RPG vereanalüüs: tulemuste tõlgendamine. Mida näitab vereanalüüs rpga Üldine teave uuringu kohta

Treponemaalsed testid süüfilise tuvastamiseks. Üldkirjeldus.

Süüfilise usaldusväärseks diagnoosimiseks ja süüfilisevastaste antikehade tuvastamiseks patsiendi kehas (vereseerumis või tserebrospinaalvedelikus) kasutatakse spetsiaalseid laboriuuringute tehnoloogiaid - nn seroloogilisi meetodeid.

Süüfilise diagnostiliste testide läbiviimisel kasutatakse erinevaid seroloogilisi reaktsioone: aglutinatsioon, sadestumine, immunofluorestsents, komplemendi sidumine, ensüümi immunoanalüüs jne. Kõik need seroloogilised reaktsioonid põhinevad antigeenide ja antikehade koostoimel.

Spetsiifilisi seroloogilisi teste nimetatakse treponemaalne sest nendes testides kasutatakse treponema pallidum'i või selle antigeene, st treponemaalse päritoluga antigeene. Treponemaalsete testide eesmärk on tuvastada spetsiifilisi antikehi süüfilise tekitaja antigeensete struktuuride vastu, st antikehi, mis on suunatud spetsiifiliselt T. Pallidum bakterite enda, mitte treponeemiga kahjustatud kehakudede vastu. Spetsiifilisi IgM klassi antitreponemaalseid antikehi saab tuvastada juba teise haigusnädala lõpus.

7. Valepositiivsed ja valenegatiivsed tulemused

Positiivset süüfilise PB-testi inimestel, kes seda haigust ei põe, nimetatakse valepositiivseks. Valepositiivsete tulemuste sagedus tervetel inimestel on 0,2-0,25%. Kui tervetel inimestel on RV mittespetsiifiliste valepositiivsete tulemuste protsent väga madal, siis mõne haiguse korral võib see olla kõrge.

Kõik seroloogiliste reaktsioonide mittespetsiifilised tulemused võib jagada järgmistesse põhirühmadesse:

1. Haigused, mis on põhjustatud tavaliste antigeenide esinemisest sarnastes patogeenides (spiroheedid): retsidiiveeruv palavik, õõtsik, bejel, pint, suu treponeem, leptospira.

2. Positiivsed reaktsioonid, mis on tingitud muutustest lipiidide metabolismis ja muutustest seerumi globuliinides. Nende hulka kuuluvad positiivsed tulemused podagraga rasedatel naistel, lipiidide koostise häired pliimürgistuse tagajärjel, fosfor, pärast naatriumsalitsülaadi, digitaalise võtmist jne. Need reaktsioonid peaksid hõlmama ka positiivseid reaktsioone teatud nakkushaiguste korral (tüüfus, malaaria, kopsupõletik, pidalitõbi). , endokardiit, kollagenoos, müokardiinfarkt, põrutus, vähk, maksatsirroos jne)

3. Tehnilised käitumisvead. Komplemendi annuse vale valik, reaktiivide säilitamise tingimuste ja tähtaegade mittejärgimine, vereseerumi kontrollproovide reaktsioonist väljajätmine, saastunud katseklaaside ja instrumentide kasutamine.

8. Wassermanni reaktsiooni modifikatsioon

Wassermani reaktsiooni modifikatsioonid on kvalitatiivses ja kvantitatiivses versioonis, külmas, tserebrospinaalvedelikuga.

RV muutmine külmas tundus tundlikum olevat. Wassermani reaktsiooni külmas seadistamise metoodika eripäraks on kolmefaasilised temperatuurirežiimid, mille juures toimub komplemendi sidumine. See reaktsioon viiakse läbi ka kardiolipiini ja treponemaalse antigeeniga.

Lisaks RW kvalitatiivsele hindamisele on selle jaoks olemas meetod kvantitatiivne seadistus vereseerumi erinevate lahjendustega (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Reagiini tiiter määratakse maksimaalse lahjenduse järgi, mis annab siiski teravalt positiivse tulemuse (4+). RV kvantitatiivne formuleerimine on oluline teatud süüfilise vormide diagnoosimisel ja ravi efektiivsuse jälgimisel.

9. Ulatus

Venemaal on RSKt osa süüfilise (SSR) standardsete seroloogiliste testide kompleksist.

Wassermani reaktsioon treponemaalse ja kardiolipiini antigeeniga (RSKt) on harjunud

• süüfilise kõigi vormide diagnoosimine,
• kontroll ravi efektiivsuse üle,
• süüfilisega patsiendiga seksuaalkontaktis olnud isikute läbivaatused,
• kliinilise ja anamneetilise süüfilise kahtlusega isikute uuringud
• psühhiaatria- ja neuroloogiahaiglate, doonorite ja rasedate, sealhulgas kunstlikule raseduse katkestamisele suunatud isikute süüfilise ennetava läbivaatuse käigus.

Praegu on Vene Föderatsiooni tervishoiuministeeriumi korraldusel soovitatav RSKT asendada tundlikumate treponemaalsete meetoditega (ELISA või RPHA).

Välismaal pole Wassermani reaktsiooni treponemaalse antigeeniga kliinilises laboripraktikas pikka aega kasutatud ja see ei sisaldu Maailma Terviseorganisatsiooni soovitatud standardtestide nimekirjas.

Klassikaliste seroloogiliste reaktsioonide kompleks (CSR)

DAC- see on reaktsiooni kompleks kasutatakse süüfilise serodiagnostikaks standardmeetodina. See reaktsioonide kompleks sisaldab Wassermani reaktsiooni kardiolipiini antigeeniga (letsitiini ja kolesterooliga rikastatud pulli südame ekstrakt) ja treponemaalse antigeeniga (ultraheliga töödeldud apatogeensete kultuuriliste kahvatute treponeemide suspensioon), samuti mikrosadestamise reaktsiooni (RMP). ) plasma või inaktiveeritud seerumiga, mis asetatakse kardiolipiini antigeeniga

CSR muutub positiivseks esmase perioodi keskel (selle jagunemise seronegatiivseks ja seropositiivseks määrab täpselt CSR), sekundaarsel perioodil on CSR positiivne 98-100% patsientidest ja kolmandal perioodil - ainult 60-70 %. See tähendab, et haiguse kestuse pikenedes väheneb järk-järgult CSR-i positiivsus.

KSRi eelised:

1) Seadistamise odavus, lihtsus ja kiirus. See kehtib eriti mikrosadestamise reaktsiooni kohta: RMP on praegu peamine sõelumismeetod;

2) Süüfilise paranemise jälgimiseks on mugav kasutada mittetreponemaalseid teste.

CSR-i puudused:

1) reaktsioonide tulemuste hindamise subjektiivsus ("silma järgi");

2) Madal tundlikkus süüfilise hiliste vormide korral;

3) Spetsiifilisuse puudumine võrreldes kaasaegsemate testidega. Nende läbiviimisel täheldatakse sageli valepositiivseid reaktsioone (LPR).

LPR võib olla tingitud ristreaktiivsusest kahvatu spiroheedi ja teiste mikroobide vahel, lipiidide ja valkude metabolismi häiretest, rakumembraanide ebastabiilsusest ja autoantikehade moodustumisest. LPR-i täheldatakse ägedate (malaaria, nakkuslik mononukleoos jne) ja krooniliste (tuberkuloos, pidalitõbi, hepatiit, borrelioos jt) infektsioonide, müokardiinfarkti, maksatsirroosi, kollagenooside (eriti SLE korral), onkopatoloogia, vaktsineerimise, uimastitarbimise, alkoholi ja rasvaste toitude kuritarvitamine. Valepositiivne võib olla CSR raseduse viimastel nädalatel, pärast sünnitust ja mõnel naisel menstruatsiooni ajal. Valenegatiivsed CSR-tulemused võivad olla seotud HIV-nakkusega.

RIT, RIBT – kahvatu treponema immobiliseerimisreaktsioon

Treponema pallidum immobilisatsioonitest (TPI; Treponema pallidum immobilisation test, TPI) on klassikaline meetod, mis aitab tuvastada spetsiifilisi treponemaalseid antikehi. RIBT reaktsioonis kasutatakse antigeenina küüliku munandites kasvatatud patogeenset treponema pallidum T. pallidum'i (Nicholsi tüvi). RIBT põhineb elusate kahvatute treponeemide liikuvuse vähenemisel pärast kokkupuudet patsiendi vereseerumi ja komplemendi antikehadega. Tulemusi hinnatakse tumevälja mikroskoopia abil. Vaatamata asjaolule, et RIBT-test viidi kliinilisse praktikasse süüfilise spetsiifilise testina, on see töömahukas, tehniliselt keeruline, aeganõudev ja kulukas kasutada.

1. RIBT-meetodi ajalugu

Treponema pallidum immobilisatsioonitest (TPRT) on tegelikult esimene spetsiifiline test süüfilise diagnoosimiseks. Seda reaktsiooni esitasid 1949. aastal Ameerika teadlased Nelson ja Mayer (R. W. Nelson ja M. M. Mayer) ning seda arutati üksikasjalikult järgnevatel aastakümnetel teadustöödes. Ebaõnnestunud katseid elusaid treponeeme testides kasutada on tehtud ka varem. Tänu sellele, et Nelsonil õnnestus luua keskkond, milles treponeemid püsisid elujõulisena kuni 8 päeva, kroonis tema uurimistööd edu.

2. RIBT meetodi põhimõte

Meetod põhineb liikuvuse kaotuse nähtusel kahvatu treponeemide tõttu uuritava vereseerumi ja komplemendi immobiliseerivate antitreponemaalsete antikehade juuresolekul anaeroobsetes tingimustes. Antigeen on elus patogeenne kahvatu treponema, mis on saadud süüfilisega kunstlikult nakatunud küülikutelt.

3. RIBT testi seadistamine

Reaktsioonis osalevad testitav seerum, komplement ja antigeen. Subjekti vereseerum lisatakse pärast kunstlikku nakatamist küüliku munandikudedest saadud elusatele treponeemidele. Treponemaalsete antikehade-immobilisiinide olemasolul seerumis lakkavad kahvatud treponeemid liikumisest (immobiliseeritud). Immobilisiini antikehad on hilised antitreponemaalsed antikehad.

Reaktsioon viiakse läbi kuumusega inaktiveeritud seerumite või vahatatud paberil kuivatatud seerumiproovidega (kuivtilgad). Seerumi inaktiveerimine kuumutamisega viiakse läbi 30 minutit temperatuuril 56 °C. Enne vere võtmist ei tohi uuritav võtta ravimeid, eriti penitsilliinipreparaate. Ravimite vastuvõtmine tühistatakse nende võimaliku viivituse ajaks kehas.

Antigeenina kasutatakse Nicholsi tüve baktereid, mis on saadud 7–10-päevase küüliku süüfilise orhiidi (munandite põletiku) tagajärjel. Reaktsiooni käivitamise hetkest kuni tulemuste registreerimiseni kestab periood 18-20 tundi, seetõttu on mikroorganismide elujõulisuse ja hea liikuvuse säilitamiseks vajalik ellujäämiskeskkond.

RIBT kasutab merisea komplementi. Komplemendi saamiseks tuleb steriilsetes tingimustes võtta verd mitmelt merisealt.

Bakteriaalse saastumise korral jäetakse komplement kõrvale. Ei saa kasutada kahvatu treponema immobiliseerimise reaktsioonis säilinud komplemendi, tk. see on mikroorganismidele toksiline.

Immobiliseerimisreaktsioonis kasutatakse komplemendi liiast. Selle kogus sõltub suuresti kahvatu treponema ellujäämiskeskkonnast.

RIBT asetatakse steriilsetesse kastidesse, mida on eelnevalt kiiritatud bakteritsiidse kvartslambiga 45-60 minutit. Iga vereseerumit uuritakse kahes katseklaasis: kogenud ja kontroll. Mõlemasse katseklaasi lisatakse vajalikes kogustes uuritavat seerumit ja antigeeni. Katseklaasi valatakse aktiivne komplement ja kontrollkatsutisse sama kogus inaktiveeritud merisea vereseerumit. Pärast täitmist segatakse tuubide sisu õrnalt loksutades.

RIBT kulgeb anaeroobsetes tingimustes. Katseklaasid koos koostisainetega asetatakse mikroanaerostaati, millest vaakumpumbaga imetakse ära atmosfääriõhk ja silindrist süstitakse gaasisegu (95 osa lämmastikku ja 5 osa süsihappegaasi). Mikroanaerostaat koos katseklaasidega asetatakse 18-20 tunniks termostaati (35°C).

RIBT tulemuste hindamine viiakse läbi pärast katseklaaside eemaldamist termostaadist ja mikroanaerostaadist (st pärast 18-20-tunnist kogemust). Pasteuri pipetiga kantakse katseklaasi sisu tilk klaasklaasile, mis kaetakse katteklaasiga ja uuritakse mikroskoobi pimedas väljas (objektiiv 40, okulaar 10X). Preparaadi erinevates osades uuritakse mitut vaatevälja, loendades mõlemas liikuvate ja liikumatute kahvatute treponeemide arvu. Loendamine algab ravimiga kontrollist ja seejärel katseklaasist.

Reaktsiooni seadistamisel kasutatakse 5 kontrolluuringut: ilmselgelt positiivse ja negatiivse vereseerumiga, aktiivse ja inaktiveeritud komplemendiga ning kahvatu treponema ellujäämissöötmega. Selles katses kasutatakse kahvatu treponema liikuvuse määramiseks kontroll-negatiivset vereseerumit. Kontrolli positiivset vereseerumit – immobiliseeriva aktiivsuse taseme hindamiseks selle katse tingimustes. Aktiivse ja inaktiveeritud komplemendi ja keskkonna uurimine viiakse läbi, et teha kindlaks nende mõju kahvatu treponema liikuvusele.

Komplemendi puudumisel katses ei näita immobiliseerivad antikehad oma aktiivsust korralikult ja treponeemid jäävad liikuvaks. Seetõttu tehakse pärast katset jääkkomplemendi määramine, et hinnata, kas kahvatu treponeemide liikuvus katseklaasides oli tingitud komplemendi puudumisest. Selleks kasutatakse hemolüütilist süsteemi - oina erütrotsüütide suspensiooni ja lahjendatud hemolüütilise seerumi segu, mida hoitakse termostaadis.

Komplementi jääk määratakse hemolüütilise süsteemi lisamisega igasse katsutisse vajalikus mahus. Torud asetatakse 45 minutiks 37° temperatuuriga termostaadi. Eksperimentaalsetes katseklaasides peaks toimuma erütrotsüütide hemolüüs, kontrollkatseklaasides hemolüüsi hilinemine. Hemolüüsi puudumine katseklaasides näitab komplemendi ebapiisavat kogust, sellistel juhtudel tuleks uuringut korrata. Vere seerumi korduvat uurimist ei tehta ainult siis, kui täheldatakse kahvatute treponeemide 100% immobiliseerimist.

4. RIBT tulemuste arvestus

Immobiliseeritud treponeemid loendatakse mikroskoobi all, kasutades tumevälja mikroskoopiat. Uurijalt nõutakse treponeemide liikumise hindamise oskust. Ta peaks pöörama tähelepanu kahvatu treponema tehtud liigutuste intensiivsusele. Selle bakteri puhul ei ole alati võimalik jälgida lainelaadseid kokkutõmbeid ja painutusliigutusi, mõnikord ainult pöörlevaid. Samuti peaksite suutma eristada treponeemide aktiivset liikumist vedelikuvooluga liikumisest.

Reaktsiooni tulemuste hindamiseks arvutatakse kahvatute treponeemide immobilisatsiooni protsent, st liikuvate ja liikumatute treponeemide suhe katses (aktiivse komplemendiga) ja kontrollis (inaktiivse komplemendiga) vastavalt valemile:

X \u003d (M - C) × 100 / M

kus M on liikuvate treponeemide arv kontrollis; C - liikuvate treponeemide arv katses; X - % immobilisatsioon. Praktilises töös määratakse immobilisatsiooni protsent eelnevalt koostatud tabeli järgi, kasutades ülaltoodud valemit.

Kahvatu treponema immobiliseerimise reaktsioon on hinnanguliselt

• positiivne immobiliseerimise ajal 51 - 100% treponem,
• nõrgalt positiivne: 31 - 50% liikumatud treponeemid,
• kahtlane: 21 - 30% liikumatud treponeemid,
• negatiivne: 0 - 20% liikumatud treponeemid.

Kahvatu treponema immobiliseerimise reaktsioon muutub positiivseks esmase süüfilise perioodi lõpus - sekundaarse süüfilise perioodi alguses (alates 7-8 nädalast nakatumise hetkest ja rohkem). Samal ajal on RIBT-st vähe kasu süüfilise varajases staadiumis diagnoosimisel, kuna kahvatut treponeemi immobiliseerivad ja reaktsioonis tuvastatud antikehad ilmuvad alles 3-6 nädalat pärast nakatumist. Antikehad-immobilisiinid kuuluvad immunoglobuliinide IgG klassi. Need ilmuvad verre hiljem kui reagins (antikardiolipiini antikehad), hiljem kui fluorestseiini antikehad (tuvastatakse RIF ja ELISA) ja sademed (RMP).

Tulevikus jääb RIBT positiivseks. Süüfilise hiliste vormide korral on reaktsioon kõrge. Sekundaarse, hilise süüfilise, neurosüüfilise, kaasasündinud süüfilise korral registreeritakse positiivne RIBT tulemus 95–100% juhtudest. Tertsiaarse süüfilise, siseorganite, närvisüsteemi spetsiifiliste kahjustustega, kui RV on sageli negatiivne, annab RIBT positiivseid tulemusi 98-100% juhtudest.

RIBT on pikka aega tunnistatud kõige spetsiifilisemaks süüfilise testiks. Kirjanduse andmetel on RIBT spetsiifilisus 99%, tundlikkus jääb vahemikku 79-94%. TsNIKVI andmetel on RIBT tundlikkus (kokku kõigi süüfilise staadiumite puhul) 87,7%.

7. Meetodi ulatus

RIBT-i ulatus kitseneb järk-järgult seadistamise kestuse, kõrgete kulude ja töömahukuse tõttu. RIBT on üsna keeruline ja kulukas analüüs, mis nõuab kõrgelt kvalifitseeritud personali ja vivaariumi olemasolu. Sellega seoses on selle meetodi kasutamine viimastel aastatel oluliselt vähenenud. USA-s kasutatakse seda testi praegu ainult uurimislaborites.

