נוקלאוטידים- אסטרים זרחניים של נוקלאוזידים, נוקלאוזידים פוספטים. נוקלאוטידים חופשיים, בפרט ATP, cAMP, ADP, ממלאים תפקיד חשוב בתהליכי אנרגיה ומידע תוך-תאיים, והם גם מרכיבים של חומצות גרעין וקו-אנזימים רבים.
תרכובות המורכבות משתי מולקולות נוקלאוטיד נקראות דינוקלאוטידים, מתוך שלושה טרינוקלאוטידים, ממספר קטן - אוליגונוקלאוטידים, ומתוך רבים פולינוקלאוטידים, או חומצות גרעין.
מורפולינו(אנגלית) מורפולינו) הם אוליגונוקלאוטידים סינתטיים המשמשים בביולוגיה מולקולרית כדי לשנות את ביטוי הגנים. מורפולינוס אוליגומרי אנטי-סנס משמש לחסימת מולקולות אחרות מגישה לרצפי חומצות גרעין ספציפיים. אוליגונוקלאוטידים של מורפולין חוסמים אזורים קטנים חד-גדיליים (כ-25 נוקלאוטידים) על פני השטח של מולקולות RNA.
אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנסהם רצפים ארוכים של נוקלאוטידים DNA בכרומוזומים. אם יש לבטא גן, אז מתחיל תהליך התעתוק של גן זה, וכתוצאה ממנו נוצר mRNA.
ההשפעה הטיפולית של אוליגונוקלאוטידים סינתטיים אנטי-סנס תלויה בספציפיות של הכלאה שלהם עם האתר הנגיש של מטרת ה-RNA m, עמידות לפעולה של נוקלאזות תאיות ובנוכחות של מערכת אספקה לתא.
עד כה, ההשבתה הממוקדת היעילה ביותר של פעילות אזורים מסוימים בגנום מתבצעת על ידי אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס (AONs). האסטרטגיה לשימוש ב-AON מבוססת על האינטראקציה של ווטסון-קריק של מולקולות DNA עם ה-mRNA היעד. היווצרות של DNA-mRNA heteroduplex מובילה להשבתת M-RNA ולהפסקה לאחר מכן של סינתזת חלבון.
במילים אחרות, מנגנון האנטי-סנס מתייחס לקישור של האוליגונוקלאוטיד לאתר המשלים של RNA המטרה ולדיכוי התפקוד התוך תאי של RNA זה.
עם זאת, המודל התיאורטי הפשוט והמושך הזה התברר כהרבה יותר מסובך במציאות. ידועים שלושה סוגים של מולקולות אנטי-סנס: אוליגונוקלאוטידים סינתטיים קצרים יחסית; RNA antisense המתבטא בתא לאחר טרנספקציה עם גן antisense ribozyme, בעלי פעילות קטליטית.
יצירת תרופות המבוססות על אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס היא אחד הכיוונים החדשים ביותר בפיתוח תרופות. טכנולוגיה זו מעניקה לחוקר את ההזדמנות להשפיע ישירות על כמעט כל תהליך בתא עם הספציפיות הגבוהה ביותר. אם חלבון מסוים מקדם את הצמיחה של תא סרטני, אז על ידי שימוש באוליגונוקלאוטיד האנטי-סנס המתאים, ניתן להבטיח שחלבון זה לעולם לא יסונתז בתא שוב. אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס הם כל כך ספציפיים, עד שלמעשה לא ניתן להשפיע על כל חלבון אחר בתא. ספציפיות זו תפחית את תופעות הלוואי הנראות לרוב בטיפולי סרטן קונבנציונליים.
מנגנון האינאקטיבציה עדיין לא ברור לחלוטין. אבל אולי זה נובע מהעובדה ש-RNA דו-גדילי אינו אופייני לתאים נורמליים. מכיוון שהאות לסינתזה של כל חלבון הוא mRNA בודד, ניתן לכבות או "לדפוק" אות כזה לחלבון מסוים באמצעות רצף משלים כזה.
איור 4 מנגנון הפעולה של אוליגונוקלאוטיד אנטי-סנס
בעיה חשובה בטיפול בתרופות המבוססות על אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס היא הרס של תרופות כאלה על ידי אנזימי תאים - נוקלאזות. Oligodeoxonucleotides מפורקים על ידי נוקלאזות, ולכן חשוב מאוד להגן עליהם מפני פעולתם של האחרונים כדי שלא יאבדו את יכולת ההכלאה שלהם עם המטרה. לשם כך, מתבצעת הפרדה אלקטרופורטית של חלבונים תאיים, שלתוכו נכללת תווית רדיואקטיבית במהלך התרגום, ורדיואוטוגרפיה משמשת כדי לקבוע אילו מהאוליגונוקלאוטידים "אנטיסנס" מפחית את הסינתזה של חלבון מסוים. אין קריטריונים כלליים לבחירת אתרי היעד הטובים ביותר בתמלולי RNA שונים. אוליגונוקלאוטידים המשלימים ל-5'- או 3'-konp mRNA, גבולות אקסון ואינטרונים, ואפילו אזורים דו-גדיליים עשויים להיות יעילים. אוליגודאוקסינוקלאוטידים מתפוררים על ידי נוקלאזות תוך-תאיות; לכן, חשוב להגן עליהם מפני פעולתם של האחרונים כדי שלא יאבדו את יכולתם להכלאה עם המטרה. לשם כך, ניתן לשנות בסיסי פירמידין ודאוקסיריבוז בצורה מסוימת.
