Нуклеотимды -- фосфорные эфиры нуклеозидов, нуклеозидфосфаты. Свободные нуклеотиды, в частности АТФ, цАМФ, АДФ, играют важную роль в энергетических и информационных внутриклеточных процессах, а также являются составляющими частями нуклеиновых кислот и многих коферментов.
Соединения, состоящие из двух нуклеотидовых молекул, называются динуклеотидами , из трёх -- тринуклеотидами , из небольшого числа -- олигонуклеотидами , а из многих -- полинуклеотидами , или нуклеиновыми кислотами .
Морфолино (англ. Morpholino ) -- синтетические олигонуклеотиды, применяемые в молекулярной биологии для изменения экспрессии генов. Антисмысловые олигомерные морфолино используются для блокировки доступа других молекул к специфическим последовательностям нуклеиновых кислот. Морфолиновые олигонуклеотиды блокируют небольшие одноцепочечные участки (около 25 нуклеотидов) на поверхности молекул РНК .
Антисмысловые олигонуклеотиды представляют собой длинные последовательности нуклеотидов ДНК в хромосомах. Если какой-то ген должен экспрессироваться, то запускается процесс транскрипции этого гена, в результате которого синтезируется мРНК.
Терапевтический эффект синтетических антисмысловых олигонуклеотидов зависит от спецефичности их гибридизации с доступным сайтом м РНК-мишени, устойчивости к действию клеточных нуклеаз и наличию системы доставки в клетку .
На сегодняшний день наиболее эффективное адресное направленное выключение активности определённых участков генома осуществляется антисмысловыми олигонуклеотидами (АОН). Стратегия использования АОН основана на уотсон-криковском взаимодействии молекул ДНК с М-РНК-мишеныо. Образование гетеродуплекса ДНК-МРНК приводит к инактивации М-РНК и последующей остановке синтеза белка.
Иными словами, под антисмысловым механизмом подразумевается связывание олигонуклеотида с комплементарным участком целевой РНК и подавление внутриклеточной функции данной РНК.
Однако, эта простая и привлекательная теоретическая модель в действительности оказалась значительно сложнее. Известны три типа антисмысловых молекул: относительно короткие синтетические олигонуклеотиды; антисмысловые РНК, экспрессирующиеся в клетке после трансфекции антисмысловым геном рибозимы, обладающие каталитической активностью .
Создание препаратов на основе антисмысловых олигонуклеотидов - одно из новейших направлений лекарственных разработок. Эта технология дает исследователю возможность направленно воздействовать практически на любой процесс в клетке с высочайшей специфичностью. Если какой-то белок способствует росту раковой клетки, то, используя соответствующий антисмысловой олигонуклеотид, можно сделать так, что этот белок больше никогда не будет синтезироваться в клетке. Антисмысловые олигонуклеотиды настолько специфичны, что воздействие на какой-либо другой белок в клетке практически исключено. Такая специфичность обеспечит ослабление побочных эффектов, зачастую наблюдаемых при традиционных способах лечения рака.
Механизм инактивации до сих пор до конца не ясен. Но, возможно, это связано с тем, что двунитевая РНК нехарактерна для нормальных клеток. Так как сигналом для синтеза каждого белка является одна единственная мРНК, то такой сигнал для определенного белка можно выключить или «нокаутировать» с помощью такой комплементарной последовательности .
Рис.4 Механизм работы антисмыслового олигонуклеотида
Важной проблемой лечения препаратами на основе антисмысловых олигонуклеотидов является разрушение таких лекарственных средств ферментами клеток - нуклеазами. Олигодезоксонуклеотиды разрушаются нуклеазами, поэтому очень важно защитить их от действия последних так, что бы они не утратили способности гибридизации с мишенью. Для этого проводят электрофоретическое разделение клеточных белков, в которые включают радиоактивную метку во время трансляции, и с помощью радиоавтографии устанавливают, в присутствии какого из «антисмысловых» олигонуклеотидов снижается синтез определенного белка. Никаких общих критериев выбора наилучших сайтов-мишеней в разных РНК-транскриптах не существует. Эффективными могут оказаться олигонуклеотиды, комплементарные 5"- или З"-конпам мРНК, границам экзонов и интро- нов и даже двухцепочечным областям. Олиго- дезоксинуклеотиды разрушаются внутриклеточными нуклеазами, поэтому важно защитить их от действия последних так, чтобы они не утратили способности к гибридизации с мишенью. Для этого можно модифицировать определенным образом пиримидиновые основания и де- зоксирибозу .