Lähtudes RIF-i ja RIBT-i keerukusest ja kõrgest maksumusest, on otstarbekas neid kasutada süüfilise hiliste ja varjatud vormide diagnoosimiseks. RIBT säilitab oma positsiooni "reaktsioonide otsustajana" süüfilise varajaste varjatud vormide ja valepositiivsete tulemuste diferentsiaaldiagnostikas. See reaktsioon võib olla kasulik neurosüüfilise diagnoosimisel ja kui muud seroloogilised testid on vastuolulised.

RIBT muutub positiivseks palju hiljem kui RIF ja RV. Seetõttu ei kasutata seda süüfilise nakkuslike vormide diagnoosimiseks.

RIBT, nagu RIF, on antisüüfilise ravi protsessis väga aeglaselt negatiivne. Seetõttu ei sobi see antisüüfilise ravi edenemise jälgimiseks.

Valepositiivsed tulemused (FPR) RIBT-s on haruldased ja neid on täheldatud peamiselt mitmete treponematooside (jahu, pinta, bejel) puhul, mida Venemaal ei leidu, aga ka pidalitõve, sarkoidoosi, SLE, tuberkuloosi, tsirroosi korral. maks ja mõned muud haruldased mittesüüfilise iseloomuga haigused. Patsientide vanusega suureneb RIBT valepositiivsete tulemuste arv.

RIBT võib olla valepositiivne, kui testitav seerum sisaldab treponemitsiidseid aineid (nt penitsilliinid, tetratsükliinid, erütromütsiin), mis põhjustavad kahvatu treponeemi mittespetsiifilist immobilisatsiooni. See võib olla tingitud sellest, et patsient võtab treponemotsiidseid antibiootikume, mistõttu uuringut ei tehta inimestele kes on saanud viimase kuu jooksul antibiootikume. RIBT-i verd saab uurida mitte varem kui 2 nädalat pärast antibiootikumide ja muude antisüüfiliste ravimite lõppu.

9. Kahvatu treponeemide immobiliseerimise reaktsiooni modifikatsioonid

Lisaks mikroanaerostaatilisele tehnikale on RIBT-i melanžseade vastavalt N.M. Ovtšinnikov. Anaeroobsed tingimused reaktsiooni moodustamise ajal luuakse reageeriva segu asetamisega melangerisse (leukotsüütide segistisse), mille mõlemad otsad on suletud kummirõngaga. Melange reaktsiooni tehnika võimaldab loobuda vaakumpumbast, lämmastiku ja süsinikdioksiidi seguga silindrist ning mikroanaerostaadist. Suure kliinilise materjali võrdlevas uuringus saadi tulemused, mis ei jää alla klassikalisele anaerostaatilisele tehnikale.

10. RIBT omadused, eelised ja puudused

RIBT on tehniliselt keeruline ja kallis diagnostikameetod. Tehnoloogia nõuab märkimisväärseid vahendeid küülikute hooldamiseks ja katsetamiseks. Seda aeganõudvat testi kasutatakse praegu peamiselt teaduslikel eesmärkidel. Enamikus välisriikides on peaaegu 40 aastat RIBT-i praktiliselt kasutatud mitte diagnostilistel eesmärkidel, vaid ainult uurimistöös.

Reaktsiooni puudused:

• RIBT nõuab tööd Nicholsi tüvega elava patogeense treponema pallidum'iga, mis jääb inimestele nakkavaks vaatamata küülikutega kohanemisele
• reaktsioon on keeruline, aeganõudev ja kallis
• vivaarium on vajalik
• Reaktsiooni seadistamiseks, tulemuste registreerimiseks ja vivaariumi hooldamiseks on vaja kõrgelt kvalifitseeritud töötajaid
• tulemuste hindamise subjektiivsus
• automatiseerimise puudumine
• seda seroloogilist meetodit ei saa kuidagi standardiseerida.
• reaktsioon ei ole rakendatav käimasoleva antisüüfilise ravi taustal
• võimetus kasutada ravi kontrolli all hoidmiseks. RIBT võib süüfilisega patsientidel püsida positiivsena paljude aastate jooksul (ja isegi kogu elu), hoolimata täielikust ravist.
• reaktsioon võib anda valepositiivseid tulemusi patsientidel, kellel on pahaloomulised kasvajad, diabeet, pidalitõbi, autoimmuunhaigused, kopsupõletik, raske kardiovaskulaarne patoloogia.

RIBT eelised on järgmised:

1) piisavalt kõrge tundlikkus;

2) Kõrge spetsiifilisus.

RIF (immunofluorestsentsreaktsioon)

Immunofluorestsentsreaktsioon (RIF) on ekspressdiagnostika meetod mikroobsete antigeenide või antikehade tuvastamiseks. Fluorestseeruva signaali tuvastamisel põhinevaid teste peetakse süüfilise parimate testide hulka.

1. Meetodi ajalugu

Fluorestseeruva treponemaalse antikeha (FTA) töötasid esmakordselt välja 1957. aastal Deacon jt (Deacon, Falcone ja Harris).

2. Meetodi põhimõte

RIF-meetod põhineb asjaolul, et fluorokroomidega märgistatud antikehadega immuunseerumiga töödeldud koe antigeenid või mikroobid võivad fluorestsentsmikroskoobi UV-kiirtes hõõguda. Sellise luminestseeruva seerumiga töödeldud määrdunud bakterid helendavad mööda raku perifeeriat rohelise äärisena

Antigeenina RIF-is kasutatakse küülikuorhiidi Nicholsi tüve elusate patogeensete kahvatute treponeemide suspensiooni, mis kuivatatakse klaasklaasil ja fikseeritakse atsetooniga. Patsiendi vereseerum lisatakse kuivatatud kahvatutele treponeemidele ja kinnitatakse atsetooniga klaasile.

Pärast pesemist töödeldakse preparaati seerumiga, mis sisaldab fluorestseiiniga märgistatud inimese immunoglobuliinide vastaseid antikehi. Veel kord pestakse preparaati ja vaadeldakse fluorestsentsmikroskoobi all. Kui testitav seerum sisaldab treponemaalseid fluorestseiinivastaseid antikehi, täheldatakse treponeemide kollakasrohelist sära.

3. RIF-meetodil uurimistöö läbiviimise meetod

Objektiklaasile fikseeritud antigeeni (patogeenne treponema pallidum) töödeldakse testitava seerumiga. Pärast pesemist töödeldakse preparaati fluorestseeruva anti-inimese immunoglobuliini seerumiga, mis on märgistatud fluorokroomiga. Sel juhul seostub tekkiv fluorestseeruv kompleks (anti-inimese globuliin + fluorestseiini tioisotsüanaat) kahvatu treponema pinnal oleva inimese globuliiniga, pakkudes fluorestsentsmikroskoobis kahvatu treponema sära.

Antigeen-antikeha komplekside tuvastamiseks kasutatakse luminestseeruvat seerumit, mis esindab FITC-ga konjugeeritud liigivastaseid (inimesevastaseid) immunoglobuliine. Treponeemide vastaste antikehade olemasolu seerumis määrab fluorestsentsmikroskoobi all uuritud treponeemide sära. Test viiakse läbi kvalitatiivses ja poolkvantitatiivses versioonis.

4. Tulemuste arvestus

RIF-i tulemuste visualiseerimine toimub fluorestsentsmikroskoobi abil. Tulemusi hinnatakse preparaadis olevate treponeemide luminestsentsi astme järgi. Antikehade olemasolul on treponeemide sära näha, kuid kui seerumis antitreponeemseid antikehi ei olnud, siis treponeemid pole näha. Klaasile kinnitatud kuivatatud kahvatu treponema luminestsentsi aste on näidatud plussidega (alates "–" kuni "++++"). Negatiivne tulemus – puudub sära või taustatase – 1+.

5. Millistel haigusperioodidel on parem kasutada

Immunofluorestsentsreaktsioon (RIF) on üsna tundlik infektsiooni kõikides etappides, inkubatsiooniperioodi lõpust hilise süüfiliseni. Klassikalise kulu süüfilise esmane periood algab 3-4 nädalat pärast nakatumist. RIF muutub positiivseks esmase perioodi esimestel päevadel või isegi inkubatsiooniperioodi lõpus, alates 3. nädalast pärast nakatumist. RIF-i tulemused jäävad positiivseks kõigil perioodidel, sealhulgas hilistel vormidel.

RIF muutub positiivseks mõnevõrra varem kui RW. Mõnede aruannete kohaselt esineb positiivne RIF 80% primaarse seronegatiivse süüfilisega patsientidest. Sekundaarsel perioodil on RIF positiivne peaaegu 100% juhtudest. See on latentse süüfilise korral alati positiivne ja annab 95–100% positiivseid tulemusi haiguse hiliste vormide ja kaasasündinud süüfilise korral.

6. Tundlikkus ja spetsiifilisus

Immunofluorestsentsreaktsioon (RIF) on kõrge tundlikkuse ja spetsiifilisusega meetodite rühm. RIF on tundlik nakkuse kõikides staadiumides, alates inkubatsiooniperioodist kuni hilise süüfiliseni. WHO andmetel on RIF-i tundlikkus primaarse süüfilise korral 70-100%, sekundaarse ja hilise süüfilise korral 96-100%, spetsiifilisus - 94-100%. TsNIKVI andmetel on RIF-i tundlikkus süüfilise kõigi vormide korral 99,1%.

RIF-i spetsiifilisust saab tõsta uuritava seerumi eeltöötlemisel sorbendi – ultraheliga läbi viidud treponemaalse antigeeniga, mis seob rühmaantikehi (RIF-abs).

7. Meetodi ulatus

RIF kehtib:

• kinnitava reaktsioonina varase, latentse süüfilise korral
• retrospektiivseks diagnoosimiseks
• süüfilise varjatud vormide ja süüfilise uuringute valepositiivsete tulemuste eristamiseks.
• neurosüüfilise kinnitava testina.

RIF-i kasutatakse laialdaselt kinnitava testina, kuid see ei ole mõeldud tavapäraseks kasutamiseks ega sõeluuringuks, kuna seda on tehniliselt keeruline seadistada. RIF-i läbiviimiseks on vaja vivaariumi või osta patogeensete kahvatute treponeemide suspensiooni, mis piirab reaktsiooni võimalust. Viimastel aastatel on aga siseturul hakanud ilmuma testimissüsteemid, mis võimaldavad reaktsiooni läbi viia ilma vivaariumi ja oma patogeense pallide treponema pallidum laboratoorse tüve puudumisel.

8. Lavastusvigade, valepositiivsete ja valenegatiivuste allikad ja põhjused

LPR-i esinemine RIF-i määramisel on haruldane (koos kollagenooside, borrelioosiga).

RIF-i peetakse endiselt üheks parimaks süüfilise testiks, serodiagnoosi "kuldstandardiks". RIF-i on RIBT-ga võrreldes lihtsam seadistada,

Vaatamata kõrgele diagnostilisele väärtusele, elus T. pallidum'i kasutamise vajadusele, uuringu kõrge hind ja kestus takistavad RIF-i laialdast kasutuselevõttu igapäevapraktikas. Reaktsiooni seadistamine on töömahukas. Lisaks on RIF-i tulemuste hindamine subjektiivne.

RIF-i eelised ja RIBT on:

1) kõrge tundlikkus (eriti RIF-i jaoks);

2) Kõrge spetsiifilisus (eriti RIBT puhul).

RIF-i puudused ja RIBT:

1) Tehniline keerukus, meetodite kõrge hind.

2) Tulemuste subjektiivne hindamine, automatiseerituse puudumine;

3) RIF ja RIBT võivad süüfilisega patsientidel püsida positiivsed aastaid (ja isegi kogu elu), hoolimata täielikust ravist. Seetõttu ei saa neid reaktsioone kasutada ravi kontrollimiseks.

10. Meetodi modifikatsioonid

Praktikas kasutatakse süüfilise serodiagnostikaks mitmeid immunofluorestsentsreaktsiooni modifikatsioone ja neid on kasutatud:

• RIF-abs- kõige tundlikum süüfilise serodiagnostika meetod, see muutub positiivseks varem kui muud reaktsioonid (alates 3. nädalast pärast nakatumist);
• RIF-200(patsiendi seerumit lahjendatakse esitlemisel 200 korda) on väga spetsiifiline meetod süüfilise serodiagnostikaks.
• RIF-10(10-kordne testitava seerumi lahjendus) - tundlikum meetod kui RIF-200.
• RIF-ts viidi läbi alkoholiga.
• RIF-abs-IgM- varajase IgM klassi antitreponemaalsete antikehade tuvastamine.

1. Kõige levinum modifikatsioon RIF-abs- immunofluorestsentsreaktsioon koos imendumisega. Enne reaktsiooni seadistamist tühjendatakse katsealuse seerum mittepatogeensete treponeemide seguga, et välistada ristreaktsioonid. Rühma antikehad eemaldatakse uuritud seerumist ultraheliga hävitatud kultuuriliste treponeemide abil, mis suurendab oluliselt reaktsiooni spetsiifilisust. Kuna testitavat seerumit kasutatakse 1:5 lahjenduses, on RIF-abs väga tundlik.

Peamised näidustused RIF-abs-ide kasutamiseks kliinilises praktikas on:

• süüfilise latentse ja hilise vormi diagnoosimine,
• CSRi ja RMP valepositiivsete tulemuste tuvastamine, eriti süüfilise kahtlusega rasedatel ja somaatilistel patsientidel,
• haiguse retrospektiivse diagnoosi seadmiseks.

RIF-abs ei ole ravitulemuste hindamisel kuigi informatiivne: 85% patsientidest, kes said adekvaatset antisüüfilist ravi, püsivad RIF-i positiivsed tulemused aastaid.

Seda reaktsiooni nimetatakse süüfilise serodiagnoosi "kuldstandardiks". Seda kasutatakse vahekohtuasjades, kuid usaldusväärse tulemuse saavutamiseks on vaja küüliku 7-päevase orhiidi T. pallidum tüve Nichols värsket kontsentreeritud suspensiooni, mida ei tohiks külmutada.

2. NSV Liidus paigaldati see kahes versioonis - RIF-10 ja RIF-200, st testitava seerumi 10- ja 200-kordse lahjendamisega. RIF-200 - testitavat seerumit lahjendatakse 200 korda, et vähendada valepositiivsete tulemuste arvu. See tagab reaktsiooni kõrge spetsiifilisuse, kuid selle tundlikkus langeb mõnevõrra. RIF-10 on tundlikum, kuid annab sagedamini mittespetsiifilisi positiivseid tulemusi kui RIF-200, mida iseloomustab kõrge spetsiifilisus. RIF-10 on tundlikum, RIF-200 ja RIF-abs on spetsiifilisemad.

RIF-200 ja RIF-abs-ide tundlikkus on hinnanguliselt 84–99% ja spetsiifilisus 97–99%.

3. RIF-ts viidi läbi alkoholiga. Reaktsiooni seadistamiseks kasutatakse spetsiifiliste kesknärvisüsteemi kahjustuste tuvastamiseks tervet tserebrospinaalvedelikku.

4. Reaktsioon RIF-abs-IgM pakutud IgM klassi varajase antitreponemaalsete antikehade tuvastamiseks. Seda reaktsiooni saab kasutada kaasasündinud süüfilise, süüfilise varajaste vormide diagnoosimiseks ning uuesti nakatumise ja serorelapsi juhtumite eristamiseks.

Selle reaktsiooni kaks modifikatsiooni on teada:

– FTA-ABS-IgM, mis põhineb anti-IgM konjugaadi (fluorestseiiniga märgistatud antikehad inimese IgM vastu) kasutamisel reaktsiooni teises faasis inimese fluorestsentsvastase globuliini asemel;

- RIF-abs-IgM venekeelne versioon, mida iseloomustab see, et testitavale vereseerumile lisatakse sorbenti, mis eemaldab IgG antikehad, ja RIF-abs asetatakse ülejäänud IgM antikehadega.

Peamised näidustused RIF-abs-IgM koostise jaoks on:

- kaasasündinud süüfilise serodiagnoosimine, kui lapse nahal ja limaskestadel pole kaasasündinud süüfilise ilminguid;

- süüfilise taasinfektsiooni ja kliinilis-seroloogilise või seroloogilise kordumise diferentsiaaldiagnostika, mille puhul RIF-abs-IgM on negatiivne ja RIF-abs on positiivne;

- varakult omandatud või kaasasündinud süüfilise ravi efektiivsuse hindamine: pärast piisavat ravi muutub RIF-abs-IgM järgmise 3-6 kuu jooksul negatiivseks.

Seda reaktsiooni saab kasutada kaasasündinud süüfilise tuvastamiseks. On teada, et suured IgM molekulid ei pääse läbi terve platsenta. Seetõttu võivad M-klassi M-klassi antikehad treponema pallidum'i vastu ilmneda lapse kehas kas platsenta barjäärifunktsiooni rikkumise tõttu või neid toodab süüfilisega lapse keha. Süüfilise haige veres ilmnevad IgM klassi antikehad juba haiguse esimestel nädalatel ja IgG klassi antikehad hiljem. Mõlema klassi antikehade eraldi määramine on laste kaasasündinud süüfilise diagnoosimisel äärmiselt kasulik, kuna IgM-klassi antikehade olemasolu lapsel esimesel elukuul viitab sellele, et need on moodustatud süüfilisega lapse kehas. samas kui ainult IgG antikehade tuvastamine näitab viimaste ema päritolu.

Reaktsiooni avaldus 19S(IgM)-RIF-abs hõlmab suuremate 19S IgM molekulide esialgset eraldamist geelfiltrimise teel

väiksemate 7S IgG molekulide fraktsioonid. Täiendav uuring ainult 19S IgM fraktsiooni sisaldava vereseerumi RIF-abs reaktsiooni kohta,

kõrvaldab kõik võimalikud veaallikad. Kuid selle reaktsiooni seadistamise tehnika on keeruline ja aeganõudev, nõuab spetsiaalset varustust ja spetsialistide väljaõpet.

Immuunadhesioonireaktsioon (RIP, TPIA – Treponema pallida immuunadheents).

See reaktsioon põhineb Rieckenbergi 1912. aastal kirjeldatud nähtuse kasutamisel. RIP põhineb asjaolul, et süüfilisega patsiendi seerumi poolt sensibiliseeritud virulentsed koetreponeemid komplemendi ja erütrotsüütide juuresolekul kinnituvad erütrotsüütide pinnale ja kantakse tsentrifuugimisel koos nendega settesse, kaovad. supernatandist.

Reaktsiooni seadistamiseks kasutatakse järgmisi koostisosi: testseerum, antigeen, komplement, doonorerütrotsüüdid, isotooniline naatriumkloriidi lahus. Antigeenina kasutatakse Nicholsi tüve kahvatu treponema suspensiooni.