לפיכך, באוליגונוקלאוטידים ה"אנטיסנסים" הנפוצים ביותר כיום, אטום החמצן החופשי של הקשר הפוספודיסטר מוחלף בקבוצת סולפו, וכתוצאה מכך נוצר קשר תיאופוספט. אוליגונוקלאוטידים ששונו בדרך זו מתמוססים במים, נושאים מטען שלילי ואינם מפוצלים על ידי אנדונוקלאזים. לאחר הכלאה עם אתר המטרה, הם יוצרים דופלקסים של RNA–DNA המפעילים את הריבונוקלאז (RNase) H, אנזים אנדוגני שמבקע mRNA במולקולה ההיברידית. הניסויים הקליניים הראשונים של אוליגונוקלאוטידים כאלה, תרופות מהדור הראשון, בוצעו. היעדים הם RNA של ציטומגלווירוס, וירוס כשל חיסוני אנושי, וכן mRNA של גנים האחראים להתפתחות סרטן, מחלות מעי ומחלות אחרות.
אוליגונוקלאוטידים "אנטיסנס" מסונתזים עם קשרי פוספורמידיט ופוליאמיד (פפטיד). מולקולות כאלה עמידות מאוד לפעולת נוקלאזות. קבוצות כימיות המחוברות לאטום הפחמן 2' של שארית הסוכר ולאטום C-5 של הפירמידינים גם מגנות על אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס ומקלות על התקשרותם לאתר המטרה. ). כל היתרונות של שינויים אלה ואחרים נחקרים כעת באינטנסיביות.
אוליגונוקלאוטיד הוא חתיכה קצרה של חומצת גרעין באורך של פחות מ-50 נוקלאוטידים. במהלך 20 השנים האחרונות, המשמעות התרחבה לכלול את כל חומצות הגרעין המסונתזות בצורה כימית, ללא קשר לאורכם. הפרסום הראשון על סינתזה כימית ממוקדת של אוליגונוקלאוטיד הופיע ב-1955.
מאז, מיליוני אוליגונוקלאוטידים יוצרו מדי שנה לשימוש במעבדות ברחבי העולם. רוב המחקרים דורשים רק כמויות קטנות של DNA. יש צורך בכמויות גדולות בהרבה של DNA (10 מיקרומול או יותר) לשימוש במחקרים ביו-פיזיקליים (NMR וקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן), ולכן על מנת לאפשר סינתזה של כמויות כה גדולות, פותחו שיטות סינתזה מוצק המאפשרות שימוש של אוליגונוקלאוטידים כמולקולות תרופתיות (לדוגמה, אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס).
הסינתזה של אוליגונוקלאוטידים של DNA או RNA מתייחסת לסינתזה כימית של שברי חומצות גרעין עם מבנים או רצפים כימיים מוגדרים בגדלים שונים.
איור.1. מבנים של אוליגונוקלאוטידים.
העיקרון של סינתזת פאזות מוצקות פותח ויישם לראשונה על סינתזה של פוליפפטידים על ידי רוברט ברוס מריפילד, ביוכימאי אמריקאי שקיבל את פרס נובל בכימיה בשנת 1984 על המצאתו של סינתזת פפטידים מוצק. הוא הבין שהמפתח לסינתזה מוצלחת הוא עיגון המונומר הראשון למוצק הפולימרי הבלתי מסיס. לאחר מכן ניתן לחבר מונומרים אחרים, אחד אחד, לקצה הטרמינל הבלתי נייד של הפולימר הגדל. בסיום הסינתזה ניתן לנתק את שרשרת הפולימר שהושלמה מהפולימר הבלתי מסיס ולטהר. תהליך זה עבר אופטימיזציה במהלך השנים כדי להיות יעיל ביותר וכעת הפך לטכניקה בסיסית המשמשת בסינתיסייזרים אוטומטיים של אוליגונוקלאוטידים.
כדי להבטיח סינתזה מוצלחת של אוליגונוקלאוטידים, יש צורך בתנאים הבאים:
- כל הריאגנטים חייבים להיות מסיסים בממיסים לא מימיים.
- קבוצות אמינו והידרוקסיל של בסיסי נוקלאוטידים ושאריות פחמימות חייבות להיות חסומות בצורה מתאימה.
- קבוצות ההגנה המוכנסות במהלך הסינתזה חייבות להיות יציבות בתנאים של התארכות שרשרת במהלך יצירת קשר פוספודיסטר בין-נוקלאוטיד.
- קבוצות ההגנה חייבות להיות מספיק לאביליות כדי שניתן יהיה להסיר אותן בתום הסינתזה מבלי לפגוע בתוצרי התגובה.
פונקציות של אוליגונוקלאוטידים וסיכויים ליישום שלהם
כיום, אוליגונוקלאוטידים והאנלוגים שלהם נמצאים בשימוש נרחב בתחומים שונים, כגון רפואה וביולוגיה מולקולרית, והם נחשבים גם כסוכנים טיפוליים מבטיחים ובדיקות לאבחון מולקולרי.
במהלך 20 השנים האחרונות, רק שני סוגים של אנלוגים של חומצות גרעין עם עמוד שדרה נייטרלי מבחינה חשמלית, חומצות גרעין פפטידים ואוליגונוקלאוטידים פוספודיאמיד מורפולינו, נחקרו היטב. אנלוגים משני הסוגים מסוגלים להיקשר משלים למולקולות DNA ו-RNA טבעיות, ולכן הם מצאו יישום הן בביולוגיה מולקולרית ובמיוחד ברפואה כתרופות פוטנציאליות.
בנוסף, עם התפתחות טכנולוגיות ה-DNA, ניתן היה לחקור ביטוי של גנים ידועים, לקבוע מוטציות בגנום של אורגניזמים שונים ולאבחן מספר מחלות זיהומיות. בפתרון הבעיות הללו, המבטיח ביותר הוא השימוש בשבבי DNA, שהם לוחות קטנים שעל פניהם מופקדים שברי DNA.
השיטה ליצירת שבבי DNA משלבת שיטות המבוססות על סינתזה ממוקדת של אוליגונוקלאוטידים ישירות על פני השבב. הסינתזה מתבצעת על ידי הוספה שלב לשרשרת האוליגונוקלאוטידים ההולכת וגדלה של נוקלאוטידים המכילה קבוצת הגנה לאבילית בקצה 5', אותה ניתן להסיר תחת פעולת קרינת אור, מתח חשמלי או במהלך הידרוליזה חומצית.
