стена.
Например, това е единственият начин за ефективна трансформация на много грам-положителни бактерии от родовете Bacillus, Listeria, Streptomyces и др.. Някои техники за трансформация на дрожди също включват етапите на ензимно отстраняване на клетъчната стена на дрождите с помощта на глюкозидази. За организми, устойчиви на химически индуктори на компетентност или лишени от естествена компетентност, се използват други системи за доставяне на ДНК.
Конюгация. Има бактериални плазмиди (конюгативни плазмиди), които имат способността да създават междуклетъчни контакти, чрез които преминават от една клетка в друга. Образуването на контакти между донорните и реципиентните клетки се осигурява от конюгативните свойства на плазмидите, а самият трансфер на ДНК се осигурява от мобилизационните свойства. В този случай конюгативният плазмид може да носи обичайния плазмиден вектор, разположен в същата клетка.
По този начин е възможно да се трансформират реципиентни клетки, които са трудни за трансформиране с други средства. Например, показан е мобилизационният трансфер на вектора pAT187 от E. coli към различни грам-положителни бактерии (родове Bacillus, Enterococcus, Staphylococcus и др.), макар и с много по-малка ефективност, отколкото при трансфер между различни щамове на E. coli.
Освен това наскоро беше демонстрирана възможността за конюгативен трансфер на ДНК от бактериални клетки към култивирани животински клетки. По време на конюгацията се прехвърля само една верига от донорния плазмид, върху която след това се синтезира втората верига. Това води до това, че конюгативно пренесеният плазмид не се атакува от рестрикционните ензими на гостоприемника. Ефективността на този метод за бактерии е сравнима с тази на трансформацията.
Вирусна инфекция. За въвеждането на вектори, базирани на вируси, широко се използва естественият инфекциозен път на инфекция на клетката гостоприемник, който зависи от вида на вируса.
перфорационни методи. Един от популярните методи за въвеждане на нуклеинови киселини в целевите клетки е електропорацията - временно създаване на пори в липидна двуслойна мембрана при кратко излагане на електрическо поле. Това е универсален физически метод за трансформация, чиято техника е разработена за почти всички видове клетки.
При работа с Е. coli приготвената клетъчна суспензия (~50 µl) и ДНК се поставят между електродите и се подава единичен токов импулс с продължителност ~4,5 ms при напрежение 1,8 kV, разстоянието между електродите е 1 мм. След такова третиране ефективността на трансформация нараства до 109-1011 за малки плазмиди (~3-6 kb) и до 106 за големи (~135 kb). Подобни условия се използват за въвеждане на BAC вектора в Е. coli.
Електропоративният ефект на разряд с високо напрежение върху двуслойна липидна мембрана очевидно зависи от радиуса на нейната кривина. Следователно малките бактериални клетки ефективно абсорбират ДНК при много по-висока напрегнатост на полето (12–18 kV/cm), отколкото големите животински и растителни клетки, които ефективно абсорбират ДНК при напрегнатост на полето от 1–2 kV/cm. Електропорацията е най-простият, най-ефективен и възпроизводим метод за въвеждане на ДНК молекули в клетките, който обаче изисква специално електропораторно устройство.
Други перфорационни методи за доставяне на ДНК в клетка са: третиране на клетки с ултразвук, изстъргване на клетки от субстрат в присъствието на екзогенен материал, центрофугиране на клетки в среда с ДНК в комбинация с електропорация, осмотична перфорация на плазмената мембрана, клетъчна сонда с лазерен микролъч и използването на порообразуващ стрептолизин-О токсин.
Трансфекция. Първоначално този термин означаваше въвеждането на вирусна ДНК в клетките, сега значението му се разшири до въвеждането на всякаква чужда ДНК в еукариотните клетки. Терминът "трансформация", обозначаващ процеса на въвеждане на ДНК в клетка за прокариоти и дрожди, се оказа неудобен за използване, тъй като по отношение на животинските клетки трансформацията е трансформацията на нормални клетки в ракови клетки. В тесен смисъл трансфекцията обикновено се разбира като въвеждане на ДНК в еукариотни клетки с помощта на различни химични реагенти.
Един от първите методи, разработени за ефективна трансфекция, беше инкубиране на ДНК с DEAE-декстран. Получената ефективност е сравнима с трансформацията на бактерии и достига 106 трансфектанти на µg ДНК.