Kõige laiemalt seoses süüfilise serodiagnostikaga uurisid seda testi kodumaised ja välismaised autorid 50.–60. aastatel. Andmed RIP kui diagnostilise testi väärtuse kohta on olnud vastuolulised. Reaktsioon nõudis maksimaalset täpsust, kuna koostisosade ebatäpse valamise, katsematerjali liia või puuduse korral valmistises saadi ebausaldusväärsed tulemused.

Venemaal viis ulatusliku uurimistöö läbi L.V. Sazonova, kes sai sarnased tulemused RIP-is ja RIT-is, kasutades Nicholsi tüve patogeensete kahvatute treponeemide värskelt valmistatud suspensiooni. Fenooliga kuumutatud või konserveeritud antigeeni kasutamine moonutas aga järsult reaktsiooni tulemusi ja muutis antigeeni ebastabiilseks. Soovitage seda testi RIT L.V asendamiseks. Sazonova pidas seda võimatuks.

G.P. Avdeeva, kasutades antigeeni valmistamisel muid temperatuuri- ja ajarežiime, sai RIP-i uuringus erinevaid tulemusi. Tema sõnul on selle reaktsiooni tundlikkus kõrgem kui KCP ja RIT tundlikkus, kuid mõnevõrra madalam kui RIF ning RIP, RIT ja RIF spetsiifilisus on lähedane.

Kuid RIP-i antigeeni tootmisest vabanemise puudumine ei võimaldanud seda testi laiemalt uurida ja selle praktikas kasutusele võtta.

Passiivse hemaglutinatsiooni RPHA reaktsioon

Passiivne hemaglutinatsioonireaktsioon (RPHA) on tavaline seroloogiline test, mis on kindlalt juurdunud laboripraktikas. on uuringus üsna kõrge efektiivsusega.

1. RPHA meetodi ajalugu

Esimest korda teatasid G. Blumental ja W. Bachman (1932) RPHA kasutamisest süüfilise diagnoosimisel. 1965. aastal pakuti süüfilise diagnoosimiseks välja kaudne või passiivne hemaglutinatsioonireaktsioon. Reaktsiooni modifitseerimisest erinevaid antigeene kasutas T. Ratlev aastatel 1965-1967. RPGA mikromodifikatsiooni pakkus välja Sokh R.M. ja kaasautorid 1969. aastal. Esimese kaubandusliku katsesüsteemi töötasid välja Jaapani teadlased Tomisava et. al. aastal 1969

2. RPHA meetodi põhimõte

Antigeenidega "laetud" erütrotsüütide valmistatud homogeensest suspensioonist sadestub antikehi sisaldava uuritava seerumi lisamisel helveste kujul sade. Saadud sade koosneb antikehade poolt "liimitud" erütrotsüütidest ja seda nimetatakse "hemaglutinaat". Erütrotsüütide suspensioon valmistatakse eelnevalt ette ja tarnitakse diagnostiliste testsüsteemide osana.

Punaste vereliblede liimimise protsessi, mille pinnal esinevad antigeenid, nimetatakse "hemaglutinatsiooniks". Sidumine toimub spetsiifiliste antikehade (aglutiniinide) toimel. Reaktsiooni nimetatakse "passiivne", sest erütrotsüütide enda antigeenid ei reageeri ja erütrotsüüdid ise täidavad eranditult abiindikaatori funktsiooni.

Passiivne (kaudne) hemaglutinatsioonireaktsioon on aglutinatsioonireaktsiooni tüüp, milles antigeenide kandjatena kasutatakse erütrotsüüte (kreeka keelest háima - veri), mitte muid osakesi. Üldiselt kleepuvad aglutinatsioonireaktsioonis antikehade toimel kokku ja sadestuvad mikroobid või muud rakud - mitte tingimata erütrotsüüdid, vaid näiteks lateksiosakesed, bakterid või muud antigeeni kandvad korpuskulaarsed osakesed.

Süüfilise diagnoosimise passiivses hemaglutinatsioonireaktsioonis kasutatakse antigeenina kahvatu treponema antigeenidega kaetud jäära või linnu erütrotsüüte. Spetsiifilisi antikehi sisaldava seerumi lisamisel kleepuvad erütrotsüüdid kokku (aglutinatsioon).

RPHA reaktsiooni nimetatakse immunoloogilisteks meetoditeks, kuna. see põhineb patogeense treponema pallidum'i antigeeni spetsiifilisel interaktsioonil antikehaga. Vastavalt "võreteooriale" on aglutinatsioon pinnaantigeenimolekulide "ristsidumise" tulemus antikehamolekulidega (immunoglobuliinidega).

3. Passiivse hemaglutinatsiooni reaktsiooni avaldus

RPHA asetatakse plasttablettidesse või katseklaasidesse patsiendi vereseerumi lahjendustega, millele lisatakse erütrotsüütide diagnostikat.

Antigeeni erütrotsüütidega kombineerimise protsessi nimetatakse sensibiliseerimiseks ja sel viisil saadud tehislikku korpuskulaarset antigeeni nimetatakse sensibiliseeritud erütrotsüütideks. Erütrotsüütide diagnostikat nimetatakse erütrotsüütideks, mis on antigeeniga sensibiliseeritud.

Diagnostika valmistamiseks kasutatakse esmalt formaliini ja seejärel tanniiniga töödeldud jäära või linnu erütrotsüüte (tavaliselt kana), mis on sensibiliseeritud patogeense treponema pallidum'i (Nicholsi tüvi) või rekombinantsete treponema pallidum valkude (TpN15, TpN17, TpN47). Kasutada võib ka kultiveeritud treponema pallidum'i ultraheliga tehtud antigeeniga sensibiliseeritud lamba erütrotsüüte.

Ainult seerum (ärge kasutage plasmat). Hemolüüsitud ja hägused proovid ei sobi. Sensibiliseerimata erütrotsüüdid toimivad negatiivse kontrollina (et välistada erütrotsüütide vastaste antikehade olemasolu). Kasutage igas tootmisseerias positiivseid ja negatiivseid kontrolle.

Immunoloogilise tableti süvenditesse (rakkudesse) viiakse uuritud vereseerumi proovid ja uuritavad erütrotsüüdid. Kui patsiendi vereseerum sisaldab spetsiifilisi treponemaalseid antikehi, siis testitava seerumi lisamisel süvendisse koos antigeeniga tekivad antigeen-antikeha kompleksid, mis on seotud kandjate (erütrotsüütide) pinnaga. Visuaalselt väljendub see punaste vereliblede liimimises ehk hemaglutinatsioonis, mis on nähtav palja silmaga. Immuunkompleksid "antikeha-antigeen-erütrotsüüt", mis raskusjõu mõjul järk-järgult laskuvad, jaotuvad kogu kaevu põhja pinnale ja moodustavad iseloomuliku pildi "ümberpööratud vihmavarjust".

Sõltuvalt uuritavas proovis sisalduvate antikehade hulgast varieerub "ümberpööratud vihmavarju" kujutis maksimumist, mis hõlmab kogu kaevu põhja pinda, kuni väikese alani selle keskmises, madalaimas osas (valgustusega keskus ja intensiivsema settinud erütrotsüütide rõnga teke piki perifeeriat).

Immuunkompleksid ei moodustu, kui proovis pole spetsiifilisi antikehi või kui reaktsioonile lisatakse kontroll- (intaktsed) erütrotsüüdid. Samal ajal kogunevad erütrotsüüdid järk-järgult kaevu põhja madalaimasse punkti, moodustades kompaktse täpi või "nupu" kujul oleva kujundi, mille keskel on mõnikord kerge valgustus.

Kui inimese vereseerum sisaldab erütrotsüütidevastaseid antikehi, siis "vihmavari" tekib igal juhul - nii reaktsioonis testerütrotsüütidega kui ka kontrollerütrotsüütidega. Sel juhul on spetsiifiliste antitreponemaalsete antikehade tuvastamiseks soovitatav kasutada muid meditsiinitehnoloogiaid.

Võimalik on prosooni nähtus (reaktsiooni võimatus liigsete antikehade tõttu), mis elimineeritakse seerumi lahjendamisega.

4. Passiivse hemaglutinatsioonireaktsiooni tulemuste arvestamine

RPGA tulemusi võetakse visuaalselt arvesse 60-120 minuti pärast mikromeetodi seadistamisel ja 2-4 tunni pärast või järgmisel päeval makrovariandi seadistamisel. Suuremate (tuumaliste) linnuerütrotsüütide kasutamisel saadakse selgem pilt, tulemused fikseeritakse varasemal kuupäeval.

Võimalik on määrata tiitrit (kõrge tiiter TPHA ≥ 1:2 560).

Uuringu tulemusi hinnatakse 4+ süsteemi järgi ("-" kuni "++++") vastavalt moodustunud kile suurusele. Aglutinatsiooni korral paiknevad erütrotsüüdid augu pinnal "vihmavarju" kujul ja negatiivse tulemuse korral libisevad erütrotsüüdid vabalt alla ja kogunevad "nupu" kujul augu keskele. ".

RPGA tulemuste üldtunnustatud hinnang:

4+ - positiivne RPHA. Aglutineeritud erütrotsüüdid "vihmavarju" kujul vooderdavad ühtlaselt kogu augu pinda;

3+ – positiivne RPHA. Erütrotsüüdid ääristavad kogu augu pinda, kuid osa neist "libiseb" keskele. Samal ajal moodustub maardla perifeeriasse märgatav rõngas;

2+ - nõrgalt positiivne RPHA. Erütrotsüüdid moodustavad kaevu alumise osa väikesel alal kile, moodustades tiheda erütrotsüütide setterõnga, mille keskel on märgatav valgustus;

1+ - määramatu RPHA, erütrotsüüdid moodustavad kaevu põhjas lahtise sette, mille servad on hägused ja keskel on kerge valendik;

(–) – negatiivne RPHA, kõik erütrotsüüdid asuvad kaevu põhjas kompaktse sette kujul (nööbid või rõngad) puhta ümbritseva tausta taustal (ilma ümbritseva granulaarse settimiseta).

Välispraktikas hinnatakse RPGA tulemusi ka reaktiivseks (aglutinaadi moodustumise korral), nõrgalt reaktiivseks (kui moodustised on ebaolulised) ja mittereaktiivseks (kui aglutinatsiooni ei täheldata).

Reaktsiooni tulemuste arvestust saab teha spetsiaalsete analüsaatorite abil automaatselt. Lisaks kvalitatiivsele uuringule võimaldavad kõik testimissüsteemid kvantitatiivset analüüsi koos tiitri määramisega.

5. Millistel haigusperioodidel on parem kasutada RPHA-d

RPHA muutub positiivseks esmase perioodi keskel (7-8 nädalat nakatumise hetkest, 3-4 nädalat pärast kõva šankri tekkimist) ja püsib positiivsena aastaid pärast ravi.

Treponemavastaste antikehade väga kõrge taseme korral uuritud seerumis (mis on kõige iseloomulikum sekundaarsele süüfilisele) on võimalik TPHA valenegatiivne tulemus (nn prosooni nähtus).

Pikka aega süüfilisest paranenud inimeste veres tuvastatakse spetsiifilisi aglutiniini antikehi, mistõttu ei saa RPGA-d soovitada reinfektsiooni diferentsiaaldiagnostikaks ega nakkusprotsessi raskusastme määramiseks.

RPGA-d ei kasutata ravi kontrollimiseks, kuna. võib jääda positiivseks palju aastaid pärast taastumist. Samas saab seda kasutada lisameetodina (RMP-le või RPR-le) ravi efektiivsuse jälgimisel, antikehade tiitrite languse dünaamika uurimisel. Selle eelduseks on sama RPGA testisüsteemi kasutamine nagu patsiendi esimesel (enne ravi) läbivaatusel, samuti uuring samas laboris.

6. RPHA tundlikkus ja spetsiifilisus

RPHA-d peetakse väga tundlikuks ja spetsiifiliseks testiks. See reaktsioon on väärtuslik diagnostiline test süüfilise kõigi vormide puhul, kuid see on eriti tundlik haiguse kaugelearenenud vormide korral. RPHA tundlikkus varieerub sõltuvalt haiguse staadiumist. Primaarse süüfilise korral on RPHA tundlikkus 76% (ja kõrgem), sekundaarse süüfilise korral - kuni 100%. Varjatud varajase - 97%, hilise süüfilisega - 94%, spetsiifilisusega 98-100%. Värskete haigusvormide madalam tundlikkus on tingitud hilisemast aglutiniinide moodustumisest.

Riigiasutuse "TsNIKVI Roszdrav" andmetel oli RPHA tundlikkus süüfilise erinevate vormide diagnoosimisel 99,4%. Enamik teadlasi märgib RPHA 98–99% spetsiifilisust.

Tundlikkuse ja spetsiifilisuse poolest ei jää RPHA alla ning hiliste vormide ja kaasasündinud süüfilise puhul ületab see isegi RIF-i ja RIBT-i.

7. RPGA meetodi rakendusala

TPHA-d saab kasutada nii sõeluuringu kui ka kinnitava testina; saab kasutada poolkvantitatiivses variandis koos antikeha tiitri arvutamisega. Välja on töötatud kvantitatiivne meetod RPHA seadistamiseks, mikromeetod, aga ka automatiseeritudn.

8. RPGA omadused, eelised ja puudused

Kirjanduse andmetel on RPGA võtnud kliinilises praktikas järjekindlalt liidripositsiooni enamikus maailma riikides. TPHA on välismaistes suguhaiguste kliinikutes enim kasutatav test.

RPGA tehnikat on lihtne teostada, ei vaja erivarustust: selle seadistamiseks on vaja vaid hemaglutinatsiooniplaati. Uuring ei võta kaua aega; reaktsioon on väga tundlik ja spetsiifiline. Meetodi aprobeerimine kliinilises praktikas on näidanud, et see on äärmiselt lihtne, odav ja tundlik. Sarnaselt ELISA-ga on RPHA-d lihtne teostada, see ei nõua kõrgelt kvalifitseeritud töötajaid ja eriseadmeid ning selle automatiseerimine on võimalik.

RPGA testi eelised:

• lihtne seadistada ja tõlgendada,
• ei vaja erivarustust,
• aeg tulemuse saamiseks - 45 minutit,
• sobib masssõeluuringuks (lahjenduses 1:20 on vaja ainult 25 µl seerumit),
• kõrge standardiseerituse tase,
• sisekontrollide olemasolu,
• pikk säilivusaeg
• vastuvõetav hind
• raamatupidamise automatiseerimise võimalus.

Samuti tuleks märkida RPGA puudusi:

• mittespetsiifiliste reaktsioonide võimalus erütrotsüütide vastaste antikehade juuresolekul,
• tiitri ja süüfilise staadiumi korrelatsiooni puudumine,
• hilisem positiivne reaktsioon süüfilise varases staadiumis,
• valepositiivsete reaktsioonide võimalus alkoholi tarvitanud isikutel, narkomaanidel,
• tundlikkus vibratsiooni ja temperatuuri suhtes laboris.

RPGA eelised võrreldes RIBT-i ja RIF-iga on järgmised:

• tööstuslike katsesüsteemide kasutamine,
• reaktsiooni automatiseerimise võimalus,
• pole vaja töötada elava kahvatu treponemaga,
• välistab vajaduse vivaariumi järele.

9. RPHA seadistusvigade allikad ja põhjused, valepositiivsed ja valenegatiivsed tulemused

Passiivse hemaglutinatsiooni reaktsioon on suhteliselt lihtne uuring; selle teostamisel on vaja järgida kõiki diagnostikaseadmete tootjate soovitusi ja tööreegleid kliinilise diagnostika laboris. Tehtud vead võivad viia reaktsiooni nii valenegatiivsete kui ka valepositiivsete tulemuste ilmnemiseni ja registreerimiseni. RPGA valepositiivsed tulemused võivad olla tingitud inimfaktori ja bioloogiliste tegurite mõjust.

Võib saada valepositiivseid tulemusi

• mittesuguhaigustega treponematoosidega patsientide vereseerumite uurimisel,
• reumatoidfaktori tõttu
• Treponemaalse antigeeniga ristreageerivate antikehade tõttu, mis tekivad mitmesuguste süsteemsete või ravimitest ja ravimitest põhjustatud ainevahetushäirete käigus,
• immunoglobuliinide ebanormaalse taseme tõttu;
• vastsündinutel - ema IgG-vastaste IgM-antikehade moodustumise tõttu loote või lapse kehas, mis raskendab tulemuste tõlgendamist ja kaasasündinud süüfilise diagnoosimist.

Vead, mis on põhjustatud inimeste osalemise teguri mõjust uuringule:

• saastunud mikroplaadid
• vale pipeteerimine
• vibratsioon laboris
• õhutemperatuur laboris on väljaspool temperatuurivahemikku: 18–25 kraadi

Kõige tüüpilisemad tehnilised vead RPGA seadistamisel, mis põhjustavad ebausaldusväärseid tulemusi, on järgmised:

• koostisainete ebatäpne lahjendamine,
• temperatuuri rikkumine,
• reaktiivide inkubatsiooniaja rikkumine,
• tabletile reaktiivide pealekandmise tingimuste rikkumine,
• lahuste pH mittevastavus nõutavatele,
• laboratoorsete klaasnõude saastumine.

RPGA seadistamisel võivad vigade allikaks olla ka järgmised tehnilised punktid:

• kontrollvereseerumite reaktsiooni koostisest väljajätmine;
• erütrotsüütide ebaühtlane kontsentratsioon diagnostikas, mis on tingitud ebapiisavast segamisest enne kasutamist;
• diagnostiliste ja kontrollerütrotsüütide säilitamise tingimuste rikkumine; aegunud komplektide kasutamine;
• saastunud katseklaaside, pipetiotste, pipettide, immunoloogiliste plaatide, lahuste kasutamine reaktsioonide seadistamisel;
• vereseerumi proovi esialgse lahjendamise ebatäpsused;
• ebapiisav põhjalikkus järjestikuste topeltlahjenduste tegemisel;
• temperatuurirežiimi ja inkubatsiooniaja mittejärgimine;
• kõrvaliste vibratsioonide olemasolu ja immunoloogilise plaadi raputamine inkubatsiooni ajal;
• RPGA määramise meetodi rikkumine, mis väljendub kontrollerütrotsüütidega uuringu läbiviimisest keeldumises.

Vereplasma kasutamine, mis sisaldab antikoagulante, mis võivad põhjustada mittespetsiifilist erütrotsüütide aglutinatsiooni (RPHA), võib viia tulemusteni, mida ei saa tõlgendada.