כמו כן, הוכח כי בהתאם לגן המטרה שנבחר, לאוליגונוקלאוטידים ממוקדי גנים יש מגוון משמעותי של השפעות מווסתות על רקמות הגידול, החל מהאטה ועצירת התפשטות תאי הגידול וכלה בדיכוי התכונות הפולשניות שלהם.
תרופות אנטי-סרטניות המבוססות על חומצות גרעין הן כלי ספציפי מאוד לוויסות ביטוי גנים. ניתן להשיג דיכוי של מספר גנים המבוטאים בצורה חריגה במהלך טרנספורמציה ניאופלסטית באמצעות תרופות המבוססות על חומצות גרעין כגון אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס (asONs). באופן כללי, מנגנון הדיכוי של ביטוי גנים מורכב מהקשירה המשלימה שלהם ל-mRNA היעד, ולאחר מכן ה-mRNA היעד מבוקע או שיחסם תהליך התרגום שלו.
asON הם DNA סינתטיים חד-גדיליים באורך 15-20 נוקלאוטידים. לאחרונה התקבלו asONs שיכולים למנוע את הובלת mRNA שחובר מהגרעין לציטופלזמה, וכן asONs, שכתוצאה מחסימת אתר השחבור בפרה-mRNA, יכולים להוביל לביטוי של וריאנט חלבון חלופי.
בשל העובדה שאוליגודאוקסיריבונוקלאוטידים טבעיים בתרבית תאים ובתנאי in vivo עוברים פירוק מהיר בפעולת נוקלאזות, שינויים כימיים שונים מוכנסים למבנה asON כדי להגביר את יציבותם.
סינתזה כימית של אוליגונוקלאוטידים
סינתזת פאזה מוצקה נמצאת בשימוש נרחב בסינתזת פפטידים, סינתזת אוליגונוקלאוטידים, סינתזת אוליגוסכרידים וכימיה קומבינטורית. סינתזה כימית במצב מוצק הומצאה בשנות ה-60 על ידי ברוס מריפילד, וזכתה בפרס נובל לכימיה ב-1984.
סינתזת פאזות מוצקות מתבצעת על תומך מוצק, בין מסננים, בעמודות המאפשרות לעבור לכל הריאגנטים והממסים. לסינתזת שלב מוצק יש מספר יתרונות על פני סינתזת פתרונות:
מספק קצב תגובה גבוה
זיהומים ועודפי ריאגנטים נשטפים, כך שאין צורך בניקוי לאחר כל שלב
התהליך זמין לאוטומציה בסינטסייזרים מוצקים הנשלטים על ידי מחשב.
נשאים מוצקים (הנקראים גם שרפים) הם חלקיקים בלתי מסיסים במים, בדרך כלל בקוטר של 50-200 מיקרומטר, אליהם מחובר אוליגונוקלאוטיד במהלך הסינתזה.
ישנן עדויות שאחד החומרים היעילים ביותר שיכולים לשמש כתמיכה מוצקה היא זכוכית נקבוביה. הוא די נוקשה ואינו מסוגל להתנפח. בנקבוביות העמוקות שלו מתרחשת סינתזה של אוליגונוקלאוטידים. הזכוכית מכילה נקבוביות של 500 Å (50 ננומטר), המתאימות לסינתזה של אוליגונוקלאוטידים קצרים. עם זאת, הוא לא מתאים לסינתזה של אוליגונוקלאוטידים באורך של מעל 40 בסיסים. זה נובע מהעובדה שהאוליגונוקלאוטיד הגדל חוסם את הנקבוביות ומפחית את הדיפוזיה של ריאגנטים דרך המטריצה.
תומכים מוצקים לסינתזת אוליגונוקלאוטידים קונבנציונלית מיוצרים בדרך כלל עם העמסה של 20-30 מיקרומול נוקלאוזיד לגרם שרף. סינתזה של אוליגונוקלאוטידים בעומסים גבוהים יותר הופכת פחות יעילה עקב הפרעה סטרית בין גדילי DNA סמוכים המחוברים לשרף.
שלבים של סינתזה כימית של אוליגונוקלאוטידים
סינתזת אוליגו של פוספורמידאט ממשיכה בכיוון 3' עד 5' (מנוגד לכיוון 5' עד 3' של ביו-סינתזה של DNA בשכפול DNA). נוקלאוטיד אחד מתווסף לכל סינתזת מחזור.
אורז. 2. מחזור סינתזה של אוליגונוקלאוטיד פוספורמידאט
בתחילת סינתזת האוליגונוקלאוטידים, הנוקלאוזיד הראשון מחובר מראש לשרף (הנשא) ועמודות סינתזה A, G, C או T נבחרות בהתאם לנוקלאוזיד בקצה ה-3' של האוליגונוקלאוטיד הרצוי. לנוקלאוזיד המעוגן יש קבוצת הגנה 5'-DMT (DMT=4,4'-dimethoxytrityl) שתפקידה למנוע פילמור ויש להסיר את קבוצת ההגנה הזו (דטריטילציה). מנגנון הביטול מוצג באיור 3.
איור 3. הגנה על מנגנון הסרת קבוצה.
לאחר דטריטילציה, הנוקלאוזיד המעוגן מוכן להגיב עם הבסיס הבא, שמתווסף כמונומר הנוקלאוזיד פוספורמידאט. עודף גדול של הנוקלאוזיד המתאים מעורבב עם מפעיל (טטרזול או נגזרותיו). קבוצת הדי-איזופרופילאמינו של הנוקלאוזיד עוברת פרוטונציה על ידי המפעיל, וכך הופכת לקבוצה ניתנת להפרדה. הוא נעקר במהירות על ידי קבוצת 5′-הידרוקסיל של הנוקלאוזיד הקשור, ויוצר טריאסטר פוספיט (איור 4).
איור.4. מנגנון הפרוטונציה על ידי מפעיל.