Механизмът на действие на DEAE-декстран не е напълно установен, но е известно, че той се свързва с ДНК и с клетъчната мембрана, стимулирайки пиноцитоза (фиг. 2.8), въпреки че самият той не се поема от клетките. Недостатъците на метода включват токсичността на DEAE-декстран за някои видове клетки, зависимостта на ефективността от качеството на препарата и много ниската честота на получаване на стабилни трансфектанти.
Ориз. 2.8. Схема за въвеждане на ДНК като част от различни комплекси в клетката чрез ендоцитоза: фагоцитоза и пиноцитоза (а). Схематично представяне на частица от нелипиден поликатион в дендроформа със свързана ДНК, чийто отрицателен заряд е компенсиран от катионен полимер (b)
Ефективността на трансфекцията се повишава 10-100 пъти чрез инкубиране на клетки с утаена от калциев фосфат ДНК. Плътните частици от калциевия преципитат на ДНК се абсорбират от клетката чрез фагоцитоза (фиг. 2.8), но само малка част от проникващите молекули достигат до ядрото и се интегрират в хромозомната ДНК. Методът с калциев фосфат е по-ефективен и по-евтин, но причинява разкъсване на ДНК молекули, което превръща кръговите молекули в линейна форма, понякога неинфекциозна в случай на трансфекция на вируси. В допълнение, условията за трансфекция с калциев фосфат трябва да бъдат избрани индивидуално за всяка целева клетка.
По време на търсенето на други реагенти за трансфекция беше установено, че полимерните молекули, носещи излишен катионен заряд, могат значително да повишат ефективността на трансфекцията. Полимерните катиони образуват стабилни комплекси с неутрализирани заряди с нуклеинови киселини, които могат да транспортират ДНК и РНК в клетката с висока ефективност, предпазвайки от действието на ендонуклеазите по пътя към ядрото (фиг. 2.9).
Ориз. 2. 9. Схема на ДНК транспорт в клетъчното ядро като част от поликатион-ДНК комплекс, свързан със специфичен лиганд чрез лиганд-медиирана ендоцитоза
Синтетичните нелипидни полимерни катиони в линейна или разклонена конформация (дендритна форма) могат да кондензират ДНК и РНК в относително малки частици, които след това се свързват с клетъчната мембрана и влизат в клетката чрез неспецифична ендоцитоза. Понастоящем за трансфекция от групата на нелипидните поликатиони, главно полиетиленимин, полиамидоамини и дендримери на тяхна основа, се използват катионни протеини като полилизин, протамин и хистони, както и различни търговски продукти, като PAMAM.
Революция беше въвеждането в практиката на първия ниско токсичен катионен липид DOTMA (1,2-диолеил-3-N,N,N-триметиламинопропан), синтезиран от Feigner (Feigner, 1987) et al. Ефективността на трансфекция с катионен липид (Фигура 2.10) е около 100 пъти по-голяма от всеки друг химикал, с голям дял стабилни трансгенни клетки.
Ориз. Фиг. 2. 10. Структура на комплекса с ДНК (а) и обща структура на катионния липиден полимер (б). Катионните липидни полимери (линейни и разклонени), подобни по структура и свойства на фосфолипидите на клетъчната мембрана, образуват комплекси с ДНК под формата на многослойни катионни липозоми (а) чрез просто смесване на реагентите. Такива комплекси влизат в клетката чрез ендоцитоза или сливане с клетъчната мембрана през липидната част.
В същото време в практиката беше въведен нов термин "липофекция", който подчертава високата ефективност на генетичната трансформация на клетките, доближавайки липид-катионните комплекси до инфекциозните вирусни частици.
Въз основа на този успех са разработени множество вариации на тези съединения (Lipofectin, Lipofectamine, Cellfectin и др.).
Успоредно с това бяха разработени носители за доставяне на базата на фосфолипидни липозоми, пълни с ДНК или РНК.
Малки сфери от изкуствени мембрани могат да се слеят с плазмените мембрани на клетките или да бъдат поети от ендоцитоза, освобождавайки съдържанието в клетката. Ниската ефективност на липозомната трансфекция се повишава чрез въвеждането на фосфолипиди в структурата на липозомите, например кардиолипин и фосфатидилетаноламин, които заедно с двуслойните мембрани също образуват обърнати мицеларни структури, известни като кубични и хексагонални фази, способни да инициират мембрана синтез.