Так, у наиболее широко применяющихся сейчас «антисмысловых» олигонуклеотидов свободный атом кислорода фосфодиэфирной связи заменен на сульфо- группу, в результате чего образуется тиофосфатная связь. Модифицированные таким образом олигонуклеотиды растворяются в воде, несут отрицательный заряд и не расщепляются под действием эндонуклеаз. При гибридизации с сайтом-мишенью они образуют РНК--ДНК-дуплексы, которые активируют ри- бонуклеазу (РНКазу) Н, эндогенный фермент, расщепляющий мРНК в гибридной молекуле. Проведены первые клинические испытания таких олигонуклеотидов -- лекарственных средств «первого поколения». Мишенями являются РНК цитомегаловируса, вируса иммунодефицита человека, а также мРНК генов, ответственных за развитие рака, болезней кишечника и других заболеваний .
Синтезированы «антисмысловые» олигонуклеотиды с фосфорамидитной и полиамидной (пептидной) связями. Такие молекулы очень устойчивы к действию нуклеаз. Химические группы, присоединенные к 2"-угле- родному атому сахарного остатка и С-5-атому пиримидинов, также защищают «антисмысловые» олигонуклеотиды и облегчают их связывание с сайтом-мишенью). Все преимущества этих и других модификаций сейчас интенсивно изучаются.
Олигонуклеотид – это короткий фрагмент нуклеиновой кислоты менее 50 нуклеотидов в длину. В течение последних 20 лет, смысл расширился, чтобы включать в себя все химически синтезированные нуклеиновые кислоты, независимо от длины. Первая публикация о направленном химическом синтезе олигонуклеотида появилась в 1955 году.
С тех пор, миллионы олигонуклеотидов синтезируются каждый год для использования в лабораториях по всему миру. Для большинства исследований нужны лишь небольшие количества ДНК. Гораздо большее количество ДНК (10 мкмоль или более) необходимы для использования в биофизических исследованиях (ЯМР и рентгеновской кристаллографии) поэтому, чтобы обеспечить синтез столь больших количеств, были разработаны методы твердофазного синтеза, что позволяет использовать олигонуклеотиды в качестве молекул лекарственного средства (например, антисмысловые олигонуклеотиды).
Синтез ДНК или РНК олигонуклеотидов относится к химическому синтезу фрагментов нуклеиновых кислот с определенными химическими структурами или последовательностей в различных размерах.
Рис.1. Структуры олигонуклеотидов.
Принцип твердофазного синтеза впервые был разработан и применен для синтеза полипептидов Роберта Брюса Меррифилда, американского биохимика, который получил Нобелевскую премию по химии в 1984 году за изобретение твердой фазы синтеза пептидов. Он понял, что ключ к успешному синтезу заключается в закреплении первого мономера к нерастворимой полимерной твердой фазе. Другие мономеры затем могут быть соединены, один за другим, к неподвижному терминальному концу растущего полимера. В конце синтеза, завершенная полимерная цепь может быть отсоединена от нерастворимого полимера и очищена. Этот процесс был оптимизирован на протяжении многих лет, чтобы стать высокоэффективным и теперь стал принципиально важным методом, используемым в автоматизированных олигонуклеотидных синтезаторах.
Для обеспечения успешного синтеза олигонуклеотидов необходимы следующие условия:
- Все реагенты должны быть растворимы в неводных растворителях.
- Амино- и гидроксильные группы нуклеотидных оснований и углеводных остатков должны быть соответствующим образом блокированы.
- Защитные группы, введенные в процессе синтеза, должны быть стабильными в условиях удлинения цепи при образовании межнуклеотидной фосфодиэфирной связи.
- Защитные группы должны быть достаточно лабильными, чтобы их можно было удалить в конце синтеза, не повредив продуктов реакции.
Функции олигонуклеотидов и перспективы их применения
В настоящее время олигонуклеотиды и их аналоги широко используются в различных областях, таких как медицина и в молекулярно-биологических исследованиях, а также рассматриваются в качестве перспективных терапевтических средств и зондов для молекулярной диагностики.
За последние 20 лет относительно хорошо были изучены только два типа аналогов нуклеиновых кислот с формально электронейтральным остовом – пептидные нуклеиновые кислоты и фосфордиамидные морфолиноолигонуклеотиды. Аналоги обоих типов способны к комплементарному связыванию с природными молекулами ДНК и РНК, и в силу этого они нашли применение как в молекулярной биологии, так и, в особенности, в медицине в качестве потенциальных лекарственных препаратов.
Кроме того, с развитием ДНК-технологий появилась возможность изучения экспрессии известных генов, определения мутаций в геномах различных организмов и проведения диагностики ряда инфекционных заболеваний. В решении этих задач наиболее перспективным является использование ДНК-чипов, представляющих собой небольшие пластины с нанесенными на их поверхность фрагментами ДНК.
Способ создания ДНК-чипов объединяет методы, основанные на адресном синтезе олигонуклеотидов непосредственно на поверхности чипа. Синтез проводят путем поэтапного добавления к растущей олигонуклеотидной цепи нуклеотидов, содержащих на 5’-конце лабильную защитную группу, снятие которой возможно под действием светового излучения, электрического напряжения или в ходе кислотного гидролиза.