נוקלאוזיד פוספורמידיטים יציבים למדי באטמוספרה אינרטית, וניתן לייצרם בכמויות גדולות, לשלוח לכל העולם, ולאחסן כמוצק יבש במשך מספר חודשים לפני השימוש.
עם זאת, אפילו עם עבודת סינתזת אוליגונוקלאוטידים ברמת דיוק גבוהה, נותרה האפשרות שיהיו כמה קבוצות 5'-הידרוקסיל שלא הגיבו, שיהיו זמינות להשתתף בשלב הבא. אם שיבוש כזה לא ייפסק, הם יצטברו עם כל מחזור שלאחר מכן, והתוצר הסופי יהיה תערובת מורכבת של אוליגונוקלאוטידים, שרובם יישאו מידע גנטי שגוי.
לכן, שיטת האצטילציה של קבוצות 5'-הידרוקסיל הופכת אותם לאנרטיים ביחס לתגובה הבאה. זה הכרחי גם כדי למזער זיהומים.
הטריאסטר פוספיט (P(III)) שנוצר בשלב ההוספה אינו יציב לחומצות ויש להמיר אותו לצורה היציבה (P(V)). זה מושג עקב חמצון של יוד בנוכחות מים ופירידין (איור 5). הפוספוטריסטר שנוצר הוא למעשה ציר DNA המוגן על ידי קבוצת 2-ציאנואתיל. קבוצת הציאנואתיל מונעת תגובות לא רצויות עם זרחן במהלך מחזורי הסינתזה הבאים.
איור.5. המנגנון של שלב החמצון.
לאחר מכן, יש להסיר את קבוצת ההגנה DMT בקצה 5' של גדיל ה-DNA כך שקבוצת ההידרוקסיל הראשונית תוכל להגיב עם הנוקלאוטיד פוספורמידאט הבא. תגובת הסרת ההגנה עם חומצה טריכלורואצטית בדיכורומתאן היא מהירה. המחזור חוזר על עצמו, פעם אחת עבור כל בסיס, עד לקבלת האוליגונוקלאוטיד הרצוי.
לאחר מכן, עליך לנתק את האוליגונוקלאוטיד המסונתז מהתמיכה המוצקה. במקרה זה, נעשה שימוש בסוצ'יניל. הפרדה אפשרית כאשר מטופלים באמוניה מימית מרוכזת בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת (איור 6).
איור 6. מנגנון הפרדה של אוליגונוקלאוטיד מנשא מוצק בתמיסת אמוניה מימית מרוכזת.
תגובת המחשוף מתבצעת אוטומטית בכמה סינתיסייזרים, ותמיסת האמוניה המכילה את האוליגונוקלאוטיד נכנסת לבקבוקון זכוכית. לחילופין, העיכול יכול להתבצע באופן ידני על ידי הוצאת העמוד מהסינתיסייזר ושטיפה במזרקים המכילים אמוניום הידרוקסיד.
האוליגונוקלאוטיד מומס באמוניה מימית מרוכזת, וחימום לאחר מכן מאפשר הסרה של קבוצות הגנה מבסיסים הטרוציקליים ופוספטים. התמיסה המימית מוסרת לאחר מכן על ידי אידוי והאוליגונוקלאוטיד מוכן לטיהור.
בנוסף לקבוצת המגן DMT, יש צורך גם בקבוצות הגנה נוספות לאדנין, ציטוזין וגואנין (איור 7). עם זאת, זה לא הכרחי עבור תימין.
איור 7. מבני קבוצת מגן המשמשים בדרך כלל להגנה על בסיסים של אדנין, ציטוזין וגואנין במהלך סינתזת פוספורמידאט של אוליגונוקלאוטידים של DNA.
מסקנות
1. אוליגונוקלאוטידים המסונתזים באופן מלאכותי נמצאים בשימוש הולך וגובר בתחומי מדע שונים, ושיטות הכנתם משתפרות יותר ויותר, מה שמאפשר לסנתז מספר מספיק של אוליגונוקלאוטידים לניסויי מעבדה וליצירת תרופות טיפוליות.
2. עד כה, השיטה הנפוצה ביותר לסינתזה של אוליגונוקלאוטידים היא שיטת סינתזת הפאזה המוצקה, אשר יכולה להאיץ משמעותית את תהליך קבלת האוליגונוקלאוטידים, כמו גם להפחית את כמות הריאגנטים המושקעים.
5507 0
ניתן להשיג זאת בכמה דרכים: הכלאה של האוליגונוקלאוטיד המקביל עם גן או mRNA ספציפי, חסימת גורם שעתוק החלבון, הפחתת כמות ה-mRNA כתוצאה מביקוע על ידי אנזימי RNA וכו'. שקול את העקרונות של כמה מהם.
ריבוליגונוקלאוטיד הנקשר ל-mRNA ספציפי ובכך מעכב את התרגום של החלבון שהוא מקודד נקרא mRNA "אנטיסנס". מנגנון זה משמש חיידקים מסוימים לוויסות גנים (איור 3.20). בפועל, נעשה שימוש בגנים המעוצבים באופן מלאכותי, שבהם הכנס ה-DNA נמצא בכיוון כזה שהתמלילים שלהם הם אנטי-סנס ביחס ל-mRNA היעד (איור 3.21).
אורז. 3.20. ויסות של הגן בקטריופריטין (bfr) על ידי RNA antisense
אורז. 3.21. עיכוב של תרגום mRNA על ידי אוליגונוקלאוטיד סינטטי נגד חושים
הוכח שניתן להשתמש באוליגונוקלאוטידים סינתטיים אנטי-סנס, אולם ההשפעה הטיפולית שלהם תהיה תלויה מאוד בעמידותם לפעולה של נוקלאזות תאיות, מערכת האספקה והספציפיות של ההכלאה שלהם. כדי לקבוע את אתרי היעד היעילים ביותר ב-mRNA ספציפי, נבדקת קבוצה של אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס באורך 15-20 בסיסים עם תרבית של תאים המסנתזים את ה-mRNA היעד. הרכב החלבונים המסונתזים נקבע על ידי אלקטרופורזה ונקבע איזו החדרת אוליגונוקלאוטידים מובילה לירידה בסינתזה של חלבון המטרה.