Valepositiivsete ja valenegatiivsete tulemuste arv on väiksem kui teiste seroloogiliste testide puhul. LPR-d RPHA taustal on haruldased ja võimalikud treponematooside korral (leib, bejel, pint). Samuti registreeriti valepositiivseid tulemusi (kokku alla 1%) narkosõltlastel, nakkusliku mononukleoosi, borrelioosi, pidalitõve, kollagenooside, maksatsirroosi, lümfosarkoomiga patsientidel ja ka rasedatel.

Reaktsiooni valenegatiivsed tulemused võivad olla tingitud konkurentsist IgM ja IgG antikehade vahel. Valenegatiivsed tulemused on võimalikud ka HIV-nakkusega patsientidel.

10. RPHA meetodi modifikatsioonid

RPGA seadistusel on mikro- ja makro modifikatsioonid, esimest kasutatakse sagedamini säästlikkuse, seadistamise kiiruse ja tulemuste arvestamise tõttu.

Lisaks töötati välja pildianalüüsi automaatne diagnostikakompleks, mis võimaldas teostada tulemuste kvantitatiivset automaatset hindamist ja välistada subjektiivsuse saadud andmete tõlgendamisel. Riistvara-tarkvara kompleks tunneb pildi ära, töötleb andmeid ja annab vastuse suhtelistes ühikutes.

Lugejaid ja automaatseid analüsaatoreid kasutatakse ka RPGA tulemuste salvestamise automatiseerimiseks.

TPPA (Treponema pallidum particle agglutination) – tehisosakeste aglutinatsioonitest Treponema pallidum'i antikehade tuvastamiseks

TPPA testi lühikirjeldus

Praegu kasutatakse süüfilise diagnoosimiseks ka passiivse hemaglutinatsiooni meetodi modifikatsiooni - TPRA (Treponema pallidum particle agglutination), mille puhul kahvatu treponema antigeen fikseeritakse želatiiniosakestele. Kuna kunstlikel polümeeriosakestel ei ole oma bioloogilist aktiivsust määravaid antigeene, siis on neil põhinevaid süüfilise serodiagnostika komplekte põhjust pidada arenenumateks. Bioloogiliselt inertsete kunstlike osakeste kasutamine minimeerib mittespetsiifilist aglutinatsiooni, mida tavaliselt esineb teiste kandjate puhul.

TPPA-d kasutatakse patogeensete treponeemide erinevat tüüpi ja alamliikide antikehade seroloogiliseks diagnoosimiseks. Seda testi saab kasutada süüfilise, pint, bejeeli ja yawsi tekitajate vastaste antikehade tuvastamiseks.

Uuringu protseduur on väga lihtne ega vaja erivarustust – kasutatakse standardseid "U"-kujulisi mikroplaate. Test põhineb T. pallidum'i antigeenidega, patsiendi vereseerumis leiduvate antikehadega, sensibiliseeritud želatiiniosakeste aglutinatsioonil.

TPPA on kinnitav treponemaalne test, mida saab mugavalt kasutada nii väikese hulga proovide kui ka massisõeluuringu jaoks. Välismaal kasutatakse TPPA-d kinnitava testina ja mikrohemaglutinatsiooni testi MHA-TP (microhemaglutination assay for antibodies to T. pallidum) asendamiseks.

TPPA testi tundlikkus on 85–100%, spetsiifilisus aga 98–100%. TPPA tundlikkus primaarse süüfilise suhtes on 88%, sekundaarse ja hilise latentse süüfilise puhul 98%-100%.

Kui süüfilise diagnoosimiseks kasutatakse TPPA-d, võivad teist tüüpi treponema (nt T. pallidum endemicum, pertenuum või carateum) vastased antikehad põhjustada valepositiivseid tulemusi. Nende antikehade eemaldamiseks seerumiproovidest enne testi alustamist on mitmeid meetodeid.

TPPA testi põhimõte

TPPA on želatiiniosakeste passiivne aglutinatsioonimeetod inimese seerumis või plasmas. Patogeense treponema vastaseid antikehi sisaldav seerum reageerib želatiiniosakestega, mis on sensibiliseeritud ultraheliuuringuga Nicholsi tüve kahvatu treponema antigeeniga. Reaktsiooni tulemusena moodustub mikrotiiterplaadi süvendis aglutineerunud želatiiniosakestest sile kile.

Kui antikehad puuduvad, settivad osakesed plaadi süvendi põhja, moodustades aglutineerimata osakestest kompaktse "nupu". Sensibiliseerimata želatiiniosakestega kontrollsüvendid peaksid samuti näitama iga seerumi jaoks sellist kompaktset "nuppu", st aglutinatsiooni ei esine.

TPPA testi rakendamine

TPPA on universaalne test, mida saab võrdselt edukalt kasutada nii elanikkonnarühmade süüfilise kohustuslikul ennetusuuringul (sõeluuringul) kui ka spetsialiseeritud dermatoveneroloogilistes asutustes. TPPA testi eeliseks on selle kõrge tundlikkus, mis ei jää alla klassikalistele testidele, mis olid kuni viimase ajani süüfilise serodiagnoosi "kuldstandardiks". Testi eelisteks on ka kõrge reprodutseeritavus, samuti reaktsiooni seadistamise lihtsus ja kiirus.

TPPA testi kasutatakse süüfilise mittetreponemaalsete sõeltestide (nt VDRL-testi) positiivsete tulemuste kinnitamiseks ja patsientide hindamiseks, kellel on negatiivsed mittetreponemaalsed testid, kuid kellel on hilisele süüfilisele viitavad nähud või sümptomid. TPPA kasutamine ainsa süüfilise sõeltestina ei ole soovitatav.

Lisaks saab TPPA aglutinatsioonitesti kasutada tserebrospinaalvedeliku proovide uurimiseks neurosüüfilise diagnoosimisel. Sel juhul, nagu ka teiste seroloogiliste testide puhul, tuleks tulemuste tõlgendamisel läbi viia kohustuslik kombinatsioon haiguse muude näitajate ja sümptomitega.

TPPA testi tulemused

Tulemust hinnatakse "plusside" süsteemi järgi - alates (-) kuni (2+). Katsetulemused on nähtavad palja silmaga ja neid tõlgendatakse järgmiselt:

Aglutinatsiooni aste	Testi tulemus	Tõlgendamine
Aglutineeritud osakesed kattuvad ühtlaselt plaadi põhjaga	2+	Positiivne
Märkimisväärne suur rõngas ebaühtlaste välisservade ja perifeerse aglutinatsiooniga	1+	Positiivne
Osakesed moodustavad kompaktse rõnga, mille keskel on tühimik ja mis on siledad välispiirid	±	nõrgalt positiivne
Osakesed moodustavad kaevu keskosas kompaktse rõnga, mille keskel on väike vahe ja sile välispiir.	–	Negatiivne
Osakesed moodustavad sileda välispiiriga augu keskosas "nupu".	–	Negatiivne

Tulemused salvestatakse, et teha kindlaks vastavus ülaltoodud kirjeldusele. Määramatu tulemusega (±) proove tuleks uuesti testida. Juhul, kui proov annab mitmes TPPA testis ebamäärase tulemuse, on soovitatav uuring läbi viia muude meetoditega.

Analüüsi tulemusi ei tohiks käsitleda eraldiseisvana. Näiteks nakkuse varases staadiumis on antikehade hulk veel liiga väike, mistõttu puudub TPPA ja paljude teiste meetodite tundlikkus. Seetõttu tuleb süüfilise kahtluse korral proovid uuesti läbi vaadata, isegi kui analüüsitulemused on negatiivsed. Diagnoosi tegemiseks on vaja arvesse võtta patsiendi kliinilisi sümptomeid, kliinilist ajalugu ja muid andmeid.

Nagu TPHA testis, võib TPPA puhul täheldada prosooni fenomeni ja valenegatiivset tulemust, kui seerumiproov sisaldab liiga kõrget antikeha tiitrit.

ELISA - ELISA

Ensüüm-immunoanalüüs (ELISA; Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs, ELISA) on üks paljudest meetoditest nakkushaiguste seroloogiliseks diagnoosimiseks. Ensüüm-immunoanalüüs (ELISA) süüfilise serodiagnostikas on kahvatu treponema antigeenide vastaste klasside M, G ja A antikehade (IgM, IgG, IgA) test. ELISA-d on võimalik teha tserebrospinaalvedelikuga.

Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) kasutuselevõtt praktikas Wassermani reaktsiooni ja teiste kardiolipiinitestide asemel on oluliselt parandanud süüfilise laboratoorse diagnoosimise kvaliteeti. Selle meetodi oluliseks eeliseks on uurimisprotsessi automatiseerimise võimalus, mis vähendab inimfaktori mõju.

1. ELISA meetodi ajalugu

Tahkefaasilise kandja pinnal tehtava ensüümi immuunanalüüsi põhiprintsiibid töötasid välja E. Engvar et al. (1971), B.Van Weeman ja A.Schuurs (1971). Nende välja töötatud ensüümi immuunanalüüsi pakkusid esmakordselt süüfilise diagnoosimiseks 1975. aastal J. Veldkamp ja A. Visser, kes hindasid selle automatiseeritud testi potentsiaali. ELISA-d hakati süüfilise diagnoosimisel laialdaselt kasutama 1980. aastatel, mil töötati välja ja sertifitseeriti diagnostilised testid ning standardiseeriti testimismeetodid. NSV Liidus töötasid süüfilise diagnoosimise ELISA tehnika välja V. N. Bednova, A. V. Babiy ja A. V. Kotrovsky (1982, 1983).

2. ELISA meetodi põhimõte

Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs (ELISA) on reaktsioonimehhanismi järgi lähedane RIF-ile (tuvastatakse samad antikehad). Ensüümi immuunanalüüsi reaktsiooni nimetatakse immunoloogiliseks reaktsiooniks, mis põhineb treponema pallidum'i antigeenide väga spetsiifilisel interaktsioonil süüfilisega patsiendi antikehadega.

Süüfilidoloogilises praktikas kasutatakse peamiselt ELISA kaudset varianti. Kõige sagedamini kasutatava kaudse reaktsiooni variandi põhimõte on järgmine. Polüstüreenplaadi süvendite pinnale on fikseeritud immuunkompleksid, mis moodustuvad süüfilisega patsiendi antikehade koostoimel kahvatu treponema antigeenidega. Pärast seda tuvastatakse need värvireaktsioonis, kasutades spetsiifilisi konjugaate ja sobivaid substraat-kromogeenseid lisandeid.

Testi sooritamise protseduur on järgmine: patsiendi seerum asetatakse tahkefaasilisele kandjale, millele on kinnitatud antigeen. Antikehade olemasolul selles moodustub kandja pinnale antigeen-antikeha kompleks. Reaktsiooni tulemuste "avaldamiseks" kasutatakse inimese Ig vastaseid liigivastaseid antikehi, mis on konjugeeritud ensüümmarkeritega. Positiivse reaktsiooni korral lagundab antigeen-antikeha kompleksiga seotud ensüüm süsteemi lisatud substraadi, mille tulemusena tekib erineva intensiivsusega värvumine.

Reaktsioonis määratakse tahkele faasile adsorbeerunud AG ja AT kompleksi, kasutades ensüümiga märgistatud antiglobuliini antikehi, vastavalt ensüümi värvusreaktsioonile substraadiga.

Reaktsioonis määratakse tahkele faasile adsorbeerunud antigeenide ja antikehade kompleks, kasutades ensüümiga märgistatud antiglobuliini antikehi.

ELISA võimaldab tuvastada erinevate klasside seerumi Ig-d. Turul on süsteeme, mis võimaldavad teil määrata eraldi IgM ja IgG ning koguantikehi.

ELISA jaoks kasutatavatel spetsiifilistel antigeenidel võib olla erinev päritolu:

ülihäälne- need on saadud bakteriraku T.pallidum hävitamise tulemusena ultraheli või muul meetodil;

rekombinantne- need saadakse geenitehnoloogia tehnoloogiate abil, viies bakteriraku (näiteks Escherichia coli E.Coli) genoomi teatud T.pallidum antigeeni sünteesi eest vastutava geeni, millele järgneb bakterite massi kasv. tootev mikroorganism, nende rakkude hävitamine, antigeeni eraldamine ja puhastamine;

peptiid- saadud T.pallidum valkude antigeensete epitoopide järjestikuse keemilise sünteesi tulemusena.

Keha on võimeline moodustama antikehi peaaegu iga antigeeni molekuli osa vastu. Normaalse immuunvastuse korral seda tavaliselt ei esine. Ühel või mitmel valguantigeenist eraldatud immunogeensel peptiidil on eriline antigeensus ja enamik antikehi moodustub spetsiifiliselt nende vastu. Nad arendavad kõige intensiivsemat immuunvastust. ELISA kõige informatiivsemad näitasid kahvatu treponema valkude immunodominantseid piirkondi molekulmassiga 15 kD, 17 kD ja 47 kD. Antigeenina kasutati Nicholsi tüve patogeensete treponeemide pesuaineekstrakti või sonikaati.

3. Uurimistöö läbiviimise meetod meetodiga

Meetodi põhimõte on identifitseerida tahkele faasile (plastplaadi süvendite pinnale) adsorbeeritud spetsiifiline antigeen-antikeha kompleks ensüümiga (peroksüdaasiga) märgistatud antiglobuliini antikehadega, kasutades substraadiga värvireaktsiooni, mis on kvantifitseeritud spektrofotomeetriliselt.

Polüstüreenplaadi süvendite sensibiliseerimiseks kasutatavad antigeenid võivad olla:

• lüsaat- saadud kahvatu treponema hävitamise tulemusena ultraheliga;
• peptiid- saadud kahvatu treponema valkude fragmentide keemilise sünteesi tulemusena ja millel on patogeeni algsete valkudega sarnane antigeenne reaktiivsus;
• rekombinantne- saadud geenitehnoloogia meetoditega, kandes antigeenseid determinante, mis on identsed kahvatu treponemaga.

Süüfilidoloogilises praktikas kasutatakse tavaliselt ELISA kaudset varianti.

4. Tulemuste arvestus

ELISA-s kasutatakse antigeen-antikeha reaktsiooni visualiseerimiseks ensüümi reaktsiooni (leeliseline fosfataas või mädarõika peroksidaas) substraadiga, mis muudab selle värvi. Värvi intensiivsus määrab reaktsiooni positiivsuse ("-" kuni "++++"). ELISA tulemusi saab hinnata visuaalselt 4-punktilises süsteemis või instrumentaalselt digitaalsete optilise tiheduse indikaatorite kujul, mis saadakse spetsiaalsetel lugejatel (nt Multiscan) lainepikkusel 492 nm. Sest tulemuste hindamine toimub spektrofotomeetriliselt, see välistab subjektiivse tõlgendamise.

5. Millistel haigusperioodidel on parem kasutada

ELISA positiivsuse tingimused - alates 4. nädalast pärast nakatumist. ELISA (nagu ka RIF) tulemused muutuvad positiivseks esmase perioodi esimestel päevadel või inkubatsiooni lõpus ja jäävad positiivseks kõigil perioodidel. ELISA on eriti väärtuslik süüfilise varajases diagnoosimises – positiivseid antikehade tulemusi võib saada juba haiguse inkubatsiooniperioodi lõpus (st 4-6 nädalat pärast nakatumist).

6. Tundlikkus ja spetsiifilisus

ELISA on väga tundlik ja spetsiifiline test, mis on selle eelis. ELISA on reaktsioonimehhanismi, tundlikkuse ja spetsiifilisuse poolest lähedane RIF-ile, tk. mõlemas reaktsioonis osalevad samad antikehad. Enamik teadlasi märgib kõrget spetsiifilisust ja tundlikkust haiguse kõigil etappidel. Erinevate ELISA variantide tundlikkus ulatub G. A. Dmitrijevi sõnul 98–100% -ni ja spetsiifilisus 96–100%. TsNIKVI andmetel on ELISA tundlikkus süüfilise suhtes 99,1% (Vene Föderatsiooni korraldus nr 87 M3).

Tahkefaasi ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) variant on üks tundlikumaid seroloogilisi teste, mis võimaldab tuvastada 0,0005 µg/ml antikehi ja 0,000005 µg/ml antigeene.

7. Meetodi ulatus

Meetodit soovitatakse kasutada rasedate, kontaktisikute, doonorite ja riskirühmade esindajate uurimisel. ELISA-d saab kasutada nii sõeluuringu kui ka kinnitava testina. ELISA on suhteliselt lühikese ajaloo jooksul arenenud soovituslikust testist kinnitavaks testiks. Süüfilise diagnoosimisel kasutatakse testi ka positiivseid tulemusi andvate proovide kinnitava testina, kasutades erinevaid mittetreponemaalseid teste ja TPHA-d.

ELISA meetodit saab kvantitatiivselt kasutada positiivsuse ehk reaktiivsuse indeksi arvutamisel, mis võimaldab hinnata antikehade taset proovis.

Praegu reguleerib Venemaal ensüümi immuunanalüüsi kasutamist süüfilise diagnoosimisel Vene Föderatsiooni tervishoiuministeeriumi 26. märtsi 2001. aasta korraldus nr 87 "Süüfilise seroloogilise diagnoosi parandamise kohta" (lisa nr. 1 "Süüfilise sõeluuringute ja diagnostiliste testide seadistamine"). Korralduses on kavas seroreaktsioonide kompleksis (SSR) olev RSK asendada ELISA ja RPHA-ga.

8. Lavastusvigade, valepositiivsete ja valenegatiivuste allikad ja põhjused

Ensüüm-immunoanalüüs on keeruline mitmeetapiline uuring, mille käigus on vaja rangelt järgida kõiki diagnostikakomplektide tootjate soovitusi, uuringus kasutatud seadmete reguleerimise ja konfigureerimise reegleid.

ELISA seadistamisel võivad vigade allikaks olla järgmised punktid:

Uuring hüperlipideemilise, hemolüüsitud vereseerumi või bakterite kasvu tunnustega proovide reaktsiooni kohta;

Ärge harjutage bioloogilise materjali proovi kahekordset või enamat külmutamist, vajadusel tehke kordusuuring, kasutage duplikaatkatsutist võetud seerumit;

Immunosorbendi ja pesulahuse säilitamise tingimuste ja tingimuste rikkumine; aegunud testikomplektide kasutamine;

Reaktsioonikomponentide rakendamine teistest diagnostikakomplektidest;

Reaktsioonietappide aja rikkumine;

immunoloogilise plaadi süvendite kuivatamine reaktsioonietappide ajal;

Plastnõude (plastist kandikute) taaskasutamine kromogeeni ja substraadi segu valmistamiseks;

Kasutatavate seadmete (seib ja spektrofotomeeter) tööparameetrite metroloogilise kontrolli sageduse mittejärgimine;

Saastunud laboriklaaside kasutamine reaktsioonide seadistamisel: kolvid, mõõtesilindrid, katseklaasid, pipetid, pipetiotsad;

Bioloogilise materjali proovide lahjendamise ebapiisav põhjalikkus;

Vead bioloogilise materjali proovi sisestamisel tableti vastavasse süvendisse;

Vead õppetulemuste kandmisel registreerimispäevikusse, õppeprotokolli või vastusevormi.