Показано, также, что ген-направленные олигонуклеотиды, в зависимости от выбранного гена-мишени, отличаются значительным разнообразием модулирующих эффектов на опухолевые ткани, начиная от замедления и остановки пролиферации опухолевых клеток и заканчивая подавлением их инвазивных свойств.
Противоопухолевые препараты на основе нуклеиновых кислот представляют собой высокоспецифичный инструмент модуляции экспрессии генов. Подавление ряда генов, аномально высокая экспрессия которых возникает при неопластической трансформации, можно осуществить с помощью препаратов на основе нуклеиновых кислот, таких как антисмысловые олигонуклеотиды (asON). В общем, механизм подавления экспрессии генов заключается в их комплементарном связывании с мРНК-мишенью, после чего целевая мРНК либо подвергается расщеплению, либо блокируется процесс ее трансляции.
asON представляют собой синтетические одноцепочные ДНК длиной 15-20 нуклеотидов. В последнее время были получены asON, способные препятствовать транспорту сплайсированной мРНК из ядра в цитоплазму, а также asON, которые в результате блокирования сайта сплайсинга в пре-мРНК способны приводить к экспрессии альтернативного варианта белка.
Ввиду того, что природные олигодезоксирибонуклеотиды в культуре клеток и в условиях in vivo подвергаются быстрой деградации под действием нуклеаз, для повышения их стабильности в структуру asON вводят различные химические модификации.
Химический синтез олигонуклеотидов
Твердофазный синтез широко используется в синтезе пептидов, синтезе олигонуклеотидов, синтезе олигосахаридов и комбинаторной химии. Твердофазный химический синтез был изобретен в 1960-е годы Брюсом Меррифилдом, и был удостоен Нобелевской премии по химии в 1984 году.
Твердофазный синтез осуществляют на твердом носителе, между фильтрами, в столбцах, которые пропускают все реагенты и растворители. Твердофазный синтез имеет ряд преимуществ по сравнению с синтезом в растворе:
обеспечивает высокую скорость реакции
примеси и избыток реагентов смываются, поэтому очистка после каждого шага не требуется
процесс поддается автоматизации на твердофазных синтезаторах с компьютерным управлением.
Твердые носители (называемые также смолами) представляют из себя нерастворимые в воде частицы, как правило, 50-200 мкм в диаметре, к которым олигонуклеотид присоединяется в процессе синтеза.
Имеются данные, что одним из наиболее эффективных материалов, которые можно использовать в качестве твердого носителя, является пористое стекло. Оно достаточно жесткое и не способно к набуханю. В его глубоких порах, происходит синтез олигонуклеотидов. Стекло содержит 500 Å (50 нм) поры, которые подходят для синтеза коротких олигонуклеотидов. Тем не менее, оно плохо подходит для синтеза олигонуклеотидов более 40 оснований в длину. Это связано с тем, что растущий олигонуклеотид блокирует поры и уменьшает диффузию реагентов через матрицу.
Твердые носители для обычного синтеза олигонуклеотидов, как правило, изготовлены с нагрузкой 20-30 мкмоль нуклеозида на грамм смолы. Синтез олигонуклеотидов при более высоких нагрузках становится менее эффективным вследствие стерических затруднений между соседними цепями ДНК, присоединенных к смоле.
Этапы химического синтеза олигонуклеотидов
Фосфорамидатный олиго-синтез протекает в 3′- к 5′-направлении (противоположном 5′- к 3′-направлении биосинтеза ДНК в репликации ДНК). Один нуклеотид добавляется за синтез цикла.
Рис. 2. Фосфорамидатный олигонуклеотидный цикл синтеза
В начале олигонуклеотидного синтеза первый нуклеозид предварительно присоединяют к смоле (носителю), и выбираются колонны синтеза A, G, C или T в зависимости от нуклеозида на 3′-конце желаемого олигонуклеотида. Закрепленный нуклеозид имеет 5′-ДMT защитную группу (ДМТ = 4,4′-диметокситритил), роль которой состоит в предотвращении полимеризации, и эта защитная группа должна быть удалена (детритилирование). Механизм детрилирования показан на рисунке 3.
Рис.3. Механизм удаления защитной группы.
После детритилирования, закрепленный нуклеозид готов реагировать со следующим основанием, который добавляется в виде нуклеозид-фосфорамидатного мономера. Большой избыток соответствующего нуклеозида, смешивают с активатором (тетразолом или его производными). Диизопропиламиногруппа нуклеозида протонируется активатором, и, таким образом, превращается в хорошо отсоединяющуюся группу. Она быстро вытесняется 5′-гидроксильной группой связанного нуклеозида, создавая фосфит триэфир (рис. 4).
Рис.4. Механизм протонирования активатором.