כדי להגן מפני ביקוע נוקלאז, מסונתזים אוליגונוקלאוטידים שעברו שינוי, מבלי לאבד את יכולת ההכלאה. על איור. 3.22 מציג את המבנים של נוקלאוטידים שעברו שינוי, שיעילותם נחקרת באופן אינטנסיבי. לדוגמה, הוכח שאוליגונוקלאוטידים עם החלפת החמצן החופשי של הקשר הפוספודיסטר בגופרית (מבנה ב) כלאיים ביעילות עם RNA המטרה המשלים והדופלקסים של RNA-DNA המתקבלים מפעילים את הריבונוקלאז התוך תאי H.
אנזים אנדוגני זה מבצע הידרוליזה של רצף ה-RNA בהיברידיות כאלה. עם אוליגונוקלאוטידים כאלה, כבר בוצעו ניסויים קליניים מבטיחים, שבהם היעדים היו RNA של ציטומגלווירוס, HIV וכמה RNA שאחראים להתפתחות סרטן.
אורז. 3.22. שינויים אוליגונוקלאוטידים: a - קשר פוספודיסטר תקין; b - קשר thiophosphate; c - קשר פוספאמיד; d - 2"-0-methylribose; e - C-5-propynylcytosine
לאספקה יעילה של אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס, הם נארזים לרוב בליפוזומים, שבתורם משתנים עם ליגנים ספציפיים המספקים מסירה ממוקדת (כבר ראינו טכניקה זו כאשר שקלנו שיטות לאספקה לא-ויראלית של גנים טיפוליים). עד כה, בוצעו מספר בדיקות והוכח כי יעילות טיפולית גבוהה של אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס מדכאים שגשוג לא רצוי של תאי שריר חלק (סיבוכים לאחר ניתוחי אנגיופלסטיקה, ניתוחי מעקף כליליים, טרשת עורקים), לטיפול בזיהומים ויראליים ומלריה. .
עקרון הפעולה והמבנה של ריבוזימים - RNA טבעי עם פעילות נוקלאז, מוצג באיור. 3.23.
נמצא כי RNA קצר גדילים אלו מסוגלים לדכא ביעילות את הביטוי של גנים ויראליים, אונקוגנים, גורמי גדילה וגנים אחרים בעלי חשיבות טיפולית על ידי ביקוע ה-mRNA שלהם. על ידי שינוי רצף קושרת המצע, ניתן להשיג ריבוזימים ספציפיים ל-mRNA מסוים. ניתן לסנתז ריבוזימים ישירות בתא על ידי שעתוק של אוליגודאוקסיריבונוקלאוטיד סינטטי המקודד לתחום הקטליטי ואזורים הכלאים שמאגפים אותו.
אורז. 3.23. חיתוך של mRNA על ידי ריבוזימים. החץ מציג את אתר המחשוף.
אוליגונוקלאוטיד כזה מוחדר לווקטור ביטוי אוקריוטי ומוכנס לתא. ה-RNA המתקבל מקבל באופן ספונטני מבנה פעיל, מה שנקרא צורת ראש פטיש. ריבוזימים רבים של מבנים ופעילויות שונות עברו סינתזה כימית. לדוגמה, במעבדה לחומצות גרעין של המכון לביולוגיה כימית ורפואה ניסויית של הסניף הסיבירי של האקדמיה הרוסית למדעים (נובוסיבירסק), מתבצעים שנים רבות של מחקר להשגת ריבוזימים סינתטיים בעלי פעילות ויציבות מוגברת.
כדי להגביר את ההגנה מפני ביקוע מוקדם על ידי נוקלאזות תוך תאיות, מתקבלות נגזרות שונות של ריבוזימים - עם קבוצות 2"-hydroxyl מתילתיות (ראה איור 3.22, ד), מבנים בינאריים וכו'. המבנה של מולקולת הריבוזים משפיע באופן משמעותי על יעילותה. איור 3.24 מציג את הקינטיקה של מחשוף mRNA mdr1 עם ריבוזימים מסונתזים של מבנים שונים.
אורז. 3.24. חיתוך של המקטע 5'-טרמינלי בעל 190 bp של mRNA MDR1 עם ריבוזימים בינאריים (1,3) ובאורך מלא (2,4): א - מבנה RNA עם אתר ספציפי מבודד; ב - הצטברות תוצרי ביקוע ( חומרים שסופקו על ידי A.G. Venyaminova, IBKhiFM, נובוסיבירסק)
מקום מיוחד בטיפול מולקולרי תופס על ידי מה שנקרא שיטות הפעלת פרו-תרופות. לדוגמה, אחת השיטות של ריפוי גנטי לסרטן היא הרס של תאי גידול באמצעות נגזרת פעילה של ganciclovir (GCV, נגזרת של גואנוזין), תוצר גן thymidine kinase, מנגיף ההרפס סימפלקס HSVtk שהוזכר כבר.
תאי גידול עוברים transfected in vivo עם הגן HSVtk תחת פרומוטור פעיל ולאחר מספר ימים ניתנת ganciclovir, אשר מזורחן על ידי thymidine kinase ויראלי ל-mononphosphate ולאחר מכן על ידי קינאזות תאי מארח לטריפוספט. נגזרת זו מעכבת DNA פולימראז ומפסיקה סינתזת DNA, מה שמוביל למוות של תאים מתרבים. באמצעות מגעים בין-תאיים, גנציקלוביר טריפוספט חודר לתוך תאים שכנים ללא שינוי ובכך הורס עשרה תאי גידול נוספים.