Diagnostiliste testikomplektide kasutamise juhendi soovituste hoolikas rakendamine, pipetidosaatorite ja automaatsete seadmete täpsuse regulaarne kontrollimine, sisemiste positiivsete ja negatiivsete kontrollide kasutamine võimaldavad saada väga reprodutseeritavaid ELISA tulemusi.

9. Omadused, eelised ja puudused

ELISA viitab kaasaegsetele paljutõotavatele süüfilise serodiagnostika meetoditele selle lihtsuse, reprodutseeritavuse ja kättesaadavuse tõttu. Antikehade tuvastamine ELISA abil on ideaalne diagnostiline meetod, mis sobib suure hulga proovide samaaegseks uurimiseks. Oma eeliste tõttu on see populaarsust kogunud kõigis riikides.

ELISA uurimistehnoloogia tagab kõigi kaubanduslike diagnostiliste testikomplektide tootjate soovituste järgimise ja uurimisprotseduuri põhjalikkuse. ELISA uuringute läbiviimiseks on vaja osta täiendavaid spetsiaalseid seadmeid. Seadistustehnika võtab kauem aega võrreldes RMP, RPR ja RPGA-ga.

Mitme etapi või kogu protsessi kui terviku automatiseerimise olemasolu võimaldab samaaegselt uurida suurt hulka bioloogilise materjali proove koos uuringu kõrge standardiseerimisega, minimeerides subjektiivse elemendi tulemuste hindamisel, fikseeritud uuringuprotokollide salvestamise võimalus, mis võimaldab arhiveerida uuringuandmeid ja neid uuesti retrospektiivseks analüüsiks suunata.

Eelised:

• Võimaldab süüfilise tekitaja vastaste IgM ja IgG antikehade diferentseeritud ja täielikku määramist.
• kõrge tundlikkus ja spetsiifilisus läheneb 100%
• reprodutseeritavus
• automatiseerimise võimalused

ELISA eelised hõlmavad kõrget spetsiifilisust (96–100%) ja tundlikkust (98–100%), mida märkis enamik teadlasi.

Mitme etapi või kogu protsessi kui terviku automatiseerimise olemasolu võimaldab teil samaaegselt uurida voogu suure hulga bioloogilise materjali proovidega koos uuringu kõrge standardiseerimisega, minimeerides subjektiivse elemendi hindamisel. tulemused, võimalus salvestada fikseeritud uuringuprotokolle, mis võimaldavad teil uuringuandmeid arhiveerida ja neid retrospektiivseks analüüsiks uuesti kasutada.

Manuaalsete meetodite, sealhulgas T. pallidum'i antigeenide vastaste antikehade määramise ELISA abil, olulised puudused on:

~ personali võimalikud vead õppetöö käigus (järelvalvamine, hooletus, tehnoloogia rikkumine);

~ uurimisprotsessi täieliku standardimise võimatus ELISA manuaalse versiooniga;

~ suurenenud personali nakatumise oht.

10. Meetodi modifikatsioonid

Lisaks klassikalisele kaudsele ELISA-le on ka meetod tuntud. püüdmine ELISA. Selle pakkusid 1989. aastal välja O. E. Ijsselmudien jt. tuvastada IgM klassi antikehi Tr antigeenide vastu. pallidum. Meetod on kõrge spetsiifilisuse ja tundlikkusega.

Klassi M inimese immunoglobuliinide vastased puhastatud antikehad sorbeeritakse tableti süvendite pinnale ja pärast testitava seerumi inkubeerimist seondub kogu IgM kandjaga. Esinemine seotud IgM-i hulgas, mis on spetsiifilised antigeenide Tr suhtes. pallidum tuvastatakse Tr antigeenide abil. pallidum konjugeeritud ensüümiga.

See meetod võimaldab tuvastada mitte ainult IgM klassi, vaid ka IgG, IgA klassi antikehi. Selleks sensibiliseeritakse plaatide süvendid inimese immunoglobuliinide vastaste teatud klassi afiinsuspuhastatud antikehadega. Sel juhul püütakse selle klassi antikehad seerumist ja treponemispetsiifiliste antikehade tuvastamine toimub nende kombineerimisel konjugaadiga, mis on treponemaalse antigeeni ja ensüümi kombinatsioon.

Lõksu ELISA kasutamine vähendab reumatoidverefaktori poolt vahendatud valepositiivsete reaktsioonide riski, M ja G klassi immunoglobuliinide ristreaktsioone. Vastsündinute uurimisel ilmnevad antud juhul valepositiivsed testitulemused, mis on seotud vastu suunatud IgM tuvastamisega. Samuti on välistatud ema antitreponemaalne IgG.

Kuna ELISA variante kasutatakse välismaal laialdaselt ensüümi immuunanalüüs (EIA) ja süsteem ICE süüfilis. Viimases adsorbeeriti plaadi süvenditesse IgM ja IgG vastaste antikehade segu, samuti kolm rekombinantset T. pallidum valku. Positiivseid tulemusi testitakse samas testisüsteemis kahes korduses, et saada lõpptulemus.

Venemaal on kodumaiste reaktiividega ELISA abil süüfilise serodiagnostikaks välja töötatud mitmeid katsesüsteeme. Nendel süsteemidel on kõrge spetsiifilisus ja tundlikkus.

Lisaks ülaltoodule on ka teisi ELISA võimalusi, sealhulgas neid, mis võimaldavad otsest patogeeni tuvastamist verest (otsene ELISA), dot-ELISA koos reaktsiooniga nitrotselluloosi ribadel, ELISA kapillaarverega, samuti immunoblotanalüüs, või Western blot, mille käigus tuvastatakse samaaegselt patogeeni erinevate komponentide vastased antikehad.

ELISA kaasaegne täiustatud modifikatsioon on immunoblotanalüüs.

ICA (immunokeemiluminestsentsanalüüs), ICL (immunokemiluminestsentsanalüüs)

Vene Föderatsiooni tervishoiu moderniseerimise kontekstis laboridiagnostika arenguga on laborite praktikasse jõudnud laboriuuringute automatiseerimine, mis võimaldab standardiseerida uuringute analüütilisi etappe. See parandab diagnostika kvaliteeti. Automatiseerimise kasutuselevõtuga hakati rakendama uusi kõrgtehnoloogilisi kõrge tundlikkuse ja spetsiifilisusega meetodeid, näiteks kemoluminestsentsimmunoanalüüsi (CLIA)

Kemiluminestsents on footonite emissiooniprotsess oksüdatiivsete keemiliste reaktsioonide elektrooniliselt ergastatud produktide üleminekul algsesse energiaolekusse. Kemoluminestsentsreaktsiooni käigus vabaneb märkimisväärne kogus energiat ja kiiratava valguse kvantsaagis on üsna kõrge. Kõigist mitteisotoopsetest meetoditest tagab kemoluminestsents kõrgeima tundlikkuse. Immunomeetriliste meetodite puhul on kemoluminestsentsi tundlikkus suurusjärgus kõrgem kui radioimmunoanalüüsil.

Immunokemiluminestsentsi (ICL) meetod on nüüdseks leidnud rakendust kasvajamarkerite, autoimmuunhaiguste, diabeedi, südamemarkerite, hormoonide (kilpnäärme-, neerupealiste-, nais- ja meessuguhormoonid), tõrvikuinfektsioonide, viirushepatiidi, herpese rühma viiruste diagnoosimisel.

Immunokemiluminestsentsi meetodi põhjal on välja töötatud mitmeid väga tundlikke ja spetsiifilisi (98-100%) süüfilise diagnoosimise testsüsteeme, mida kasutatakse peamiselt välismaal.

Meetodis kasutatakse antigeenidena geenitehnoloogia meetoditega saadud rekombinantseid lipoproteiine, mis on T.pallidum antigeenide täielikud analoogid.

Kliinilise uuringu tulemuste põhjal on ICA meetodit tunnustatud ja soovitatud kasutada Venemaa Föderatsioonis süüfilise laboratoorses diagnoosimises sõeluuringu ja kinnitava testina, kui laborites on olemas vastav varustus. 2012. aastal lisati ICA sugulisel teel levivate infektsioonide ja urogenitaalsete infektsioonidega patsientide ravimise kliinilistesse juhenditesse süüfilise diagnoosimise sõeluuringu ja kinnitava testina.

Seega annab kõrgtehnoloogilise ICA kasutamine, mis on automatiseerimise kasutuselevõtuga jõudnud nii maailma kui ka kodumaise laboridiagnostika praktikasse, järgmised eelised:

• subjektiivsete tegurite mõju välistamine uuringu analüütilises etapis
• töötajate ohutus potentsiaalselt nakatunud bioloogilise materjali uuringute läbiviimisel
• tulemuste saamise kiiruse suurendamine patsiendi poolt
• teadusuuringute standardimine ja uuringute kvaliteedi kontroll
• usaldusväärsete ja usaldusväärsete tulemuste edastamine patsientidele
• kvaliteetsed kliinilised laboriuuringud.

Tundlikkuse poolest on ICA meetod võrreldav radioimmunoanalüüsi meetodiga ning teostamise lihtsuse, personali ohutuse ja paljude muude parameetrite poolest ületab see seda.

Kõrge tundlikkuse ja spetsiifilisusega (98–100%) ICA meetod võimaldab kvantifitseerida süüfilise tekitaja vastaste antikehade taset ning seda saab kasutada süüfilise infektsiooni kinnitamiseks ja sõeluuringuks. Kasutuspiirangud: ei saa kasutada ravi efektiivsuse jälgimiseks, võib anda valepositiivse tulemuse.

Immunokromatograafia (ICH).

Vene Föderatsioonis on suhteliselt uued meetodid treponema-spetsiifiliste antikehade tuvastamiseks, mis põhinevad immunokromatograafia (ICH) meetoditel. Nagu ICA meetodi puhul, kasutatakse antigeenidena geenitehnoloogia meetoditega saadud rekombinantseid lipoproteiine (näiteks: Tp15, Tp17, Tp47 antigeenid) ja biosünteetilist TmpA peptiidi. Loetletud antigeene kasutatakse ka erinevates kombinatsioonides immunosorbentide osana ELISA ja immunoblotanalüüsis.

ICG meetod võimaldab kiiresti määrata süüfilise tekitaja treponema spetsiifiliste antikehade sisaldust seerumi- ja täisvereproovides ilma spetsiaalseid laboriseadmeid kasutamata ning seda kasutatakse esmatasandi tervishoiuteenuste osutamisel, sh epidemioloogiliste näidustuste korral.

Kasutuspiirangud: ei saa kasutada ravi efektiivsuse jälgimiseks, võib anda valepositiivse tulemuse.

PBT (lihtsad kiirtestid voodi kõrval)

Suhteliselt hiljuti hakati süüfilise serodiagnostikas välja kujunema suund nn lihtsate kiirtestide (PBT) ehk patsiendi voodi kõrval tehtavate testide (Point-of-care – ROC) väljatöötamiseks. Lihtsad voodiäärsed kiirtestid ehk immunokromatograafilised testid võimaldavad kiirelt määrata süüfilise tekitaja vastaste treponema-spetsiifiliste antikehade sisaldust seerumi- ja täisvereproovides ilma spetsiaalseid laboriseadmeid kasutamata ning kasutada esmatasandi tervishoius, sh. epidemioloogiliste näidustuste jaoks. Kasutuspiirangud: ei saa kasutada ravi efektiivsuse jälgimiseks, võib anda valepositiivse tulemuse.

Need testid põhinevad kahvatu treponema treponemaalsete antigeenide antikehade immunokromatograafilisel tuvastamisel ja tehakse ribadel; sel juhul võib kasutada nii täisverd kui ka seerumit (Herring A., Ballard R. et al, 2006). Testide formaat võimaldab teil läbi viia uuringuid spetsiaalse varustuse puudumisel ja elektrit kasutamata. Kuid suhteliselt madala tundlikkuse ja spetsiifilisuse tõttu ei ole need testid veel leidnud oma laialdast rakendust praktikas.

Immunoblotanalüüs (Western Blot)

Viimastel aastatel on ilmunud uurimismeetodid, mille eesmärk on tuvastada ja analüüsida antikehade sisaldust. iga antigeeni kohta kahvatu treponema eraldi. Üheks selliseks meetodiks on immuunblotanalüüs (või blotting, immunoblot, Western blot), mida kasutatakse kahvatu treponema vastaste IgG või IgM antikehade määramiseks. Immunoblotanalüüsi meetod on ensüümi immuunanalüüsi modifikatsioon - ELISA variant.

Immunoblotanalüüs on üks kaasaegsemaid süüfilise serodiagnostika meetodeid ja seda kasutatakse aktiivselt välismaal. See sai oma nime ("Western blotting") humoorika vastusena DNA tuvastamismeetodite ("Southern Blotting") ja RNA ("Northern Blotting") nimedele.

1. Meetodi ajalugu

Immunoblotimist (Western blot) kasutatakse kahvatu treponema antigeenide IgG või IgM antikehade määramiseks (Herremans M. et al., 2007).

2. Klassikaline immunoblot

Klassikaline immunoblot(Western Blot Analysis) ühendab ensüümi immuunanalüüsi ja elektroforeetilise meetodi kasutamise. Süüfilise põhjustaja valgu antigeenid eraldatakse eelnevalt elektroforeesiga ja viiakse kandjale - nitrotselluloosmembraanile (ribale). Seda ülekandmist nimetatakse blottinguks. Seejärel töödeldakse seda eraldatud punktidega (blotid) kandjat testitava seerumiga ja ensüümide või radioaktiivsete ainetega märgistatud IgG või IgM antikehadega. Meetod hõlmab looduslike või rekombinantsete treponema valkude kasutamist.

elektroforees on laetud ühendite eraldamine nende liikuvuse alusel elektroforeetilises väljas. Kui mõnes keskkonnas rakendatakse potentsiaalide erinevust, liiguvad positiivselt laetud molekulid negatiivselt laetud elektroodi poole ja negatiivselt laetud molekulid positiivse elektroodi poole.

Enamik globulaarseid valke on kokku pandud nii, et enamik laetud rühmi, nimelt hüdrofiilsed rühmad, paiknevad valgu pinnal, laenguta hüdrofoobsed jäägid on aga sukeldatud gloobuli sisse. Elektriväljas migreeruvad valgud vastavalt oma laengule vastupidiselt laetud elektroodi suunas.

Valkude elektroforeetiline eraldamine viiakse läbi polüakrüülamiidil põhinevas sünteetilises geelkeskkonnas. Valkude eraldamiseks nende molekulmassi järgi eelinkubeeritakse valkude segu enne elektroforeesi naatriumdodetsüülsulfaadi (SDS) juuresolekul.

Välisteadlaste Weberi ja Osborni (1969) üksikasjalikud uuringud näitasid, et pärast sellist töötlemist on ainsaks teguriks, mis võib valkude liikuvust polüakrüülamiidgeelis (PAAG) mõjutada, valgu suurus või õigemini selle molekulmass. See võimaldas kasutada SDS-PAGE elektroforeesi meetodit SDS-i juuresolekul valkude ja peptiidide molekulmassi üsna täpseks määramiseks. Väliskirjanduses nimetati seda meetodit SDS-PAGE (naatriumdodetsüülsulfaat-polüakrüülamiidi geelelektroforees).

Reaktiivsuse profiil klassikalises WB testis looduslike antigeenidega (polüakrüülamiidgeelelektroforeesi meetod naatriumdodetsüülsulfaadiga). (1) - kontroll positiivne tulemus, (2) - kontroll negatiivne tulemus, (3-6) - kliinilised proovid.

Selle meetodiga süüfilise testides, mis on eelnevalt puhastatud ja hävitatud selle koostisosadeni, allutatakse kahvatu treponema elektroforeesile polüakrüülamiid- või agaroosgeelis. Samal ajal eraldatakse selle koostises olevad antigeenid molekulmassi järgi.

Seejärel viiakse antigeenid vertikaalse elektroforeesi abil nitrotselluloosi ribale, mis sisaldab nüüd nähtamatut spektrit kahvatule treponeemile iseloomulikke antigeenseid ribasid.

Analüüsi käigus kantakse uuritav materjal (seerum, patsiendi vereplasma jne) nitrotselluloosribale (ribale). Kui proovis on spetsiifilisi antikehi, seostuvad need inkubeerimise käigus tugevalt neile rangelt vastavate (komplementaarsete) antigeensete ribadega ja moodustavad “antigeen-antikeha” kompleksi.

Pärast sidumata immunoglobuliinide eemaldamist riba pesemise käigus järgneb inkubeerimine konjugaadiga - ensüümiga märgistatud inimese immunoglobuliinide antikehad (inimese IgG või IgM antikehad), mille käigus ensüümiga märgistatud antikehad kinnituvad olemasolevale antigeen-antikehale. kompleksid membraani pinnal.

Pärast seondumata konjugaadi eemaldamist substraadi lahusega inkubeerimisel interakteerub ensüüm substraadiga, mille tulemusena tekib värvusreaktsioon - membraani osade värvumine (ribade kujul), kus on kahvatu treponema üksikud antigeenid. asub, mille antikehad olid uuritavas seerumis. Värvimise intensiivsus sõltub seerumist seotud antikehade hulgast. Reaktsiooni tulemust hinnatakse visuaalselt.

Ribade olemasolu nitrotselluloosplaadi teatud piirkondades kinnitab kahvatu treponema rangelt määratletud antigeenide antikehade olemasolu uuritud seerumis.

Selle meetodiga määratud immunodeterminantidel 15, 5, 17, 44,5, 47 kD on süüfilise puhul diagnostiline tähtsus. Ig G immunoblotanalüüs on tundlikkuse ja spetsiifilisuse poolest sarnane absorptsiooniga RIF-iga (RIF abs). Ig M-immunoblotanalüüs võib olla kaasasündinud süüfilise diagnostiline test.

3. Immunoblot lineaarse immuunanalüüsi vormingus

Lineaarne immuunanalüüs (line immunoassay, LIA) võimaldab samaaegselt määrata inimese seerumis või plasmas kahvatu treponema antigeenide vastaseid antikehi. Antigeenid kantakse eelnevalt testribadele (ribadele), mis tarnitakse kaubanduslike diagnostikakomplektide osana.