Нуклеозидные фосфорамидиты достаточно стабильны в инертной атмосфере, и могут быть получены в больших количествах, доставляться по всему миру, и храниться в виде сухого твердого вещества в течение нескольких месяцев перед использованием.
Однако даже при высокоточных работах по синтезу олигонуклеотидов, остается вероятность, что там будет несколько непрореагировавших 5′-гидроксильных групп, которые будут доступны для участия в следующей стадии. Если подобное нарушение не остановить, они будут накапливаться с каждым последующим циклом, и конечный продукт будет сложной смесью олигонуклеотидов, большинство из которых будет нести неправильную генетическую информацию.
Поэтому метод ацетилирования 5′-гидроксильных групп делает их инертным по отношению к последующей реакции. Это необходимо также и для минимизации примесей.
Фосфит-триэфир (Р (III)), образованный на стадии присоединения неустойчив к кислотам и должен быть преобразован в стабильную форму (P (V)). Это достигается за счет окисления йода в присутствии воды и пиридина (рис. 5). Полученный фосфотриэфир фактически представляет собой ДНК ось, защищенную 2-цианоэтил группой. Группа цианоэтила предотвращает нежелательные реакции с фосфором во время последующих циклов синтеза.
Рис.5. Механизм окислительной стадии.
После этого, ДМТ-защитная группа на 5′-конце цепи ДНК должна быть удалена так, чтобы первичная гидроксильная группа могла вступить в реакцию со следующим нуклеотид-фосфорамидатом. Реакция удаления защитной группы с помощью трихлоруксусной кислоты в дихлорметане протекает быстро. Цикл повторяется, один раз для каждой основы, до получения требуемого олигонуклеотида.
Далее необходимо отсоединить синтезированный олигонуклеотид от твердого носителя. В этом случае используется сукцинил. Разделение возможно при обработке концентрированным водным раствором аммиака при комнатной температуре в течение одного часа (рис. 6).
Рис.6. Механизм отделения олигонуклеотида от твердого носителя в концентрированном водном растворе аммиака.
Реакция расщепления осуществляется автоматически на некоторых синтезаторах, и аммиачный раствор, содержащий олигонуклеотид, поступает в стеклянный флакон. В качестве альтернативы, расщепление может быть осуществлено вручную путем принятия колонки от синтезатора и промыванием в шприцах, содержащих гидроксид аммония.
Олигонуклеотид растворяется в концентрированном водном растворе аммиака, а последующий нагрев позволяет удалить защитные группы из гетероциклических оснований и фосфатов. Водный раствор затем удаляют выпариванием и олигонуклеотид готов к очистке.
Кроме ДМТ-защитной группы, необходимы также дополнительные защитные группы и для аденина, цитозина и гуанина (рис.7). Однако для тимина в этом нет необходимости.
Рис.7. Структуры защитных групп, обычно используемые для защиты адениновых, цитозиновых и гуаниновых оснований во время фосфорамидатного синтеза ДНК олигонуклеотидов.
Выводы
1. Искусственно синтезированные олигонуклеотиды находят все более широкое применение в различных областях науки, а методы их получения все более совершенствуются, что позволяет синтезировать достаточное количество олигонуклеотидов для лабораторных экспериментов и для создания терапевтических препаратов.
2. На сегодняшний день, самым распространенным методом синтеза олигонуклеотидов остается метод твердофазного синтеза, который позволяет существенно ускорять процесс получения олигонуклеотидов, а также уменьшать объемы затраченных реактивов.
5507 0
Этого можно достичь несколькими способами: гибридизацией соответствующего олигонуклеотида со специфическим геном или мРНК, блокированием фактора транскрипции белка, уменьшением количества мРНК в результате расщепления РНК-ферментами и т.п. Рассмотрим принципы некоторых из них.
Рибоолигонуклеотид, который связывается с определенной мРНК и тем самым ингибирует трансляцию кодируемого ею белка, называется «антисмысловой» мРНК. Этот механизм используют некоторые бактерии для регулирования генов (рис. 3.20). На практике применяют искусственно сконструированные гены, у которых ДНК-вставка находится в такой ориентации, чтобы их транскрипты были антисмысловыми по отношению к мРНК-мишени (рис. 3.21).
Рис. 3.20. Регулирование гена бактериоферритина (bfr) с помощью антисмысловой РНК
Рис. 3.21. Ингибирование трансляции мРНК синтетическим антисмысловым олигонуклеотидом
Было показано, что возможно использование синтетических антисмысловых олигонуклеотидов, однако их терапевтический эффект будет сильно зависеть от их устойчивости к действию клеточных нуклеаз, системы доставки и специфичности их гибридизации. Для определения наиболее эффективных сайтов-мишеней на специфической мРНК производят тестирование набора антисмысловых олигонуклеотидов длиной 15-20 оснований с культурой клеток, синтезирующих мРНК-мишень. Состав синтезированных белков определяют электрофорезом и устанавливают, введение какого олигонуклеотида приводит к снижению синтеза белка-мишени.
