Завершаем цикл статей об онкологических заболеваниях.
Сегодня подробно расскажет, что такое молекулярное тестирование и как оно влияет на постановку диагноза.

На фото: Владислав Милейко, руководитель направления ,
биомедицинский холдинг «Атлас».

Чтобы понять, как работает молекулярная диагностика и какое место она занимает в онкологии, нужно сначала разобраться в механизмах, происходящих в опухоли.

Молекулярные процессы в опухоли

Мутации в протоонкогенах и генах-супрессорах, отвечающие за деление и смерть клетки, приводят к тому, что клетка перестает следовать инструкции и синтезирует белки и ферменты неправильно. Молекулярные процессы выходят из-под контроля: клетка постоянно делится, отказывается умирать и копит генетические и эпигенетические мутации. Поэтому злокачественные новообразования часто называют болезнью генома.

В клетках опухоли могут происходить сотни тысяч мутаций, но только несколько из них способствуют росту, генетическому разнообразию и развитию опухоли. Они называются драйверными (driver). Остальные мутации, «пассажирские» (passanger), сами по себе не делают клетку злокачественной.

Драйверные мутации создают различные популяции клеток, что обеспечивает разнообразие опухоли. Эти популяции или клоны по-разному реагируют на лечение: некоторые из них устойчивы и приводят к рецидиву. К тому же разная чувствительность клонов к терапии может привести к радикальному изменению молекулярного профиля в ходе лечения: даже незначительные в начале популяции клетки могут получить преимущество и стать доминирующими в конце лечения, что приведет к устойчивости и развитию опухоли.

Молекулярная диагностика

Драйверные мутации, изменения в количестве или структуре белков используют в качестве биомаркеров - мишеней, по которым подбирают лечение. Чем больше мишеней известно, тем более точным может быть выбор из потенциально эффективных схем лечения.

Отделить драйверные мутации от остальных и определить молекулярный профиль опухоли непросто. Для этого применяется технология секвенирования, флуоресцентной гибридизации in situ (FISH), микросателлитного анализа и иммуногистохимии.

Методы секвенирования нового поколения позволяют выявить драйверные мутации, включая те, что делают опухоль чувствительной к таргетной терапии.

С помощью технологии FISH подкрашивают участки хромосом, на которых расположен определенный ген. Две соединенные разноцветные точки - это химерный или слитый ген: когда в результате перестройки хромосом вместе соединяются участки разных генов. Это может привести к тому, что онкоген попадет под влияние регуляции другого более активного гена. Например, слияние генов EML4 и ALK имеет ключевое значение в случае рака легкого. Протоонкоген ALK активируется под влиянием своего «партнера» по перестройке, что приводит к неконтролируемому делению клеток. Онколог, учитывая перестройку, может применить лекарство, которое будет направлено против активированного продукта гена ALK (Кризотиниб).

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH).

Микросателлитный анализ показывает степень нарушения системы репарации ДНК, а иммуногистохимия - белковые биомаркеры, расположенные на поверхности, в цитоплазме и ядрах опухолевых клеток.

Все эти исследования входят в новый продукт биомедицинского холдинга «Атлас» - тест Solo. С помощью такого теста онколог получает информацию о молекулярном профиле опухоли и о том, как он влияет на потенциальную эффективность широкого спектра противоопухолевых препаратов.

Специалисты Solo исследуют до 450 генов и биомаркеров, чтобы оценить, как опухоль может ответить на применение более таргетных препаратов для лечения онкологических заболеваний. Для некоторых из них анализ биомаркера продиктован производителем. Для других используют данные клинических исследований и рекомендации международных сообществ онкологов.

Помимо выбора мишеней для таргетной терапии, молекулярное профилирование помогает обнаружить мутации, которые напротив, делают опухоль устойчивой к определенному лечению, или генетические особенности, которые связаны с повышенной токсичностью и требуют индивидуального подбора дозы лекарства.

Для исследований используется материал биопсии или парафинизированные блоки послеоперационного материала.

Молекулярное профилирование дает дополнительную информацию о заболевании, но она не всегда применима для выбора лечения. Например, в ситуациях, когда стандартная терапия обладает достаточной эффективностью или показано хирургическое лечение. Можно определить клинические ситуации когда такое исследование может быть наиболее полезно:

• Редкий вид опухоли;
• Опухоли с неустановленным первичным очагом (неизвестно, где изначально появилась опухоль, давшая метастазы);
• Тех случаев, когда требуется выбор из нескольких вариантов применения таргетной терапии;
• Исчерпаны возможности стандартной терапиии требуется экспериментальное лечение или включение пациента в клинические исследования.

Специалисты проекта Solo консультируют онкологов или пациентов и подсказывают, нужен ли тест в данном случае.

Прецизионная медицина и клинические исследования

Обычно в медицинской практике применяют общие стратегии для лечения пациентов с определенным диагнозом. Для мелкоклеточного рака легкого используется одна стратегия, для немелкоклеточного - другая. Для онкологических заболеваний этот метод подходит не всегда. Из-за различий на молекулярном уровне даже при одном и том же типе опухоли пациенты могут получить неэффективное или лишнее лечение.