Ribad on valmistatud nitrotselluloosmembraanist, plastalusega polüamiidmembraanist või plastalusega nailonmembraanist. Tootmise ajal asetatakse testribale mitu eraldiseisvat antigeeni eraldi antigeensete joontena. Lisaks nendele süüfilise antigeenidele kantakse igale rajale veel neli kontrolljoont: streptavidiin ja kontrollid (3+, 1+ ja ± lõikejoon).

Ribade jaoks kasutatakse geenitehnoloogia abil saadud kunstlikke antigeene - rekombinantseid valke või sünteetilisi polüpeptiidi konstruktsioone. Need on kahvatu treponema pinnaantigeenide analoogid - TpN15, TpN17, TpN47 ja TmpA molekulmassiga 15, 17, 47 kDa ja 44,5 (TmpA), kus kDa = kilodaltonid. Nende abiga määratakse patogeeni erinevate immunodominantsete komponentide seerumi antikehad.

Uuritava proovi inkubeerimine toimub küvetis, kuhu asetatakse ka indikaatorriba. T. pallidumi vastased antikehad määratakse testribadele trükitud antigeenidega seondumise teel. Kui proovis on T. pallidum-spetsiifilisi antikehi, moodustavad need sidemed üksikute antigeeniliinidega. Kui testitavas seerumis sisalduvad antikehad interakteeruvad testribale asetatud diskreetsete T. pallidum antigeenidega, moodustub antigeen-antikeha kompleks visuaalselt tuvastatavate värviribade kujul.

Võttes arvesse immunoblotanalüüsi tulemusi, hinnatakse seerumi reaktsioonivõimet iga antigeeni suhtes eraldi. Täielikult positiivne vastus antakse, kui tulemus saadakse samaaegselt kahe või kolme esitatud antigeeniga.

Uurimisprotseduurid viiakse läbi käsitsi või spetsiaalsel analüsaatoril, tulemuste tõlgendamisel kasutatakse spetsiaalset nakkushaiguste arvutiprogrammi.

Tänu rekombinantsete antigeenide kõrgele puhastusastmele ja süüfilise patogeeni kõige immunogeensemate determinantide vastaste antikehade samaaegsele tuvastamisele on meetodil kõrge tundlikkus ja spetsiifilisus.

4. Tulemuste arvestus

Antigeensete ribade värvumise intensiivsuse lugemiseks ribadel on välja töötatud fotomeetrid, mille töö põhineb signaali peegeldumisel, mis välistab subjektiivse hinnangu ja annab potentsiaalse võimaluse automatiseerimiseks.

5. Millistel haigusperioodidel on parem kasutada

Western blot meetodil tehtud testid võivad tuvastada Treponema pallidum'i antigeenide spetsiifilisi antikehi haiguse väga varases staadiumis. Süüfilise diagnoosimisel on kõige olulisemad antikehad kahvatu treponema TpN15, TpN17, TmpA ja TpN47 antigeenide vastu. Need antigeenid on membraanivalgud, mille molekulmass on vastavalt 15, 17, 44,5 ja 47 kDa.

Treponema pallidum'i viimisel inimkehasse tekivad antisüüfilised antikehad sellises järjekorras: esmalt tekib immuunvastus TpN17 antigeenidele, seejärel TpN47, pärast TpN15 ja pärast kogu TmpA. Testitulemuste arvessevõtmisel hinnatakse seerumi reaktsioonivõimet igaühe suhtes eraldi. Näiteks kui lineaarses blotis on reaktiivsus ainult TpN17 ja TpN47 antigeense liini suhtes, tähendab see, et haigus on varases staadiumis. Mida rohkem antigeensed liinid muutuvad reaktiivseks, seda kaugemale infektsioon areneb. Süüfilise ravis muutub selle testi reaktsioonivõime.

IgM määramine valkudele molekulmassiga 15,17, 41, 47 kDa võimaldab tuvastada 29,2% sekundaarse süüfilisega, 12,5% varajase latentse süüfilise ja 8,0% seroresistentse süüfilisega patsientidest. IgG otsimist samade molekulide suhtes iseloomustab tundlikkus 61,6% seroresistentse ja 100% sekundaarse ja varajase latentse süüfilise suhtes.

6. Tundlikkus ja spetsiifilisus

Kirjanduse andmetel on testi tundlikkus ja spetsiifilisus väga kõrged - vastavalt 99,6-100% ja 99,3-99,5%. Klassikalise meetodi puhul saavutatakse see valkude, glüko- ja lipoproteiinide elektroforeetilise eraldamise ning immuunseerumi või monoklonaalsete antikehade tuvastamise maksimaalse spetsiifilisusega. Optimaalsetes tingimustes võib immunoblotanalüüs tuvastada antigeeni koguses, mis on väiksem kui 1 ng testitavas mahus.

Lineaarse bloti tundlikkus on samuti 99,6% ja spetsiifilisus 99,3% ja 99,5% vahel.

Ekspertide sõnul on immunoblotanalüüs rekombinantsete väga spetsiifiliste antigeenidega tundlikkuse ja spetsiifilisuse poolest sarnane RIF abs-ga.

Väliskirjanduse andmetel ja TsNIKVI-s läbiviidud uuringu tulemustel on immunoblotanalüüsi meetod süüfilise diagnoosimisel kõrge tundlikkusega (98,8-100%) ja spetsiifilisusega (97,1-100%).

7. Meetodi ulatus

Immunoblotanalüüs (immunoblot) on väga spetsiifiline ja väga tundlik võrdlusmeetod. Kõrge tundlikkus ja spetsiifilisus võimaldavad seda meetodit pidada süüfilise kinnitava testina. Meetodit saab kasutada nii diagnoosi kinnitamiseks kui ka siis, kui teised treponemaalsed testid annavad küsitavaid ja vastuolulisi tulemusi. Western blot meetod võib diagnoosi kinnitada patsientidel, kellel on positiivsed või ebamäärased testitulemused, sealhulgas need, mis on saadud TPHA või ELISA abil.

8. Lavastusvigade, valepositiivsete ja valenegatiivuste allikad ja põhjused

Valepositiivseid tulemusi on väga harva. Valenegatiivsed tulemused on samuti üsna haruldased ja neid täheldatakse immuunpuudulikkusega patsientidel - sagedamini HIV-nakkusega inimestel ja diagnostilise "akna" mõjuga antikehade sünteesi hilinemise tõttu, samuti staadiumis esinevate vigade tõttu.

Kaasaegsete katsesüsteemide kasutamine dikteerib kõigi nõuete täpse järgimise nii materjalile kui ka reaktsiooni toimimisele. Põhimõtteliselt on vigade allikaks uuringu järjekorra ja tehnoloogia rikkumine (eriti klassikalise Western blot puhul), testikomplektide tootjate soovituste mittejärgimine. . Vigu võib teha ka vereseerumi proovide kogumisel, kohaletoimetamisel, säilitamisel, samuti analüüside tegemisel. Lisaks määrdunud proovidele on muudeks võimalikeks põhjusteks aegunud testikomplektide kasutamine ja vead testitulemuste analüüsimisel.

9. Omadused, eelised ja puudused

Immunobloti unikaalsus seisneb selle kõrges infosisalduses ja tulemuste usaldusväärsuses.

Test ei vaja kõrgelt puhastatud antigeene, võrdlus- ja kontrollseerumeid. Antikeha sihtmärgi tuvastamine põhineb valgu molekulmassil, millega patsiendi seerumist pärinevad antikehad reageerivad. Ühes reaktsioonis saab tuvastada antikehade seondumise mitme antigeeniga, millest igaüks saab täpselt iseloomustada. Tänu sellele on immunoblotimisel mitmeid eeliseid võrreldes teiste antikehade tuvastamise meetoditega, mille tulemused sõltuvad standardiseeritusest, tundlikkusest, substraadi kvaliteedist, teatud antigeenide ebastabiilsusest või lahustumatusest.

Meetod on kergesti reprodutseeritav, suhteliselt lihtne teostada ja tulemusi tõlgendada, võimaldab määrata korraga mitme T. pallidum'i antigeeni vastaste antikehade spektri ning hinnata erineva spetsiifilisusega antikehade panust kogu reaktsioonisse.

Kõrge puhtusega rekombinantsete ja peptiidsete antigeenide kasutamine vähendab seerumite mittespetsiifilist reaktsioonivõimet. Meetodi kasutamine võimaldab vältida uurijale ohtlikke aeganõudvaid ja subjektiivseid meetodeid (G. pallidum'i tüvede siirdamine, töö patogeense T. pallidum'iga reaktsiooni formuleerimisel). See määrab süüfilise diagnoosimisel immunoblotanalüüsi meetodi eelistamise teistele treponemaalsetele testidele (RIF ja eriti RIBT).

10. Meetodi modifikatsioonid

Sellel meetodil põhinevad mitmed kaubanduslikud testimissüsteemid. Mõned neist on vormingus western blot, koosnevad ribadest, millele kantakse üle T. pallidumi valgukomponendid, mis on eelnevalt polüakrüülamiidgeelelektroforeesiga eraldatud.

Teised on vormingus lineaarne blot, koosnevad ribadest, millele on adsorbeeritud rekombinantsed ja sünteetilised polüpeptiidid diskreetsete joontena – T. pallidum, TpN15, TpN17, TpN47 ja TmpA pinnaantigeenide analoogid.

Western blot'i tulemusi on raskem tõlgendada, kuna ribadel on palju erinevaid antikehi, millest paljud on rühmaspetsiifilised. Seevastu lineaarse blotanalüüsi tulemuste tõlgendamine on lihtne; lisaks võimaldavad ribale trükitud täiendavad kontrolljooned T. pallidum nelja antigeeni vastaste antikehade taseme poolkvantitatiivset hindamist.

xMAP tehnoloogia

xMAP on tipptehnoloogia, mis võimaldab teha mitmeparameetrilisi uuringuid, tuvastades samaaegselt mitu analüüti ühest bioloogilisest proovist. Tahke faasina kasutatakse värvilisi mikrosfääre, mis on kaetud püüdmisreagentidega (oligonukleotiidid, antikehad, antigeenid).

Uuritav proov lisatakse mikrosfääre sisaldavale lahusele. Proovis tuvastatud analüüdid seotakse vastava mikrosfääri külge, misjärel lisatakse lahusele tuvastav aine (tuvastusantikehad, fluorestseeruv märgis). Analüüsitava analüüdi tuvastamiseks kasutatakse kahest laserist koosnevat süsteemi, mis võimaldab nii kvalitatiivselt hinnata analüüdi olemasolu proovis (selleks kasutatakse punast laserit, mis klassifitseerib mikrosfääre värvi järgi) kui ka kvantitatiivset hindamist. analüüdi sisaldus proovis (selleks kasutatakse rohelist laserit).

Uuring viiakse läbi automaatselt tarkvaraga varustatud analüsaatoritega nagu Bio-Plex 200 (bio-rad), Bio-Plex2200 (bio-rad), Luminex100 (luminex), Luminex200 (luminex).

xMAP tehnoloogia jõudlus ületab oluliselt klassikalise ensüümiga seotud immunosorbentanalüüsi (ELISA) jõudlust oluliselt väiksema biomaterjali kogusega.

xMAP-tehnoloogiat, millel on kõrge analüütiline tundlikkus, kasutatakse praegu paljude kliiniliste probleemide lahendamiseks. Tema abiga tehakse ühes bioloogilise materjali proovis samaaegselt teadaolevate onkomarkerite, südamemarkerite, ägeda faasi ja suhkurtõve markerite, paljude tsütokiinide, kemokiinide ja kasvufaktorite tuvastamine. Mitme analüüdi samaaegne tuvastamine ühest bioloogilisest proovist võib oluliselt vähendada patsiendi uurimise aega. Praeguseks on välja töötatud mitmeid testsüsteeme STI patogeenide, eelkõige süüfilise infektsiooni antikehade tuvastamiseks xMAP-meetodi abil.

"Samotechnayal"
Vastuvõtt kokkuleppel! Laupäev pühapäev.

Süüfilis on spiroheedi Treponema pallidum põhjustatud nakkushaigus, mis on kalduvus progresseeruvale kroonilisele kulgemisele ja millel on selge kliiniliste sümptomite perioodilisus.

Seksuaalse leviku ülekaal kontakt- ja transplatsentaalsest levikust põhjustab selle haiguse mitmete sugulisel teel levivate haiguste (STD-d, STI-d). Lisaks nendele nakkuse leviku meetoditele mängib erilist rolli kunstlik tee (ladina keelest "artificio" - kunstlikult loodud).

See on tüüpiline meditsiiniasutustele, peamiselt haiglatingimustes. Nakatumine toimub vereülekannete, erinevate kirurgiliste operatsioonide, invasiivsete diagnostikameetodite ajal.

Vaatamata doonorivere karantiinile on süüfilise tuvastamise probleem doonoritel haiguse erinevates staadiumides endiselt aktuaalne.

Seetõttu nõuavad süüfilise diagnostilised meetmed standardiseerimist, uute tundlike ja informatiivsete identifitseerimismeetodite kasutuselevõttu, samuti vigade minimeerimist ja analüüsitulemuste väärtõlgendamist.

Näita kõike

1. Laboratoorsete diagnostikameetodite klassifikatsioon

Süüfilise diagnoosimisel on mõned tunnused ja see erineb teiste bakteriaalsete infektsioonide diagnoosimisest. Kahvatu treponema keeruline struktuur ja antigeensed omadused põhjustavad seroloogiliste testide tulemuste tõlgendamisel vigu.

Süüfilise vereanalüüsi pakutakse kolmele põhirühmale:

1. 1 Rahvastikurühmade sõeluuring ja profülaktiline arstlik läbivaatus (sealhulgas rasedus, sünnituseelses kliinikus registreerimine, töötamine ja meditsiiniraamatu registreerimine jne).
2. 2 Sõeluuring riskirühmades (kaitsmata seks süüfilisega nakatunud isikuga, pealesunnitud seksuaalvahekord, HIV-nakkusega jne).
3. 3 Isikud, kellel on süüfilise infektsiooni sümptomid või kahtlus.

Kõik laboratoorsed meetodid jagunevad tinglikult otsesteks ja kaudseteks.

1.1. Otsesed meetodid

1. 1 Treponema pallidum'i tuvastamine pimedas väljas (tumevälja mikroskoopia).
2. 2 Katseloomade nakatumine (kasvatamine laboriloomadel).
3. 3 PCR (polümeraasi ahelreaktsioon).
4. 4 DNA sond või nukleiinhappe hübridisatsioon.

1.2. Kaudsed meetodid

Seroloogilised reaktsioonid on laboratoorsed diagnostikameetodid, mis põhinevad kahvatu treponema (lühendatult AG) antigeenide antikehade (lühendatult AT) tuvastamisel. Need on diagnoosi kinnitamiseks hädavajalikud.

1. 1 Mitte-treponemaalsed testid:
   • Wassermani reaktsioon (RSK);
   • mikrosadestamisreaktsioon (MR, RMP) ja selle analoogid, mis on toodud allpool;
   • Plasma kiirreagiini test (RPR, RPR);
   • Test punase toluidiini ja seerumiga (TRUST);
   • Sugulisel teel levivate haiguste uurimise labori mittetreponemaalne test - VDRL.
2. 2 Treponemaalset testi:
   • Treponema pallidum'i immobiliseerimise R-mine - RIBT / RIT;
   • Immunofluorestsentsi R-sioon - RIF, FTA (seerumite RIF-10, RIF-200, RIF-abs lahjendamine);
   • Passiivse hemaglutinatsiooni R-sioon (RPHA, TRPGA, TPHA);
   • ELISA (ELISA, EIA);
   • Immunoblotanalüüs.



Joonis 1 – süüfilise serodiagnostika algoritm

1.3. Histomorfoloogilised meetodid

Need meetodid on taandatud süüfilise ilmingute histomorfoloogia tunnuste tuvastamisele. Tähelepanu pööratakse kõva šankri struktuuri peensustele. Nakkuse diferentsiaaldiagnostika histoloogia abil on aga väga raske. Histomorfoloogiat kasutatakse koos teiste laboratoorsete ja kliiniliste testidega.

2. Treponema pallidum'i tumevälja mikroskoopia

See meetod põhineb kahvatu treponema otsesel tuvastamisel uuritavas materjalis mikroskoobi ja spetsiaalsete seadmete abil (enamasti erosioonide ja haavandite, harvemini tserebrospinaalvedeliku ja muude substraatide väljajuhtimine).

Skarifikatsiooni, kraapimise, erosioonidest ja haavandilistest defektidest pigistamise abil saadakse eksudaat, seejärel uuritakse valmistatud preparaati mikroskoobi all.

Tavaliselt tuvastatakse kahvatud treponeemid šankrist saadud preparaadis, sekundaarse värske, sekundaarse korduva süüfilise fookustest, samuti lümfisõlmede punktidest, platsentast.

Tuginedes väikeste osakeste hõõgumisele pimedas väljas valguskiire tabamisel (Tyndalli nähtus), võimaldab see meetod suurepäraselt eristada süüfilise põhjustajat teistest treponeemidest, võttes aluseks morfoloogilised erinevused ja viiside erinevused. bakter liigub.

Mikroskoopia jaoks kasutatakse spetsiaalset sobiva optilise eraldusvõimega tumevälja kondensaatorit. Ravim saadakse purustatud tilga meetodil (tilk materjali kantakse puhtale rasvavabale slaidile ja kaetakse väga õhukese katteklaasiga).

Sukeldusõli tilgutatakse katteklaasile. Toru ja suurendusläätse keerates reguleeritakse soovitud valgustust.

Mikroskoobi pimedas väljas tuvastatakse vererakud, epiteelirakud ja süüfilise tekitaja. Kahvatu treponema näeb välja nagu spiraal, väga õhuke, kiirgab hõbedast värvi, sujuvate liigutustega.



Joonis 2 – Tumevälja mikroskoopia kui viis kahvatu treponema visualiseerimiseks uuritavas materjalis. Pildi allikas - CDC

Treponema pallidum tuleb eristada teistest treponeemidest, sealhulgas Tr. refringens, mida võib leida orofarünksist ja suguelundite limaskestast. See bakter teeb kaootilisi liigutusi, tal on laiad ja asümmeetrilised, üsna jämedad lokid. Lisaks eristatakse Treponema pallidum Tr. Microdentium, Tr. Buccalis ja Tr. vincenti.

Bakterite visualiseerimist pimedas väljas täiendab mõnikord fluorestsentsreaktsioon. Selleks lisatakse natiivsele materjalile fluorestseeruva värviga märgistatud antitreponemaalsed antikehad. See moodustab kompleksi nimega antigeen-antikeha (lühendatult AG-AT), mida uuritakse fluorestsentsmikroskoobi abil.