הגן שמוביל למוות של התא של עצמו נקרא גן "התאבדות" (במקרה שלנו זה הגן thymidine kinase), והמונח "פרו-תרופה" מתייחס לצורה הלא פעילה של התרופה (במקרה זה הוא ganciclovir). גישה זו שימשה ליצירת גרסאות אחרות של השילוב של מפעיל גנים-פרו-תרופה, אך היעילות של מערכת GCV-HSVtk כבר הוכחה במספר ניסויים פרה-קליניים.
ריפוי גנטי הוא דיסציפלינה רפואית חדשה, שהיווצרותה מתרחשת לנגד עינינו. למרות כמה הצלחות וסיכויים מבטיחים, ישנם מספר אתגרים שנותרו להתגבר עליהם.
חלק מהבעיות נמצאות הרבה מעבר לרפואה ולביולוגיה מולקולרית. אלו סוגיות אתיות ופוליטיות. כפי שכבר שמתם לב, שקלנו שיטות של טיפול גנטי רק לתאים סומטיים. המשמעות היא שהתיקונים שנעשו מוגבלים לאיבר או רקמה מסוימת, הגנים ה"מתוקנים" לא יועברו לדור הבא. שינויים בגנוטיפ של תאי נבט (זרע או ביציות) או תאים מופרים חייבים לעבור מדור לדור.
כיום, טיפול גנטי של תאים סומטיים מסווג כשיטה סטנדרטית להתערבות רפואית. לעומת זאת, טיפול גנטי בתאי נבט הוא הרבה יותר מורכב, בעייתי ובלתי צפוי מבחינה טכנולוגית. לכן, ניסויים בתחום זה אסורים במדינות רבות.
בסוף שנות ה-80. בארצות הברית נקבעו תקנות המסדירות ניסויים בתחום הטיפול הגנטי בתאים סומטיים. הם מבטיחים בחירה חסרת פניות ומייצגת של מטופלים ומודעותם (עד כמה הטיפול מסוכן, מה ההסתברות להצלחתו וכו'), סודיות המידע על המטופלים והמחקרים שבוצעו, יישום כל המניפולציות כראוי מבלי לגרום לכך. נזק, הן לחולים ספציפיים והן לאוכלוסיה האנושית בכלל.
מאחר והטיפול בתאים סומטיים מביא לשיפור במצב ולהארכת חייהם משמעותית של חולי מחלות גנטיות, אך הגן ה"משופר" אינו עובר בתורשה, מאמינים שהדבר יוביל להצטברות של מחלות גנטיות ב האוכלוסייה האנושית. עם זאת, על פי גנטיקה של אוכלוסיות, נדרשות אלפי שנים לעלייה משמעותית בתדירות של גן מזיק כתוצאה מטיפול יעיל.
על. Voinov, T.G. וולובה
רוב שיטות הריפוי הגנטי ex vivo ו-in vivo משתמשות במבנים גנטיים משובטים המחליפים את הצורה התפקודית של חלבון שאינו מסונתז בגוף המטופל או מסונתז בצורה פגומה. עם זאת, מחלות אנושיות רבות (סרטן, דלקות, זיהומים ויראליים וטפילים) קשורות, להיפך, לייצור יתר של חלבון תקין. פותחו טיפולים לטיפול במצבים אלו.
מערכות המשתמשות באוליגונוקלאוטידים ספציפיים. אוליגונוקלאוטיד קטן כזה יכול להכליא לגן ספציפי או mRNA ולהפחית את רמת השעתוק או התרגום, ובכך להפחית את כמות החלבון האחראית לפתולוגיה המסונתזת. אוליגונוקלאוטיד שמכליא עם הגן עצמו וחוסם את השעתוק שלו נקרא "אנטיגן", וכזה שמכליא עם ה-mRNA המקביל נקרא "אנטיסנס" (Antisense RNA). כדי למנוע הפעלה של שעתוק של גנים ספציפיים, ניתן להשתמש גם באוליגונוקלאוטידים דו-גדיליים הנקשרים ספציפית לחלבונים קושרים ל-DNA (חלבונים פעילים). לבסוף, כדי להפחית את כמות ה-mRNA המסונתז והחלבון המסונתז עליו, ניתן להשתמש בריבוזימים - רצפי RNA טבעיים שנקשרים למולקולות RNA ספציפיות וחותכים אותן.
בעתיד, תרופות המבוססות על חומצות גרעין צפויות למצוא יישום רחב, כאשר אוליגונוקלאוטידים מסוג "אנטיסנס" שונים הם האובייקט העיקרי של מחקר מדעי וניסויים קליניים.
3.1 אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס כתרופות
RNA "אנטיסנס" (Antisense RNA), שאמור לשמש כתרופה, הוא אוליגונוקלאוטיד קצר (15-20 נוקלאוטידים) שיכול להיקשר לאתר mRNA מסוים המשלים לו ולעכב את התרגום של החלבון שהוא מקודד, ובכך לדכא את התהליך הפתולוגי (איור 2).