Для защиты от нуклеазного расщепления синтезируются модифицированные олигонуклеотиды, при этом не утратившие способность гибридизоваться. На рис. 3.22 приведены структуры модифицированных нуклеотидов, эффективность которых интенсивно изучается. Например, показано, что олигонуклеотиды с заменой свободного кислорода фосфодиэфирной связи на серу (структура б) эффективно гибридизуются с комплементарной РНК-мишенью и полученные РНК-ДНК дуплексы активируют внутриклеточную рибонуклеазу Н.
Этот эндогенный фермент, гидролизует РНК-последовательность в таких гибридах. С такими олигонуклеотидами уже проведены многообещающие клинические испытания, в которых мишенями являлись РНК цитомегаловируса, ВИЧ, некоторых РНК, ответственных за развитие рака.
Рис. 3.22. Модификации олигонуклеотидов: а - нормальная фосфодиэфирная связь; б - тиофосфатная связь; в - фосфамидная связь; г - 2"-0-метилрибоза; д - С-5-пропинилцитозин
Для эффективной доставки антисмысловых олигонуклеотидов их часто пакуют в липосомы, в свою очередь модифицированные специфическими лигандами, обеспечивающими адресную доставку (такой прием мы уже встречали, когда рассматривали способы невирусной доставки терапевтических генов). К настоящему времени проведен ряд испытаний и показана высокая терапевтическая эффективность антисмысловых олигонуклеотидов для подавления нежелательной пролифирации гладкомышечных клеток (осложнения после ангинопластики, коронарного шунтирования, атеросклероз), для лечения вирусных инфекций и малярии.
Принцип действия и строение рибозимов - природных РНК, обладающих нуклеазной активностью, показан на рис. 3.23.
Обнаружено, что эти короткоцепочечные РНК способны эффективно подавлять экспрессию вирусных генов, онкогенов, факторов роста и других терапевтически важных генов, расщепляя их мРНК. Модифицируя субстрат-связывающую последовательность, можно получать рибозимы, специфичные к определенной мРНК. Рибозимы можно синтезировать непосредственно в клетке транскрипцией синтетического олигодезоксирибонуклеотида, кодирующего каталитический домен и фланкирующие его гибридизующиеся участки.
Рис. 3.23. Расщепление мРНК под действием рибозимов. Стрелкой показан сайт расщепления
Такой олигонуклеотид встраивают в эукариотический экспрессирующий вектор и помещают в клетку. Образующаяся РНК самопроизвольно приобретает активную конформацию, так называемую форму «головки молотка». Множество рибозимов различной структуры и активности синтезировано химически. Например, в лаборатории нуклеиновых кислот Института химической биологии и экспериментальной медицины СО РАН (Новосибирск) проводятся многолетние исследования по получению синтетических рибозимов, обладающих повышенной активностью и стабильностью.
Для повышения защиты от преждевременного расщепления внутриклеточными нуклеазами получают различные производные рибозимов - с метилированными 2"-гидроксильными (см. рис. 3.22, г) группами, бинарные конструкции и т.п. Строение молекулы рибозима существенным образом влияет на его эффективность. На рис. 3.24 показана кинетика расщепления мРНК гена множественной лекарственной устойчивости mdr1 с помощью синтезированных рибозимов разной структуры.
Рис. 3.24. Расщепление 190-звенного 5"-концевого фрагмента MDR1 мРНК модифицированными бинарными (1,3) и полноразмерными (2,4) рибозимами: а - структура РНК с выделенным специфическим сайтом; б - накопление продуктов расщепления (материалы предоставлены А.Г. Веньяминовой, ИБХиФМ, Новосибирск)
Особое место в молекулярной терапии занимают так называемые методы активирования пролекарств. Например, одним из способов генной терапии рака является уничтожение опухолевых клеток с помощью активированного производного ганцикловира (GCV, производное гуанозина), продукта гена тимидинкиназы, из уже упомянутого нами вируса простого герпеса HSVtk.
Опухолевые клетки трансфецируют in vivo геном HSVtk под активным промотором и через несколько дней вводят ганцикловир, который фосфорилируется вирусной тимидинкиназой до монофосфата, а затем киназами клетки-хозяина до трифосфата. Это производное ингибирует ДНК-полимеразу и останавливает синтез ДНК, что приводит к гибели пролифилирующих клеток. Через межклеточные контакты ганцикловиртрифосфат проникает в соседние немодифицированные клетки и таким образом уничтожается дополнительно до десятка опухолевых клеток.
Ген, приводящей к гибели собственной клетки, называется геном «самоубийства» (в нашем случае это ген тимидинкиназы), а термин «пролекарство» относится к неактивной форме лекарственного вещества (в данном случае это ганцикловир). Этот подход был использован и для создания других вариантов комбинации генактиватор-пролекарство, но эффективность системы GCV-HSVtk уже доказана рядом доклинических испытаний.