3. Polümeraasi ahelreaktsiooni (PCR) meetod

PCR, mis töötati välja 1991. aastal Treponema pallidum'i desoksüribonukleiinhappe (DNA) molekuli tuvastamiseks, on väga tundlik ja spetsiifiline, võimaldades tuvastada patogeeni DNA fragmente.

See analüüs põhineb spirochete pallidum DNA lühikeste lõikude kopeerimisel, mis vastavad kindlaksmääratud parameetritele ja sisalduvad proovis. Kõik see toimub kunstlikes tingimustes (in vitro). Reaktsioon viiakse läbi seadmes - võimendis, mis tagab temperatuuritsüklite periodiseerimise. Toimub jahutamine, millele järgneb katseklaaside kuumutamine veaga 0,1˚С.

DNA matriitsi kuumutatakse 2 minutit temperatuuril 92-98 °C (kasutatakse maksimaalset temperatuuri, kui polümeraas on termostabiilne). Kuumutamisel lahknevad DNA ahelad nendevaheliste vesiniksidemete lagunemise tõttu. Anniilimisetapis alandatakse reaktsiooni temperatuuri, et siduda praimer üheahelalise matriitsiga.

Lõõmutamine võtab aega umbes 30 sekundit, mille jooksul sünteesitakse sadu nukleotiide. Polümeraas kopeerib äsja sünteesitud molekule, mille tulemusena suurenevad desoksüribonukleiinhappe spetsiifilised fragmendid mitu korda. Järgnev fragmentide tuvastamine viiakse läbi agargeelelektroforeesi abil.

Süüfilise PCR-diagnostika on oma olemuselt veel eksperimentaalne, kuid see on põhjendatud kaasasündinud infektsiooni tuvastamisel, rasketel diagnostilistel juhtudel või minimaalse kahvatu treponeemi sisaldusega uuritavas materjalis.

4. DNA hübridisatsioon

DNA hübridisatsioon viiakse läbi in vitro ja see põhineb kahe üheahelalise DNA molekuli täielikul või osalisel ühendamisel üheks molekuliks. Komplementaarsete fragmentide täieliku kokkulangevuse korral on liit lihtne. Kui komplementaarne sobivus on osaline, toimub DNA ahelate seos aeglaselt. Ahela sulandumise aja põhjal saab hinnata komplementaarsuse astet.

Kui DNA-d kuumutatakse puhverlahuses, lõhuvad vesiniksidemed komplementaarsete lämmastikualustega, mille tulemusena DNA ahelad lahknevad. Järgmisena saadakse preparaat kahest denatureeritud desoksüribonukleiinhappest. Jahtumisel üheahelalised piirkonnad renatureerivad. Tekib nn DNA hübriid.

Meetod võimaldab hinnata ja analüüsida anniilimiskiirust, võttes arvesse DNA tunnuseid (sarnasusi ja erinevusi) liikide vahel või liigisiseselt.

DNA-sondi kasutamine seisneb märgistatud DNA fragmendi hübridiseerimises spetsiifilise DNA piirkonnaga, et tuvastada komplementaarsed nukleotiidjärjestused. Sondi märgistamiseks kasutatakse küllastumata aatomite (kromofooride) või radioaktiivsete isotoopide rühma.

DNA sondi kasutatakse nukleiinhapete heterogeenseks ja homogeenseks tuvastamiseks. Sondi ülesanne on määrata kindlaks piirkonnad, kus siht-sondi ühinemine on toimunud. Homogeenses süsteemis tuvastamise eeliseks on see, et on võimalik jälgida DNA molekulide hübridiseerumist reaalajas.

Meetodi olemus taandub DNA denaturatsioonile ja renaturatsioonile (DNA ahelate taasühendamine). Nukleiinhappe ja DNA sondi renaturatsiooniprotsess lõpeb "hübriidi" moodustumisega.

Spetsiifilised nukleiinhappejärjestused hübridiseeruvad DNA sondiga ja tuvastatakse seega ning võimaldavad hinnata DNA kogust testitavas materjalis.

5. Laboriloomade nakatumine

Küülikute kõrge tundlikkus Treponema pallidumi suhtes (umbes 99,9%) võimaldab neid kasutada süüfilise infektsiooni diagnoosimisel.

Küülikute nakatamine toimub uurimiskeskustes ja see on "kuldstandard" muude meetodite tundlikkuse hindamisel.

Pöördume tagasi treponemaalsete ja mittetreponemaalsete testide juurde, kuna neid kasutatakse kõige sagedamini. Mõelge nende eelistele ja puudustele, samuti tulemuste tõlgendamise vigadele.

6. Mittetreponemaalsed testid

Need on testid standardiseeritud kardiolipiini antigeeni IgG ja IgM antikehade määramiseks. Nende oluline puudus on suhteliselt madal spetsiifilisus.

Madalad kulud ja lihtsus võimaldavad neid teste klassifitseerida sõeldiagnostilisteks testideks, mis on vajalikud esialgse diagnoosi seadmiseks ja elanikkonna sõeluuringuks.

Just mittetreponemaalsed testid antakse arstiraamatu registreerimisel, tööle kandideerimisel, sünnituseelses kliinikus registreerimisel.

Puudused:

1. 1 Minimaalne tundlikkus esmase süüfilise staadiumis - 70%;
2. 2 Minimaalne tundlikkus hilise süüfilise staadiumis - 30%;
3. 3 Valenegatiivsete ja valepositiivsete tulemuste võimalus;
4. 4 RSC rakendamise keerukus.

Eelised:

1. 1 Suhteliselt madalad katsetootmise kulud;
2. 2 Hankige kiire vastus;
3. 3 Võimalus neid sõeluuringuks rakendada.

Valepositiivsete või nõrgalt positiivsete proovide saamine on võimalik järgmistel juhtudel:

1. 1 Täitmistehnoloogia rikkumine AG-AT kompleksi blokeerimisel.
2. 2 Patsiendil on autoimmuunhaigused (reumatoidartriit, reuma, sklerodermia, süsteemne erütematoosluupus, sarkoidoos jne).
3. 3 Pahaloomulised kasvajad.
4. 4 Viiruslikud ja bakteriaalsed infektsioonid.
5. 5 Endokriinsed haigused (autoimmuunne türeoidiit, suhkurtõbi).
6. 6 Rasedus.
7. 7 Alkoholi joomine.
8. 8 Rasvaste toitude söömine.
9. 9 vanadus.

Nagu loendist näete, on vale tulemuse jaoks piisavalt põhjuseid. Seetõttu tuleks sellesse suhtuda väga ettevaatlikult. Vaatleme koos RSC-ga veel kahte näidist. See on mikrosadestamise reaktsioon ja VDLR (selle modifikatsioon).

7. Komplemendi fikseerimise reaktsioon (RSK, Wasserman, RW)

See on test, mis põhineb komplemendi võimel seonduda AG-AT kompleksidega. Saadud kompleks tuvastatakse hemolüütilise süsteemi abil. Kardiolipiini antigeen suurendab oluliselt proovi tundlikkust.

Tundlik on Colmeri reaktsioon, mis seisneb erinevatel temperatuuritingimustel toimimises. Seega kulgeb Colmeri reaktsiooni esimene faas temperatuuril 20˚С pool tundi, teine ​​faas temperatuuril 4-8˚С 20 tundi. Selle aja jooksul toimub komplemendi sidumine.

RSK teostamisel on võimalik saada teravalt positiivseid tulemusi. Põhjuseks on ilmselt suur antikehade tiiter lahjendamata seerumis. Sel juhul asetatakse proovid vähenevate annustega.

Süüfilise staadiumite eristamiseks ja antisüüfilise ravi efektiivsuse hindamiseks määratakse antikehade hulk seerumis.

Proovi positiivsust hinnatakse ristide abil, samuti on Wassermani, Colmeri ja Canni reaktsioonide puhul näidatud seerumi lahjendus.

8. Mikrosadestamise reaktsioon

Kuna ülaltoodud testide teostamise keerukus on suur, on erinevate elanikkonnarühmade arstliku läbivaatuse ulatuseks välja töötatud süüfilise serodiagnostika kiirendatud meetod, nn ekspressmeetod, mikrosadestamise reaktsioon (lühendatult MR, RMP). .

See viiakse läbi kardiolipiini antigeeni ja abiainetega. Selle eeliseks on perifeerse vere kogumine uurimistööks. See kiirendab oluliselt nii tehnikat ennast kui ka laborantide tööd.



Joonis 2 – mikrosadestamise reaktsioon (skeem)

MR jaoks on vaja patsiendi plasmat või inaktiveeritud seerumit (need sisaldavad antikehi). Järgmisena asetatakse plasma märgitud süvenditesse. Seejärel lisatakse uuritavale materjalile tilk kardiolipiini antigeeni, segatakse ja loksutatakse. Selle tulemusena ilmuvad nakatunud inimese seerumis iseloomulikud helbed, mille intensiivsus on erinev.

See on kvaliteeditest. Kvantifitseerimisel kasutatakse 10 seerumi lahjendust, mis asetatakse 10 sobivalt märgistatud süvendisse. Kvalitatiivse MR puhul näidatakse vastust ristide (plusside) või miinusena, kvantitatiivse MR puhul näidatakse antikeha tiiter (1:2, 1:4 jne).

Helveste olemasolu loetakse positiivseks või nõrgalt positiivseks vastuseks. Flokulaadi ilmumine on võimalik ka haiguse puudumisel, seetõttu hinnatakse saadud tulemust lõplikult pärast kontrolluuringut või muid reaktsioone (RIBT, RIF, ELISA, RPHA).

9. VDR

Maailma Terviseorganisatsiooni soovitatud meetodit lipoidse antigeeniga (AH) reaktsiooni tekitamiseks peetakse teiste standardsete mittetreponemaalsete testide seas õigustatult parimaks. Välja töötatud USA-s, Gruusias suguhaiguste laboris (Veneral Diseases Research Laboratories).

Valimi nimeks oli asutuse lühend - VDRL. VDRL on MP modifikatsioon. Süüfilisega patsiendi seerum inaktiveeritakse ja asetatakse slaidile. Kasutatav antigeen koosneb erinevas protsendis kardiolipiinist, kolesteroolist ja letsitiinist. Vastus registreeritakse peaaegu kohe.

Antikehade olemasolul seerumis ilmneb selge flokulatsioon. Seerum muutub reaktiivseks 4 nädalat pärast nakatumist. Antikehade hulga hindamiseks lahjendatakse seerumit eksponentsiaalselt.

VDR eelised:

1. 1 suhteliselt kõrge tundlikkus;
2. 2 suhteliselt kõrge spetsiifilisus;
3. 3 rakendamise lihtsus;
4. 4 reaktiivide madal hind;
5. 5 saate kiire vastuse.

VDRL-i puuduseks on suhteliselt kõrge valepositiivsete tulemuste määr.

Nende põhjused on kõik samad eespool loetletud haigused.

Treponema testid tehakse spetsiifiliste Treponema pallidum antigeenidega. Need on lõpliku diagnoosi seadmiseks vajalikud ja kohustuslikud. See on immunofluorestsentsreaktsioon (RIF), kaudne hemaglutinatsioonireaktsioon (IPHA), ensüümi immunoanalüüs (ELISA) jne.

Pärast mittetreponemaalse testi (RPR, MP, VDRL) positiivset tulemust tuleks alati teha treponemaalsed testid (sagedamini kombinatsioon - RPHA, ELISA, RIF).

Treponemaalseid teste on raskem teha kui kiirteste ja need maksavad rohkem raha.

10. RIF

Seda reaktsiooni (lühendatult RIF) kasutatakse süüfilise, sealhulgas varjatud vormide diagnoosimiseks ning positiivsete ja valepositiivsete proovide uuesti kontrollimiseks.

RIF põhineb märgistatud antikehade säral, kui need on kombineeritud antigeeni-antikeha kompleksiga kvartslambi all. Meetodit hakati kasutama 60ndatel ja seda eristas selle rakendamise lihtsus ja kõrge spetsiifilisus (mis on veidi madalam kui RIBT).

Sellel on mitu modifikatsiooni: RIF-10, RIF-200 ja RIF-abs.

Lahjenduses on kõige tundlikum RIF 10 korda ja ülejäänud on spetsiifilisemad. RIF viiakse läbi kahes etapis. AG-le lisatakse patsiendi vereseerum. Moodustub AG-AT kompleks, mida uuritakse järgmises faasis. Fluorokroomiga märgistatud kompleks tuvastatakse seejärel mikroskoopia abil. Kui sära ei täheldata, näitab see spetsiifiliste antikehade puudumist vereseerumis.

RIF-200 on kõigist lahjendustest kõige väärtuslikum. Meetod on mõeldud süüfilise erinevate vormide, eriti latentse süüfilise diagnoosimiseks ja positiivsete proovide uuesti kontrollimiseks.

11. RIBT

Treponema pallidum immobilisatsioonireaktsioon (lühendatult RIBT, RIT) on üks keerukatest seroloogilistest testidest, mis nõuab märkimisväärseid jõupingutusi ja rahalisi kulutusi. RIBT-i kasutatakse üha vähem, kuid selle tähtsus latentse süüfilise diagnoosimisel säilib.

Sellel on suur tähtsus valepositiivsete tulemuste äratundmisel rasedatel ja see põhineb bakterite immobiliseerimisel immobilisiinide – hiliste antikehade – juuresolekul.

Tulemust hinnatakse immobiliseeritud treponema protsendi (%) järgi spetsiaalse tabeli abil:

1. 1 0 kuni 20 – test negatiivne.
2. 2 21 kuni 50 – nõrgalt positiivne test.
3. 3 50 kuni 100 - positiivne reaktsioon.

RIBT puhul on võimalikud ka valepositiivsed tulemused. Seega on vale vastus võimalik troopilise trepanema nakatumise, aga ka tuberkuloosi, maksatsirroosi, sarkoidoosi ja seniilsete patsientide puhul.

12. RPGA

Seda süüfilise vereanalüüsi nimetatakse passiivseks hemaglutinatsiooni testiks (lühendatult vereks TPHA, TPHA).

TPHA antigeen valmistatakse jäära erütrotsüütidest, mis on kaetud kahvatute treponeemide fragmentidega (saadud nakatunud küülikutelt (vt joonis 4)). Analüüsiks kasutatakse patsiendi venoosset verd (plasma või inaktiveeritud seerum).

Antigeeni lisamisel süüfilisega patsiendi seerumis moodustub AG-AT kompleks, mis viib punaste vereliblede aglutinatsioonini. aglutinatsiooni määrab laborant subjektiivselt.



Joonis 3 – RPHA skeem (passiivne hemaglutinatsioonireaktsioon)

Proov hinnatakse positiivseks, kui ilmnevad ühtlase roosa värvusega aglutinaadid. Sademe punane värvus näitab erütrotsüütide ladestumist. RPHA on väga tundlik ja väga spetsiifiline.

12.1. Mikrohemaglutinatsiooni reaktsioon

See on RPGA lihtsustatud versioon. Erineb ülalkirjeldatud proovist selle poolest, et reaktsiooni läbiviimiseks on vähem antigeeni, lahjendit ja vereseerumit. Proovi saab hinnata 4 tundi pärast seerumi inkubeerimist. Seda kasutatakse süüfilise sõeluuringutes ja massiuuringutes.

13. Ensüümi immuunanalüüs

Ensüümiga seotud immunosorbentanalüüs (lühendatult ELISA) põhineb spetsiifilisel antigeeni-antikeha reaktsioonil. Süvenditesse sisestatakse bioloogiline materjal (patsiendi vereseerum, tserebrospinaalvedelik), mille tahkele pinnale on fikseeritud kahvatu treponema antigeenid. Uuritavat materjali inkubeeritakse, seejärel pestakse ära antigeenidega seondunud antikehad (vt joonis 5).

Saadud kompleksi identifitseerimine viiakse läbi fermentatsioonifaasis, kasutades ensüümiga märgistatud immuunseerumit. Keemilise reaktsiooni käigus värvib ensüüm tekkivad kompleksid. Värvimise intensiivsus sõltub spetsiifiliste antikehade hulgast patsiendi veres ja registreeritakse spektrofotomeetriga.



Joonis 4 – ELISA (ensümaatiline immunoanalüüs) skeem

ELISA tundlikkus on üle 95%. Meetodit kasutatakse automatiseeritud režiimis määratud elanikkonnarühmade (doonorite, rasedate ja teiste) uurimiseks, diagnoosi täpsustamiseks positiivsete ja valepositiivsete mittetreponemaalsete testide korral.

14. Immunoblotanalüüs

Immunoblotanalüüs on väga tundlik meetod, lihtsa ELISA modifikatsioon. Reaktsioon põhineb elektroforeesil kahvatu treponema antigeenide eraldamisega.

Eraldatud immunodeterminandid kantakse nitrotselluloospaberile ja näidatakse ELISA-s. Seejärel seerumit inkubeeritakse ja seondumata antikehad pestakse maha. Saadud materjali töödeldakse ensüümiga märgistatud immunoglobuliinidega (IgM või IgG).

15. Süüfilise laboratoorse diagnoosimise tulemuste kliiniline hindamine

Allolevas tabelis 1 oleme esitanud analüüside võimalikud tulemused ja nende tõlgenduse. Nagu tabelist näha, on dešifreerimisel peamine väärtus testide igakülgne hindamine.



Tabel 1 – seroloogiliste reaktsioonide tulemuste dešifreerimine (süüfilise vereanalüüsid). Vaatamiseks klõpsake tabelil

Testide reaktsioonivõimet hinnatakse ka "ristidega":

1. 1 Maksimaalne vastus (tugevalt positiivne test) on tähistatud 4 ristiga.
2. 2 Positiivset proovi tähistatakse 3 ristiga.
3. 3 Nõrgalt positiivset reaktsiooni tähistab kaks risti.
4. 4 Üks rist näitab kahtlast ja negatiivset tulemust.
5. 5 Eitav vastus on märgitud miinusmärgiga.

Süüfilise laboratoorse diagnoosi optimeerimise probleem ei ole tänaseni oma tähtsust kaotanud. Kaasaegsed diagnostikameetodid nõuavad hoolimata teadlaste soovist viia diagnostika võimalikult kõrge tundlikkuse ja spetsiifilisuseni kontrollkontrolli ja individuaalset lähenemist.

Süüfilise infektsiooni tunnuseks on seroresistentsuse nähtus, mis pole saanud teaduslikku selgitust. Diagnoos tehakse pärast patsiendi täielikku uurimist epidemioloogiliste, kliiniliste, laboratoorsete meetoditega.