ההשפעה הטיפולית של אוליגונוקלאוטידים סינתטיים "אנטיסנסים" תלויה בספציפיות של הכלאה שלהם עם האתר הנגיש של ה-mRNA היעד, בעמידות לפעולה של נוקלאזות תאיות ובנוכחות של מערכת מסירה לתא. רצפים של 15-20 נוקלאוטידים מתכלאים עם mRNAs ייחודיים עם סגוליות גבוהה למדי. אתרי יעד פוטנציאליים נקבעים על ידי בדיקת קבוצה של אוליגונוקלאוטידים "אנטיסנס" באמצעות תרבית תאים המסנתזת את ה-mRNA היעד. לשם כך, מתבצעת הפרדה אלקטרופורטית של חלבונים תאיים, שלתוכו נכללת תווית רדיואקטיבית במהלך התרגום, ורדיואוטוגרפיה משמשת כדי לקבוע אילו מהאוליגונוקלאוטידים "אנטיסנס" מפחית את הסינתזה של חלבון מסוים. אין קריטריונים כלליים לבחירת אתרי היעד הטובים ביותר בתמלולי RNA שונים. אוליגונוקלאוטידים המשלימים לקצוות 5' או 3' של mRNA, גבולות אקסון ואינטרונים, ואפילו אזורים דו-גדיליים עשויים להיות יעילים. אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס ניתנים לפירוק על ידי נוקלאזות תוך-תאיות, ולכן חשוב להגן עליהם מפני פעולתם של האחרונים כדי שלא יאבדו את יכולתם להכלאה עם המטרה. לשם כך, ניתן לשנות בסיסי פירמידין, ריבוז או דאוקסיריבוז בצורה מסוימת (איור 3). לפיכך, באוליגונוקלאוטידים ה"אנטיסנסים" הנפוצים ביותר כיום, אטום החמצן החופשי של הקשר הפוספודיסטר מוחלף בקבוצת SH (איור 3B ), וכתוצאה מכך נוצר קשר תיופפוספט. אוליגונוקלאוטידים ששונו בדרך זו מתמוססים במים, נושאים מטען שלילי ואינם מפוצלים על ידי אנדונוקלאזים. כשהכלאה לאתר מטרה, הם יוצרים דופלקסים המפעילים ריבונוקלאז (RNase), אנזים אנדוגני שמבקע mRNA במולקולה היברידית כזו. הניסויים הקליניים הראשונים של אוליגונוקלאוטידים כאלה - תרופות של "הדור הראשון" בוצעו. היעדים הם RNA של ציטומגלווירוס, וירוס כשל חיסוני אנושי, וכן mRNA של גנים האחראים להתפתחות סרטן, מחלות מעיים ומחלות אחרות.
אוליגונוקלאוטידים "אנטיסנס" מסונתזים עם קשרי פוספורמידיט ופוליאמיד (פפטיד) - חומצות גרעין פפטידים (Peptide nucleicacids, PNAs) (איור 3 V ו-D ). מולקולות כאלה עמידות מאוד לפעולת נוקלאזות. קבוצות כימיות המחוברות לאטום 2'-פחמן של שארית הסוכר ולאטום C-5 של הפירמידינים מגינות גם על אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס ומקלות על הקישור שלהם לאתר המטרה (איור 3). 2דו ה ). כל היתרונות של שינויים אלה ואחרים נחקרים כעת באינטנסיביות.
ניתן להקל מאוד על חדירה של אוליגונוקלאוטידים "אנטיסנס" לתא על ידי הנחתם בליפוזומים. מערכת מסירה יעילה זו מאפשרת שימוש באוליגונוקלאוטידים "אנטיסנס" בריכוזים נמוכים. אם, לעומת זאת, ליפוזומים מצומדים עם נוגדנים ספציפיים לאפיטופים של תאים מסוימים של איברים מסוימים, אז ניתן יהיה לבצע משלוח ממוקד של אוליגונוקלאוטידים "אנטיסנס".
בדיקות פרה-קליניות שנערכו הראו שאוליגונוקלאוטידים "אנטיסנס" הם תרופות יעילות מאוד. נחקרה האפשרות להשתמש בהם לטיפול בהיצרות של העורקים הכליליים והצוואריים, המובילה להתקפי לב ושבץ. במקרים אלו לעיתים קרובות נעזרים באנגיופלסטיקה, הרחבת העורקים באמצעות צנתר בלון, אך בכ-40% מהחולים היצרות מופיעות שוב לאחר 6 חודשים, שכן אנגיופלסטיקה מעוררת שגשוג של תאי שריר חלקים והפרשת חומר בין-תאי לחלק הפנימי. שכבת העורק במקום התפשטותו. באחד הניסויים, הוזרקו אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס עם קשרי תיאופוספט, המשלימים ל-mRNA המקודדים לחלבונים החשובים למחזור תאי היונקים, לעורקי הצוואר של חולדות לאחר ניתוח אנגיופלסטיקה; כתוצאה מכך, שכיחות ההיצרות החוזרות ירדה ב-90%. שגשוג של תאי שריר חלק מתרחש גם בטרשת עורקים, סוכרת, סיבוכים לאחר ניתוח מעקף כלילי. ככל הנראה, ניתן לשלוט בכל המצבים הללו בדרכים דומות.
אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס יכולים לשמש גם לטיפול בזיהומים ויראליים ומלריה. בנוסף, תוצאות הניסויים הקליניים בשלב I לטיפול במחלת קרוהן באמצעות מתן פומי של אוליגונוקלאוטיד "אנטיסנס" המחישו אפקט טיפולי ברור ללא תופעות לוואי ניכרות. במקרה זה, ה-mRNA היעד קידד להידבקות בין-תאית מסוג 1, המיוצר בעודף בחולים עם מחלת קרוהן. הוא נועד לחקור את היעילות של אותו אוליגונוקלאוטיד לטיפול במחלות דלקתיות אחרות, כגון דלקת מפרקים שגרונית, פסוריאזיס וקוליטיס כיבית.
באופן עקרוני, אוליגונוקלאוטידים "אנטיסנס" יכולים ליצור סליל משולש עם DNA מטרה כרומוזומלי ולחסום שעתוק. עם זאת, הספציפיות של אוליגונוקלאוטידים "אנטיגניים" עדיין לא עומדת בסטנדרטים שאומצו לתרופות.
RNA "אנטיסנס" (Antisense RNA), שאמור לשמש כתרופה, הוא אוליגונוקלאוטיד קצר (15-20 נוקלאוטידים) שיכול להיקשר לאתר mRNA מסוים המשלים לו ולעכב את התרגום של החלבון שהוא מקודד, ובכך לדכא את התהליך הפתולוגי (איור 2).