Липозомният метод е доста капризен и изисква внимателен подбор на всички условия за ефективна трансфекция на специфични клетки. В допълнение, процедурата на капсулиране, обикновено ултразвук, често уврежда големи ДНК молекули.
Нов етап в развитието на трансфекционните реагенти е разработването на по-ефективно и целенасочено доставяне на нуклеинови киселини до специфични целеви клетки чрез въвеждане на различни лиганди в структурата на синтетични трансфекционни реагенти и липозоми за свързване към мембранни рецепторни протеини. Наличието на такива целеви групи (лиганди), разпознати от клетъчните рецептори, прави възможно използването на механизмите на лиганд-медиирана ендоцитоза (виж Фиг. 2.9).
Като такива лиганди се използват протеини и пептиди, разпознати от рецепторите; олигозахариди, тъй като на повърхността на много животински клетки има лектини - рецепторни протеини, които ги свързват специфично; полизахариди. Процесите на взаимодействие с клетките на такива насочени ДНК(РНК)-трансфекционни реагентни комплекси са подобни на проникването на вирусни частици в клетката.
В момента биотехнологичните компании предлагат широка гама от различни реагенти за трансфекция - от най-простите и евтини до най-новите разработки, специализирани за различни видове клетки и задачи. Интензивно продължава и създаването на нови още по-ефективни трансфекционни реагенти.
Микроинжекция – клетъчната мембрана се пробива с микроигла и разтвор, съдържащ ДНК се инжектира в цитоплазмата на клетката или директно в ядрото, ако ядрото е достатъчно голямо (например ядрото на яйцеклетка). Микроинжектирането на ДНК в клетки на бозайници стана възможно с появата на устройство за производство на микропипети с диаметър 0,1-0,5 микрона и микроманипулатор. Методът е много ефективен, делът на клетките със стабилна интеграция и експресия на инжектираните гени може да достигне 50%. Предимството на описания метод е също така, че позволява въвеждане на всякаква ДНК във всякакви клетки и не е необходим селективен натиск за запазване на въведения ген в клетките.
Балистичната трансфекция, биобалистика или биолистика (бомбардиране с микрочастици), се основава на бомбардиране на клетки с микросфери с размер около 1-2 микрона, покрити с ДНК. Използват се микрочастици злато, волфрам (понякога фитотоксични), силикон и различни синтетични наносфери. Микрочастиците, покрити с ДНК, преминават през клетъчните слоеве и пренасят генетичния конструкт директно в органелите и ядрата на клетките. Създаден за тази цел, „генен пистолет“ (генен пистолет) или „генен пистолет“, разработен от Дж. Санфорд през 1987 г. за въвеждане на ДНК в зърнени култури, е подобен по своя дизайн на пневматичните оръжия ( Фиг. 2.11) .
Ориз. 2.11. Въвеждане на рекомбинантна ДНК в листата на растението с помощта на многократно използваема генна пушка Bio-Rad (a) и нейната обща схема (b). Импулсът на хелий изхвърля микрочастици, покрити с ДНК или РНК от капсулата с пробата. Микрочастиците, носещи ДНК, се ускоряват и фокусират за максимално проникване в клетките, движейки се по ускоряващия канал и по цевта на пистолета, докато при широк изход хелиевият поток дифузно се отклонява настрани. Филтърният разделител поддържа оптималното разстояние за поразяване на целта с максимално отстраняване на хелий, за да се минимизират вредните ефекти върху клетъчната повърхност.
Дълбочината на проникване на микрочастиците като правило е малка - до 1 mm, но при специални условия на обвивка микрочастиците могат да проникнат в тъканта на дълбочина 4-5 mm и да прехвърлят гени, например, в набраздени мускулни влакна. Балистичната трансфекция е много ефективна дори когато дебелите клетъчни стени (дрожди, растения) са пречка за много други методи за доставяне и се прилага към тъкани, органи и дори цели организми. Понастоящем се използва широко в генната терапия за получаване на трансгенни животни и растения.
Такова разнообразие от средства и методи за трансфекция се дължи на различни задачи, широк спектър от целеви клетки и видове нуклеинови киселини, доставени на клетките, както и нуждата на обществото да получи повече и по-ефективни средства за доставяне на генетична информация в клетките , тъкани и цели организми. Особено внимание се обръща на разработването на реагенти и методи за трансфекция във връзка с поразителните перспективи на човешката генна терапия, която изисква целеви, високоефективни и безопасни средства за доставяне на гени.