Генная терапия является новой лечебной дисциплиной, становление которой происходит на наших глазах. Несмотря на некоторые успехи и многообещающие перспективны, существует ряд проблем, которые еще предстоит преодолеть.
Часть проблем лежит далеко не в плоскости медицины и молекулярной биологии. Речь идет о проблемах этических и политических. Как вы уже заметили, мы рассматривали методы генетической терапии только соматических клеток. Это означает, что произведенные коррекции ограничиваются определенным органом или тканью, «исправленные» гены не будут передаваться следующему поколению. Изменения генотипа зародышевых клеток (сперматозоидов или яйцеклеток) или оплодотворенных клеток должны передаваться из поколения в поколение.
В настоящее время генная терапия соматических клеток отнесена к стандартным методам медицинского вмешательства. В противоположность этому генная терапия зародышевых клеток является технологически гораздо более сложной, проблематичной и непредсказуемой. Поэтому эксперименты в этой области во многих странах запрещены.
В конце 80-х гг. в США были установлены правила, регулирующие испытания в области генетической терапии соматических клеток. Они гарантируют беспристрастный и репрезентативный отбор больных и их информированность (насколько опасно лечение, какова вероятность его успеха и пр.), конфиденциальность сведений о больных и произведенных исследованиях, осуществление всех манипуляций должным образом без причинения вреда, как конкретным больным, так и человеческой популяции в целом.
Поскольку лечение соматических клеток приводит к улучшению состояния и значительному продлению жизни больных с генетическими заболеваниями, но «улучшенный» ген не передается по наследству, существует мнение, что это приведет к накапливанию генетических заболеваний в человеческой популяции. Однако, по данным популяционной генетики, для существенного повышения частоты вредного гена в результате эффективного лечения требуются тысячи лет.
Н.А. Воинов, Т.Г. Волова
В большинстве методов генной терапии ех vivo и in vivo используются клонированные генетические конструкции, возмещающие функциональную форму белка, который не синтезируется в организме больного или синтезируется в дефектной форме. Однако многие заболевания человека (рак, воспаления, вирусные и паразитарные инфекции) связаны, напротив, с гиперпродукцией нормального белка. Для лечения таких состояний разработаны терапевтические
системы с использованием специфических олигонуклеотидов. Такой небольшой олигонуклеотид может гибридизоваться со специфическим геном или мРНК и снижать уровень транскрипции или трансляции, уменьшая тем самым количество синтезируемого белка, ответственного за патологию. Олигонуклеотид, который гибридизуется с самим геном и блокирует его транскрипцию, называется «антигенным», а тот, который гибридизуется с соответствующей мРНК, - «антисмысловым» (Antisense RNA). Для предотвращения активации транскрипции специфических генов можно так-же использовать двухцепочечные олигонуклеотиды, специфично присоединяющиеся к ДНК-связывающим белкам (белкам-активаторам). Наконец, для уменьшения количества определенной мРНК и синтезируемого на ней белка можно использовать рибозимы - природные РНК-последовательности, которые связываются со специфическими молекулами РНК и разрезают их.
В будущем лекарственные средства на основе нуклеиновых кислот, по-видимому, найдут широкое применение, при этом главным объектом научных исследований и клинических испытаний будут различные «антисмысловые» олигонуклеотиды.
3.1..«Антисмысловые» олигонуклеотиды как лекарственные средства
«Антисмысловая» РНК (Antisense RNA), которую предполагается использовать в качестве лекарственного средства, представляет собой короткий (15-20-нуклеотидов) олигонуклеотид, который может связываться с комплементарным ей определенным участком мРНК и ингибировать трансляцию кодируемого ей белка, подавляя тем самым патологический процесс (рис.2).