ההשפעה הטיפולית של אוליגונוקלאוטידים סינתטיים "אנטיסנסים" תלויה בספציפיות של הכלאה שלהם עם האתר הנגיש של ה-mRNA היעד, בעמידות לפעולה של נוקלאזות תאיות ובנוכחות של מערכת מסירה לתא. רצפים של 15-20 נוקלאוטידים מתכלאים עם mRNAs ייחודיים עם סגוליות גבוהה למדי. אתרי יעד פוטנציאליים נקבעים על ידי בדיקת קבוצה של אוליגונוקלאוטידים "אנטיסנס" באמצעות תרבית תאים המסנתזת את ה-mRNA היעד. לשם כך, מתבצעת הפרדה אלקטרופורטית של חלבונים תאיים, שלתוכו נכללת תווית רדיואקטיבית במהלך התרגום, ורדיואוטוגרפיה משמשת כדי לקבוע אילו מהאוליגונוקלאוטידים "אנטיסנס" מפחית את הסינתזה של חלבון מסוים. אין קריטריונים כלליים לבחירת אתרי היעד הטובים ביותר בתמלולי RNA שונים. אוליגונוקלאוטידים המשלימים לקצוות 5' או 3' של mRNA, גבולות אקסון ואינטרונים, ואפילו אזורים דו-גדיליים עשויים להיות יעילים. אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס ניתנים לפירוק על ידי נוקלאזות תוך-תאיות, ולכן חשוב להגן עליהם מפני פעולתם של האחרונים כדי שלא יאבדו את יכולתם להכלאה עם המטרה. לשם כך, ניתן לשנות בסיסי פירמידין, ריבוז או דאוקסיריבוז בצורה מסוימת (איור 3). לפיכך, באוליגונוקלאוטידים ה"אנטיסנסים" הנפוצים ביותר כיום, אטום החמצן החופשי של הקשר הפוספודיסטר מוחלף בקבוצת SH (איור 3B ), וכתוצאה מכך נוצר קשר תיופפוספט. אוליגונוקלאוטידים ששונו בדרך זו מתמוססים במים, נושאים מטען שלילי ואינם מפוצלים על ידי אנדונוקלאזים. כשהכלאה לאתר מטרה, הם יוצרים דופלקסים המפעילים ריבונוקלאז (RNase), אנזים אנדוגני שמבקע mRNA במולקולה היברידית כזו. הניסויים הקליניים הראשונים של אוליגונוקלאוטידים כאלה - תרופות של "הדור הראשון" בוצעו. היעדים הם RNA של ציטומגלווירוס, וירוס כשל חיסוני אנושי, וכן mRNA של גנים האחראים להתפתחות סרטן, מחלות מעיים ומחלות אחרות.
אוליגונוקלאוטידים "אנטיסנס" מסונתזים עם קשרי פוספורמידיט ופוליאמיד (פפטיד) - חומצות גרעין פפטידים (Peptide nucleicacids, PNAs) (איור 3 V ו-D ). מולקולות כאלה עמידות מאוד לפעולת נוקלאזות. קבוצות כימיות המחוברות לאטום 2'-פחמן של שארית הסוכר ולאטום C-5 של הפירמידינים מגינות גם על אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס ומקלות על הקישור שלהם לאתר המטרה (איור 3). 2דו ה ). כל היתרונות של שינויים אלה ואחרים נחקרים כעת באינטנסיביות.
ניתן להקל מאוד על חדירה של אוליגונוקלאוטידים "אנטיסנס" לתא על ידי הנחתם בליפוזומים. מערכת מסירה יעילה זו מאפשרת שימוש באוליגונוקלאוטידים "אנטיסנס" בריכוזים נמוכים. אם, לעומת זאת, ליפוזומים מצומדים עם נוגדנים ספציפיים לאפיטופים של תאים מסוימים של איברים מסוימים, אז ניתן יהיה לבצע משלוח ממוקד של אוליגונוקלאוטידים "אנטיסנס".
בדיקות פרה-קליניות שנערכו הראו שאוליגונוקלאוטידים "אנטיסנס" הם תרופות יעילות מאוד. נחקרה האפשרות להשתמש בהם לטיפול בהיצרות של העורקים הכליליים והצוואריים, המובילה להתקפי לב ושבץ. במקרים אלו לעיתים קרובות נעזרים באנגיופלסטיקה, הרחבת העורקים באמצעות צנתר בלון, אך בכ-40% מהחולים היצרות מופיעות שוב לאחר 6 חודשים, שכן אנגיופלסטיקה מעוררת שגשוג של תאי שריר חלקים והפרשת חומר בין-תאי לחלק הפנימי. שכבת העורק במקום התפשטותו. באחד הניסויים, הוזרקו אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס עם קשרי תיאופוספט, המשלימים ל-mRNA המקודדים לחלבונים החשובים למחזור תאי היונקים, לעורקי הצוואר של חולדות לאחר ניתוח אנגיופלסטיקה; כתוצאה מכך, שכיחות ההיצרות החוזרות ירדה ב-90%. שגשוג של תאי שריר חלק מתרחש גם בטרשת עורקים, סוכרת, סיבוכים לאחר ניתוח מעקף כלילי. ככל הנראה, ניתן לשלוט בכל המצבים הללו בדרכים דומות.
אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס יכולים לשמש גם לטיפול בזיהומים ויראליים ומלריה. בנוסף, תוצאות הניסויים הקליניים בשלב I לטיפול במחלת קרוהן באמצעות מתן פומי של אוליגונוקלאוטיד "אנטיסנס" המחישו אפקט טיפולי ברור ללא תופעות לוואי ניכרות. במקרה זה, ה-mRNA היעד קידד להידבקות בין-תאית מסוג 1, המיוצר בעודף בחולים עם מחלת קרוהן. הוא נועד לחקור את היעילות של אותו אוליגונוקלאוטיד לטיפול במחלות דלקתיות אחרות, כגון דלקת מפרקים שגרונית, פסוריאזיס וקוליטיס כיבית.
באופן עקרוני, אוליגונוקלאוטידים "אנטיסנס" יכולים ליצור סליל משולש עם DNA מטרה כרומוזומלי ולחסום שעתוק. עם זאת, הספציפיות של אוליגונוקלאוטידים "אנטיגניים" עדיין לא עומדת בסטנדרטים שאומצו לתרופות.