Стабилно и преходно въвеждане на чужда ДНК в клетката. След въвеждането на рекомбинантна ДНК в еукариотна клетка, само малка част от нея попада в ядрото, тъй като ядрената мембрана е страхотна бариера за чужда ДНК. В ядрото рекомбинантната ДНК може да бъде интегрирана в хромозомата или да съществува известно време в извънхромозомно състояние.
Съответно се прави разлика между стабилна трансфекция, когато рекомбинантна ДНК се интегрира в хромозомите на реципиентните клетки и става неразделна част от тях, както и временна или преходна трансфекция, при която съществуват рекомбинантни ДНК молекули и се транскрибират в ядра в извънхромозомна състояние за кратко време. Стабилното наследяване на въведена чужда ДНК е основното условие за получаване на трансгенни организми за икономически цели.
Поради това се обръща специално внимание на разработването на методи за въвеждане на ДНК в клетките, водещи до производството на по-голям дял стабилни трансформанти. В допълнение, голям процент стабилни трансформанти също прави възможно изоставянето на селективни и маркерни гени, които са баласт при създаването на трансгенни организми.
НА. Войнов, Т.Г. Волова
Многобройни проучвания показват, че използването на различни вируси е много ефективно решение, което ви позволява да преминете през имунната защита на тялотои след това да зарази клетките, използвайки ги за разпространение на вируса. За осъществяването на тази процедура генните инженери подбраха най-подходящите вируси от групата на ретровирусите и аденовирусите. Ретровирусите носят генетична информация под формата на рибонуклеинова киселина (РНК), подобна на ДНК молекула, която помага за обработката на генетичната информация, съхранена в ДНК. Веднага след като е възможно да се проникне дълбоко в така наречената целева клетка, от молекулата на РНК се получава копие на ДНК молекулата. Този процес се нарича обратна транскрипция.След като нова ДНК молекула бъде прикрепена към клетка, всички нови копия на клетката ще съдържат този модифициран ген.
Аденовирусите носят генетична информация веднага под формата на ДНК, която се доставя до неделяща се клетка. Макар че тези вируси доставят ДНК директно в ядрото на целевата клеткаДНК не се вписва в генома на клетката. По този начин модифицираният ген и генетичната информация не се предават на дъщерните клетки. Предимството на генната терапия, провеждана с аденовируси, е, че е възможно да се въведат гени в клетките на нервната система и в лигавицата на дихателните пътища, отново чрез вектор. Освен това има и трети метод на генна терапия, осъществяван чрез така наречените аденоасоциирани вируси. Тези вируси съдържат сравнително малко количество генетична информация, и са много по-трудни за елиминиране от ретровирусите и аденовирусите. Предимството на аденоасоциираните вируси обаче е, че те не предизвикват реакция на човешката имунна система.
Генеалогичен метод на антропогенетиката
В основата на този метод е съставянето и анализът на родословия. Този метод се използва широко от древни времена до наши дни в коневъдството, селекцията на ценни линии говеда и свине, при получаването на чистокръвни кучета, както и при развъждането на нови породи животни с ценна кожа.
Като метод за изучаване на човешката генетика, генеалогичният метод започва да се използва едва от началото на 20 век, когато става ясно, че анализът на родословия, в който предаването на дадена черта (заболяване) от поколение на поколение може да бъде заменено по хибридологичния метод, който всъщност е неприложим за хората.
При съставяне на родословия източникът е лице – пробанд, чието родословие се изучава. Обикновено това е или пациент, или носител на определена черта, чието унаследяване трябва да се проучи. При съставянето на генеалогични таблици се използват символите, предложени от Г. Юст през 1931 г. (фиг. 6.24). Поколенията се обозначават с римски цифри, индивидите в дадено поколение се обозначават с арабски цифри.
С помощта на генеалогичния метод може да се установи наследствената обусловеност на изследвания признак, както и вида на неговото унаследяване (автозомно-доминантно, автозомно-рецесивно, Х-свързано доминантно или рецесивно, Y-свързано). При анализиране на родословия за няколко черти може да се разкрие свързаната природа на тяхното наследство, което се използва при съставянето на хромозомни карти. Този метод позволява да се изследва интензивността на мутационния процес, да се оцени експресивността и пенетрантността на алела. Той се използва широко в медицинските генетични консултации за прогнозиране на потомството. Все пак трябва да се отбележи, че генеалогичният анализ става много по-сложен, когато семействата имат малко деца.