Терапевтический эффект синтетических «антисмысловых» олигонуклео-тидов зависит от специфичности их гибридизации с доступным сайтом мРНК-мишени, устойчивости к действию клеточных нуклеаз и наличия системы доставки в клетку. 15-20-нуклеотидные последовательности гибридизуются с уникальными мРНК с достаточно высокой специфичностью. Потенциальные сайты-мишени определяют тестированием набора «антисмысловых» олигонуклеотидов с использованием культуры клеток, синтезирующих мРНК-мишень. Для этого проводят электрофоретическое разделение клеточных белков, в которые включают радиоактивную метку во время трансляции, и с помощью радиоавтографии устанавливают, в присутствии какого из «антисмысловых» олигонуклеотидов снижается синтез определенного белка. Никаких общих критериев выбора наилучших сайтов-мишеней в разных РНК-транскриптах не существует. Эффективными могут оказаться олигонуклеотиды, комплементарные 5"- или 3"-концам мРНК, границам экзонов и интронов и даже двухцепочечным областям. Антисмысловые олигонуклеотиды могут разрушаться внутриклеточными нуклеазами, поэтому важно защитить их от действия последних так, чтобы они не утратили способности к гибридизации с мишенью. Для этого можно модифицировать определенным образом пиримидиновые основания, рибозу или дезоксирибозу (рис.3). Так, у наиболее широко применяющихся сейчас «антисмысловых» олигонуклеотидов свободный атом кислорода фосфодиэфирной связи заменен на группу SH (рис. 3Б), в результате чего образуется тиофосфатная связь. Модифицированные таким образом олигонуклеотиды растворяются в воде, несут отрицательный заряд и не расщепляются под действием эндонуклеаз. При гибридизации с сайтом-мишенью они образуют дуплексы, которые активируют рибонуклеазу (РНКазу), эндогенный фермент, расщепляющий мРНК в такой гибридной молекуле. Проведены первые клинические испытания таких олигонуклеотидов - лекарственных средств «первого поколения». Мишенями являются РНК цитомегаловируса, вируса иммунодефицита человека, а также мРНК генов, ответственных за развитие рака, болезней кишечника и других заболеваний.
Синтезированы «антисмысловые» олигонуклеотиды с фосфорамидитной и полиамидной (пептидной) связями - пептидные нуклеиновые кислоты (Peptide nucleicacids, PNAs) (рис.3В и Г ). Такие молекулы очень устойчивы к действию нуклеаз. Химические группы, присоединенные к 2"-углеродному атому сахарного остатка и С-5-атому пиримидинов, также защищают «антисмысловые» олигонуклеотиды и облегчают их связывание с сайтом-мишенью (рис. 32Д и Е ). Все преимущества этих и других модификаций сейчас интенсивно изучаются.
Проникновение «антисмыловых» олигонуклеотидов в клетку можно значительно облегчить, поместив их в липосомы. Такая высокоэффективная система доставки позволяет использовать «антисмысловые» олигонуклеотиды в небольших концентрациях. Если же конъюгировать липосомы с антителами, специфичными к эпитопам определенных клеток тех или иных органов, то можно будет осуществлять адресную доставку «антисмысловых» олигонуклеотидов.
Проведенные доклинические испытания оказали, что «антисмысловые» олигонуклеотиды являются весьма эффективными лекартвенными средствами. Изучена возможность их применения для лечения стеноза коронарых и сонных артерий, который приводит к инфарктам и инсультам. В этих случаях часто прибегают к ангиопластике, расширению артерий с помощью баллонного катетера, но примерно у 40% больных через 6 месяцев вновь возникают стенозы, поскольку ангиопластика стимулирует пролиферацию гладкомышечных клеток и секрецию межклеточного вещества во внутренний слой артерии в месте ее расширения. В одном из экспериментов в сонные артерии крыс после ангиопластики вводили антисмысловые» олигонуклеотиды с тиофосфатными связями, комплементарные мРНК, которые кодируют важные для клеточного циклa млекопитающих белки; в результате частота повторных стенозов уменьшилась на 90%. Пролиферация гладкомышечных клеток происходит также при атеросклерозе, сахарном диабете, осложнениях после коронарного шунтирования. Вероятно, все эти состояния можно будет контролировать аналогичными способами.
«Антисмыловые» олигонуклеотиды можно применять и для лечения вирусных инфекций и малярии. Кроме того, результаты I фазы клинических испытаний лечения болезни Крона с помощью орального введения «антисмыслового» олигонуклеотида проиллюстрировали четко выраженный терапевтический эффект без заметных побочных эффектов. В этом случае мРНК-мишень кодировала межклеточный адгезии типа 1, который вырабатывается в избытке у пациентов с болезнью Крона. Предполагается исследовать эффективность этого же олигонуклеотида для терапии других воспалительных заболеваний, например ревматоидного артрита, псориаза и язвенного колита.
В принципе «антисмысловые» олигонуклеотиды могут образовывать тройную спираль с хромосомной ДНК-мишенью и блокировать транскрипцию. Однако пока специфичность «антигенных» олигонуклеотидов не соответствует стандартам, принятым для лекарственных средств.
«Антисмысловая» РНК (Antisense RNA), которую предполагается использовать в качестве лекарственного средства, представляет собой короткий (15-20-нуклеотидов) олигонуклеотид, который может связываться с комплементарным ей определенным участком мРНК и ингибировать трансляцию кодируемого ей белка, подавляя тем самым патологический процесс (рис.2).