Meditsiini majandusliku ja tehnilise arengu taustal on edusamme ka süüfilise diagnoosimise uute kriteeriumide väljatöötamisel. Kõik see võimaldab teil patsiente kiiresti, edukalt ja täpselt ravida.

Nüüd kasutatakse RPGA läbiviimiseks standardiseeritud testikomplekte.

Neil on kõik, mida vajate analüüsiks:

• Viaal erütrotsüütidega, mille pinnal on Nicholsi tüve kahvatu treponema antigeene.
• Sama mahutavus, kuid "puhaste" punaste verelibledega (vajalik kontrolli jaoks).
• Puhverlahus patsiendi seerumi lahjendamiseks (allpool selgitame, miks seda tehakse).
• Kontrollina (K+) kasutatakse ka teadaolevalt süüfilist põdeva inimese seerumit.
• Teadaoleva terve inimese seerum (K–).
• Nummerdatud süvenditega plastplaat proovide segamiseks ja tulemuste hindamiseks.

Iga testikomplekt sisaldab reaktiive teatud arvu proovide seadistamiseks. Tavaliselt - 100. Seetõttu säilitatakse mõnikord seerumit, kuni kogutakse vajalik arv proove uuringuteks.

RPGA analüüsi tehnika

Passiivse hemaglutinatsiooni test võib anda kahte tüüpi tulemusi:

• Kvalitatiivne. Annab vastuse küsimusele, kas uuritavas proovis on patogeeni vastaseid antikehi.
• Kvantitatiivne. Võimaldab hinnata immunoglobuliinide sünteesi intensiivsust ja seeläbi jälgida infektsiooni aktiivsust.

Reeglina viiakse esmalt läbi kvalitatiivne hindamine ja kvantitatiivseteks uuringuteks valitakse positiivsed proovid.

Nakkuse lihtsa tuvastamise algoritm on järgmine:

• Plaadi süvenditesse lisatakse võrdsed annused uuritavaid proove. Patsiendi kohta eraldatakse kuuest kaevust koosnev rida.
• Esimeses kahes tilgas tema plasma lahjendati puhvriga 1:20.
• Järgmine paar toimib kontrollina, sellesse asetatakse seerum K +. Ja veel kaks kaevu materjali K– jaoks.
• Seejärel lisatakse iga paari esimesse süvendisse antigeeniga märgistatud erütrotsüüdid. Teises - erütrotsüüdid on puhtad.
• Tabletti loksutatakse mõnda aega, et reaktiivid põhjalikult seguneks, ja jäetakse üksi. Minimaalne aeg on 45 minutit. See võib kesta terve öö.

Tulemusi hinnatakse visuaalselt. Kui reaktsioon on negatiivne, settivad erütrotsüüdid sfäärilise kaevu põhja.

See peaks toimuma nii süvendites, mis sisaldavad patsiendi proove, kui ka sinna, kuhu on lisatud puhtaid testimissüsteemi kontroll-RBC-sid.

Positiivse tulemuse korral ei kogune erütrotsüüdid ühte kohta, vaid jaotuvad ühtlaselt kogu kaevu põhjas. Sarnane pilt peaks olema siis, kui standardantigeeniga märgistatud erütrotsüüdid segatakse patsiendi proovi ja K + seerumiga. Seega kontrollitakse reaktsiooni, mis väldib valetulemusi.

RPHA kvantifitseerimine

Positiivse tulemusega proovid võetakse ja lahjendatakse mitu korda puhverlahusega (tiitritakse). Enne iga lahjendamist tilgutatakse seerum tableti vastavasse süvendisse ja selle kohale märgitakse kogu lahjendusaste. Seejärel lisatakse proovidele erütrotsüüdid koos treponema antigeeniga ja tehakse kindlaks, millise tiitri juures positiivne tulemus ikkagi märgitakse. See on süüfilise RPGA kvantitatiivne vereanalüüs, see näitab patogeeni antikehade kontsentratsiooni.

Tulemusi hinnatakse järgmiselt:

• 4+ tähendab, et erütrotsüüdid vooderdavad kaevu põhja ühtlase kihiga. Kortsus serva ilmumine viitab antikehade kõrgele kontsentratsioonile uuritavas proovis. Reaktsioon on positiivne.
• 3+ seatakse siis, kui ring on selge, kuid osa erütrotsüüte "voolab" keskele. Pilt meenutab pikendatud vihmavarju, seda peetakse positiivseks reaktsiooniks.

• 2+ näeb välja nagu lai rõngas, mille keskel on kalduvus tühjeneda. Nõrgalt positiivne.
• 1+ tähendab kahtlast tulemust. Aukus on kitsas rõngas. Vajab kordamist 1-2 nädala pärast.
• Negatiivse analüüsi korral moodustavad punased verelibled augu keskel nupu.

Siiski on seroresistentseid süüfilise juhtumeid, mille puhul tundub, et haigus on kadunud ja antikehad püsivad pikka aega. Seetõttu nõuab RPGA mõnikord kinnitust muude meetoditega.

Kui peate läbima RPHA ja läbima süüfilise kontrolli, võtke ühendust pädevate venereoloogidega.

RPHA analüüs on meetod, mis on teiste vereanalüüside seas üks olulisemaid. Selle abil saate kindlaks teha ebameeldivate soole-nakkuslike haiguste arengu. Kuid sageli kasutatakse analüüsi süüfilise tuvastamiseks. Uuringul on kõrge täpsus ja usaldusväärsus.

RPHA tähistab passiivset hemaglutinatsiooni reaktsiooni.

RPHA põhineb erütrotsüütide aglutinatsiooni fenomenil, mille puhul süüfilisehaige vereseerumi lisamisel pinnale adsorbeeritakse antigeenid - RPHA reagendid.

Pärast süüfilisega nakatunud inimese seerumi kombineerimist RPHA reagendiga toimub erütrotsüütide aglutinatsioon (kinnitus või liimimine) ja need sadestuvad. Adhesiooniaste sõltub otseselt antikehade kogunemisest ja tihedusest vereseerumis, seetõttu aitab RPGA mitte ainult tuvastada antikehade olemasolu, vaid ka tuvastada nende arvu.

Tulemus jaguneb primaarseks ja sekundaarseks infektsiooniks, mis väljendub erinevate antikehade manifestatsioonis. Primaarses aktiveeritakse IgM, sekundaarses IgG. Uuringu täpsus teise faasini muutub veelgi spetsiifilisemaks. Kui esimeses faasis on see umbes 96%, siis teises võib see ulatuda kuni 99%-ni.

Analüüs on hea iseseisva uuringuna, kuid seda on parem kasutada kinnitava meetodina pärast positiivset mittespetsiifilist uuringut.

Selle suure täpsuse tõttu kasutatakse seda analüüsi üha enam patsiendi süüfilise kahjustuse alguse kinnitamiseks või ümberlükkamiseks.

Suurema usaldusväärsuse huvides võib pärast RPHA-d teha ka teise kinnitava testi, näiteks "treponemaalse" ensüümi immuunanalüüsi.

Üldjuhul tehakse diagnostika alati kompleksselt, mitte ainult 1 tüüpi uuringuid kasutades, vaid erinevaid täiendavaid meetodeid kombineerides.

Esitage oma küsimus kliinilise laboratoorse diagnostika arstile

Anna Poniaeva. Ta on lõpetanud Nižni Novgorodi Meditsiiniakadeemia (2007-2014) ja kliinilise laboridiagnostika residentuuri (2014-2016).

Analüüsi väikeseks miinuseks või pigem eripäraks on selle tundlikkus ka pärast haiguse paranemist. Tulemus püsib positiivne kogu süüfilist põdenud inimese elu jooksul. Sel põhjusel ei kasutata RPHA-d varajase või hilise haiguse diagnoosimiseks. Samuti on võimatu seda analüüsi kasutada ravi efektiivsuse määramiseks.

Mis tahes positiivse tulemuse korral on nakatumise kahtlus. Kuid mõnikord võib tekkida valepositiivne reaktsioon. Tõsi, selle kvantitatiivne esinemine ei ületa tavaliselt 3% ja seda põhjustavad mitmed mittenakkuslikud põhjused.

Igal juhul peaksid analüüsi kinnitama muud täiendavad uuringud.

Vaadake sellel teemal videot

Kuidas uuringut tehakse

Veri võetakse veenist tavalisel viisil.

Hästi läbiviidud vereanalüüs aitab avastada organismis erinevate keeruliste haiguste patogeene nende arengu varases staadiumis ja mõnikord isegi enne haiguse kliiniliste sümptomite ilmnemist. Väga sageli määravad arstid patsientidele aglutinatsioonireaktsiooni analüüsi. Järgmisena käsitleme seda, et tegemist on RPHA vereanalüüsiga, millal seda kasutatakse ja mille kohta see võib öelda?

Tööpõhimõte

Kaudne hemaglutinatsioonireaktsioon (nimetatakse ka passiivseks hemaglutinatsioonireaktsiooniks, tuntud ka kui RPHA, RNHA) tekib siis, kui antigeeni adsorbeerivad erütrotsüüdid puutuvad kokku sellele antigeenile vastava immuunseerumiga.

Uuringud on näidanud, et see meetod on spetsiifilisuse ja tundlikkuse poolest teistest seroloogilistest testidest oluliselt parem. Seetõttu kasutatakse seda sageli bakterite või riketsia põhjustatud haiguste tuvastamiseks. Sellise analüüsi jaoks võivad antigeenidena olla bakteriekstraktid, erinevate mikroobide puhastatud antigeenid, bakteriaalsete vaktsiinide komponendid.

Pärast patogeense bakteri sisenemist inimkehasse hakkavad selles tootma spetsiifilised ja mittespetsiifilised antikehad, mis moodustavad teatud immuunvastuse. Süüfilise puhul, mille põhjustajaks arvatakse olevat treponema pallidum, tekib inimese veres gramnegatiivne spiroheet, mittetreponemaalsed või treponemaalsed antikehad. Laboratoorsed diagnostilised testid põhinevad nende tuvastamisel, mis peaks kinnitama või ümber lükkama viiruse tekitaja olemasolu organismis.

RPHA-s kleepuvad erütrotsüüdid, mille pinnale adsorbeerusid kahvatu treponema antigeenid, süüfilisega nakatunud inimese materjalist treponema antikehadega seerumi lisamisel üksteisega kokku, st toimub nende aglutinatsioon.

Uuringu usaldusväärsus

Oluline on meeles pidada, et spirochete pallidum'i antikehad hakkavad nakatunud inimeste kehas ilmnema 2-4 nädalat pärast nakatumist ja mõnel juhul võib seda perioodi pikendada kuni 6 nädalani.

Sel põhjusel on RPHA analüüsi tundlikkus haiguse esmasel arenguetapis umbes 86%, mis on oluliselt madalam patsientide diagnoosimise täpsusest kahes järgmises etapis. Analüüsi tundlikkus selliste patsientide, aga ka latentse süüfilise kandjate puhul ulatub 99-100% -ni.

Passiivse hemaglutinatsiooni reaktsioonil on aga väga kõrge spetsiifilisus, mis ulatub 96-100% tasemeni.

See võimaldab seda uuringut kasutada diagnoosi kinnitamiseks esialgse mittetreponemaalse uuringu positiivse reaktsiooni korral, näiteks põievähi mikrosadestamise reaktsioon.

Arvestades, et treponemaalsete testide, sealhulgas TPHA tundlikkus ületab oluliselt mittetreponemaalsete meetodite tundlikkust, on sellised testid muutunud üha sagedamini ette nähtud süüfilise sõeluuringuks. Positiivse skriiningreaktsiooni saamisel on aga diagnoosi selgitamiseks vaja teist spetsiifilist (treponemaalset) analüüsi, kuid mitte TPHA analüüsi.

Analüüsi dešifreerimine

Kui reaktiivile, millega uuring läbi viiakse, lisatakse süüfilisega nakatunud inimese materjalist treponema antikehadega seerum, tekib erütrotsüütide aglutinatsioon, mille tagajärjel need sadestuvad.

Adherentsete erütrotsüütide arvu mõjutab antikehade tase seerumis. Seetõttu ei näita passiivne hemaglutinatsioon mitte ainult antikehade olemasolu, vaid võimaldab määrata ka nende arvu. Uuringu tulemust esindab antikehade tiitri tase.

Positiivne reaktsioon näitab patogeeni esinemist patsiendi kehas. Diagnostilise protsessi käigus võib aga esineda valepositiivseid reaktsioone, mille arv statistiliselt ei ületa 0,05-2,5% uuringute koguarvust.

Inimestel, kes ei ole süüfilisega nakatunud, võib TPHA positiivne reaktsioon ilmneda järgmistel juhtudel:

• süsteemsed sidekoehaigused,
• patsiendi veres antikehad kahvatu treponemaga sarnaste patogeenide vastu,
• füsioloogilised patoloogiad, nagu müokardiinfarkt,
• B- või C-hepatiit
• onkoloogilised haigused,
• kõhutüüfus, leptospiroos, tuberkuloos,
• HIV-nakkus
• borrelioosi puukide kaudu leviv etioloogia,
• ulatuslikud vigastused või luumurrud,
• Rasedus,
• ravimite süstimise korral.

Enamikul juhtudel kaasneb valepositiivsete reaktsioonidega madal tiiter. Kõrged tiitrid on tüüpilised haiguse sekundaarsele staadiumile ja varem varjatud süüfilisele. Kuid need võivad ilmneda ka valepositiivse reaktsiooniga pahaloomuliste kasvajatega patsientidel.

Inimestel, kes on vähemalt korra süüfilist põdenud, jääb RPHA reaktsioon positiivseks kuni nende elu lõpuni.

Harvad erandid on olukorrad, kui haigus avastati varases arengustaadiumis, misjärel viidi läbi intensiivne ja efektiivne ravi. Seetõttu ei saa TPHA analüüsi kasutada paranemise dünaamika hindamiseks ega haiguse varase või hilise staadiumi võrdlevaks diagnoosimiseks.

Positiivse reaktsiooni saamisel on vaja uurida haige pereliikmeid ja temaga seksuaalvahekorras olnud inimesi.

Negatiivse reaktsiooni võib saada järgmistel juhtudel:

• inimesel ei ole süüfilist,
• uuringuks valesti võetud verd,
• Nakatumisest on möödunud 2-4 nädalat ja antikehade tootmine pole veel alanud.

Igal juhul tuleb uuringu tulemust hinnata koos täiendavate laboratoorsete ja anamnestiliste näitajatega.

Kellele analüüsi näidatakse?

Arst võib suunata RPHA patsientidele vereloovutuse järgmistel juhtudel:

• süüfilise kliiniliste ilmingute esinemisel: haavandilised lööbed, laienenud lümfisõlmed, hajus alopeetsia ja teised,
• kui kahtlustate võimalikku nakatumist kokkupuutel juba haigete inimestega,
• doonorid, kes on valmis verd loovutama,
• inimesed, kes läbivad iga-aastaseid ennetavaid uuringuid või koostavad sanitaarraamatuid,
• positiivse sõeltestiga patsiendid,
• enne haiglasse sattumist,
• preoperatiivse läbivaatuse ajal
• salmonelloosi, difteeria, düsenteeria patogeenide tuvastamiseks RPHA läbiviimise meetodil sobiva diagnostikaga.

Uurimisprotseduur

Patsiendi esitatud veenivere proov saadetakse uuringule. Et mitte saada ekslikku järeldust, peaks patsient vastutama analüüsi ettevalmistamise eest. Selleks, et testi tulemused oleksid usaldusväärsed, tuleks järgida järgmisi soovitusi:

• Analüüsi tuleks võtta ainult tühja kõhuga.
• Analüüsi päeval võite minimaalsetes kogustes juua mineraalvett ilma gaasita.
• Enne analüüsi ei tohiks suitsetada vähemalt 30 minutit, kuid parem on seda aega pikendada mitme tunnini.
• Alkohoolsete jookide tarbimisele on kehtestatud otsene keeld.
• Patsiendid, kes peavad regulaarselt mingeid ravimeid kasutama, peavad sellest kindlasti teavitama suunavat arsti.
• Halva enesetunde või halva enesetunde korral tuleb sellest teavitada vereproovi võtvat õde või selle polikliiniku arsti, kus on vaja analüüsi teha.

Vastuta mitte ainult küsimuse eest, kus testi sooritada, vaid ka eksamiks valmistumise eest.

Teiste nakkushaiguste diagnoosimine

Ei tohiks arvata, et sellist uuringut nagu RPGA saab läbi viia ainult süüfilise põhjustaja tuvastamiseks kehas.

Analüüs salmonella diagnostikaga võimaldab tuvastada infektsiooni esinemist seedesüsteemis - salmonella. Alates neljandast päevast pärast nakatumist toodab organism salmonella antigeenide vastaseid antikehi, mida saab tuvastada RPGA meetodil. Negatiivne tulemus näitab infektsiooni puudumist ja positiivne tiiter, mis suureneb ägedas faasis 1:200-lt 1:800-ni, näitab selle olemasolu.

Difteeriamarkeriga RPHA teostamise meetod võimaldab diagnoosida difteeria ja hinnata immuunsust pärast vaktsineerimist. Immuunsüsteem hakkab antikehi tootma juba järgmisel päeval pärast nakatumist ja jäävad kehasse mitu nädalat. Selle analüüsi tundlikkus ületab bakterioloogilise uurimismeetodi. Tiiter 1:80 kinnitab difteeria esinemist organismis.

RPHA-s sisalduv düsenteeriamarker tuvastab kõige täpsemalt šigelloosi (batsillaarne düsenteeria), isegi kui võrrelda seda laboratoorse diagnostika meetodiga bakterikultuuri kaudu. Kui patsient ei saa kvaliteetset ravi, läheb haigus krooniliseks protsessiks, mille käigus tekivad sageli retsidiivid. Analüüs võimaldab diagnoosida kõhulahtisuse ägedat ja kroonilist faasi, tuvastada düsenteeria tekitajat, eristada bakteriaalset šigelloosi jämesoolevähist, endokriinsüsteemi häiretest või käärsoolepõletikust. Negatiivne reaktsioon näitab batsilli puudumist ja kinnitab selle olemasolu tiitriga 1:80 imikutel või 1:320 täiskasvanutel.

Leetrite markeriga uuringu läbiviimine võimaldab teil leetritega haigust kindlaks teha. Selline uuring võib olla alternatiiviks leetrite diagnoosimisel sageli tehtavale HI analüüsile.

Niisiis, RPHA vereanalüüs - mis see on? Kokkuvõttes võib julgelt öelda, et see on kaasaegne, ülitundlik ja usaldusväärne meetod erinevate bakterioloogilise etioloogiaga haiguste diagnoosimiseks.

Kokkupuutel