Терапевтический эффект синтетических «антисмысловых» олигонуклео-тидов зависит от специфичности их гибридизации с доступным сайтом мРНК-мишени, устойчивости к действию клеточных нуклеаз и наличия системы доставки в клетку. 15-20-нуклеотидные последовательности гибридизуются с уникальными мРНК с достаточно высокой специфичностью. Потенциальные сайты-мишени определяют тестированием набора «антисмысловых» олигонуклеотидов с использованием культуры клеток, синтезирующих мРНК-мишень. Для этого проводят электрофоретическое разделение клеточных белков, в которые включают радиоактивную метку во время трансляции, и с помощью радиоавтографии устанавливают, в присутствии какого из «антисмысловых» олигонуклеотидов снижается синтез определенного белка. Никаких общих критериев выбора наилучших сайтов-мишеней в разных РНК-транскриптах не существует. Эффективными могут оказаться олигонуклеотиды, комплементарные 5"- или 3"-концам мРНК, границам экзонов и интронов и даже двухцепочечным областям. Антисмысловые олигонуклеотиды могут разрушаться внутриклеточными нуклеазами, поэтому важно защитить их от действия последних так, чтобы они не утратили способности к гибридизации с мишенью. Для этого можно модифицировать определенным образом пиримидиновые основания, рибозу или дезоксирибозу (рис.3). Так, у наиболее широко применяющихся сейчас «антисмысловых» олигонуклеотидов свободный атом кислорода фосфодиэфирной связи заменен на группу SH (рис. 3Б), в результате чего образуется тиофосфатная связь. Модифицированные таким образом олигонуклеотиды растворяются в воде, несут отрицательный заряд и не расщепляются под действием эндонуклеаз. При гибридизации с сайтом-мишенью они образуют дуплексы, которые активируют рибонуклеазу (РНКазу), эндогенный фермент, расщепляющий мРНК в такой гибридной молекуле. Проведены первые клинические испытания таких олигонуклеотидов - лекарственных средств «первого поколения». Мишенями являются РНК цитомегаловируса, вируса иммунодефицита человека, а также мРНК генов, ответственных за развитие рака, болезней кишечника и других заболеваний.
Синтезированы «антисмысловые» олигонуклеотиды с фосфорамидитной и полиамидной (пептидной) связями - пептидные нуклеиновые кислоты (Peptide nucleicacids, PNAs) (рис.3В и Г ). Такие молекулы очень устойчивы к действию нуклеаз. Химические группы, присоединенные к 2"-углеродному атому сахарного остатка и С-5-атому пиримидинов, также защищают «антисмысловые» олигонуклеотиды и облегчают их связывание с сайтом-мишенью (рис. 32Д и Е ). Все преимущества этих и других модификаций сейчас интенсивно изучаются.
Проникновение «антисмыловых» олигонуклеотидов в клетку можно значительно облегчить, поместив их в липосомы. Такая высокоэффективная система доставки позволяет использовать «антисмысловые» олигонуклеотиды в небольших концентрациях. Если же конъюгировать липосомы с антителами, специфичными к эпитопам определенных клеток тех или иных органов, то можно будет осуществлять адресную доставку «антисмысловых» олигонуклеотидов.
Проведенные доклинические испытания оказали, что «антисмысловые» олигонуклеотиды являются весьма эффективными лекартвенными средствами. Изучена возможность их применения для лечения стеноза коронарых и сонных артерий, который приводит к инфарктам и инсультам. В этих случаях часто прибегают к ангиопластике, расширению артерий с помощью баллонного катетера, но примерно у 40% больных через 6 месяцев вновь возникают стенозы, поскольку ангиопластика стимулирует пролиферацию гладкомышечных клеток и секрецию межклеточного вещества во внутренний слой артерии в месте ее расширения. В одном из экспериментов в сонные артерии крыс после ангиопластики вводили антисмысловые» олигонуклеотиды с тиофосфатными связями, комплементарные мРНК, которые кодируют важные для клеточного циклa млекопитающих белки; в результате частота повторных стенозов уменьшилась на 90%. Пролиферация гладкомышечных клеток происходит также при атеросклерозе, сахарном диабете, осложнениях после коронарного шунтирования. Вероятно, все эти состояния можно будет контролировать аналогичными способами.
«Антисмыловые» олигонуклеотиды можно применять и для лечения вирусных инфекций и малярии. Кроме того, результаты I фазы клинических испытаний лечения болезни Крона с помощью орального введения «антисмыслового» олигонуклеотида проиллюстрировали четко выраженный терапевтический эффект без заметных побочных эффектов. В этом случае мРНК-мишень кодировала межклеточный адгезии типа 1, который вырабатывается в избытке у пациентов с болезнью Крона. Предполагается исследовать эффективность этого же олигонуклеотида для терапии других воспалительных заболеваний, например ревматоидного артрита, псориаза и язвенного колита.
В принципе «антисмысловые» олигонуклеотиды могут образовывать тройную спираль с хромосомной ДНК-мишенью и блокировать транскрипцию. Однако пока специфичность «антигенных» олигонуклеотидов не соответствует стандартам, принятым для лекарственных средств.