С увеличением исследований и изобретением таргетных препаратов, подход к лечению онкологических заболеваний начал меняться. Чтобы увеличить безрецидивный период и продолжительность жизни пациента, нужно учитывать молекулярный профиль опухоли, ответ организма на лекарственные препараты и химиотерапию (фармакогеномика), знать главные биомаркеры.

Прецизионная медицина позволяет существенно улучшить прогноз конкретного пациента, избежать серьезных побочных эффектов онкологических препаратов и значительно повысить качество жизни больного. Но и у этого метода существуют недостатки.

Таргетных препаратов становится все больше, и они имеют два основных ограничения: большинство молекулярно-направленных агентов обеспечивают лишь частичное подавление сигнальных путей и многие из них слишком токсичны для использования в комбинации.

Представьте, что вы архитектор Москвы. Перед вами стоит непростая задача - решить проблему с пробками в час пик, построив один мост. Молекулярные механизмы можно сравнить с движением машин, а мост - главный препарат, который должен решить основную проблему. Кажется, что несколько лекарств (серия мостов), направленные на главные молекулярные нарушения, могут решить эту проблему. Но токсичность препаратов при этом увеличивается и может быть непредсказуемой.

Мы стали лучше понимать молекулярные процессы злокачественных опухолей, но текущие методы внедрения точной онкологии в клиническую практику сильно отстают. Чтобы ускорить изучение таргетной терапии, ученые разработали два новых подхода - Basket и Umbrella.

Суть метода Basket в том, что для исследования выбирают пациентов с определенным биомаркером, независимо от расположения и названия опухоли. В мае 2017 года FDA одобрила такой метод лечения для биомаркера под названием высокая микросаттелитная нестабильность (MSI-H) или дефект восстановления несоответствия (dMMR).

Молекулярные нарушения отличаются не только у разных пациентов, но и в пределах одной опухоли. Гетерогенность - большая проблема в онкологии, для решения которой был разработан дизайн исследования Umbrella. Для метода Umbrella пациентов сначала отбирают по типу злокачественных новообразований, а потом учитывают генетические мутации.

Такие исследования помогают не только собрать информацию о действии таргетных препаратов - иногда это единственная возможность для пациентов, которые не отвечают на стандартное лечение зарегистрированными препаратами.

Клинический пример

Мы решили привести наглядный пример, как может выглядеть использование расширенного молекулярного профилирования.

Пациент с меланомой кожи и метастазами в печени обратился к онкологу. Врач и пациент приняли решение сделать молекулярное профилирование, чтобы получить более полную информацию о заболевании. Пациенту провели биопсию и отправили образцы ткани на исследование. В результате диагностики в опухоли обнаружили несколько важных генетических нарушений:

• Мутация в гене BRAF. Указывает на активацию сигнального пути онкогенов RAS-RAF-MEK, который участвует в дифференцировке и выживаемости клеток.
• Мутация в гене NRAS. Указывает на дополнительную активацию сигнального каскада RAS-RAF-MEK.
• Наследственный вариант гена TPMT. Указывает на особенности метаболизма противоопухолевого препарата «Цисплатин».

Ориентируясь на результаты клинических исследований и рекомендации можно прийти к следующим выводам:

• Потенциально эффективными могут быть препараты класса BRAF-ингибиторов (Вемурафениб), более того, наличие мутации NRAS может служить дополнительным основанием для назначения двойной блокады сигнального каскада - комбинацией с MEK-ингибиторами (Траметиниб).
• Несмотря на то что нет одобренной терапии, направленной непосредственно на онкоген NRAS, известно, что мутации в нем повышают вероятность успешного лечения при назначении иммунотерапии (Ипилимумаб и Пембролизумаб).
• Наследственный генетический вариант в гене TPMT указывает на повышенную индивидуальную токсичность Цисплатина, что требует коррекции дозы при назначении платиносодержащих режимов терапии.

Таким образом, врач получает возможность ориентироваться среди возможных вариантов лечения отталкиваясь не только от клинических параметров пациента, но и учитывая молекулярные особенности опухоли.

Молекулярная диагностика - это не панацея для всех онкологических заболеваний. Но это важный инструмент для онколога, который позволяет подойти к лечению злокачественных опухолей с новой стороны.

Спасибо, что читали и комментировали наши материалы об онкологии. Вот полный список статей.

Источник: Материалы третьей ежегодной Российской онкологической конференции
29 ноября - 1 декабря 1999 года, Санкт-Петербург

ПЕРСПЕКТИВЫ МОЛЕКУЛЯРНОЙ ДИАГНОСТИКИ В ОНКОЛОГИИ. К.П. Хансон
НИИ онкологии им. проф. Н.Н. Петрова

Достижения генетики и молекулярной биологии последних десятилетий оказали огромное влияние на понимание природы инициализации и прогрессии злокачественных образовании. Окончательно установлено, что рак представляет собой гетерогенную группу заболеваний, каждое из которых вызывается комплексом генетических нарушений, определяющих свойство неконтролируемого роста и способность к метастазированию. Эти современные знания открыли принципиально новые возможности в диагностике и лечении злокачественных новообразований.

Влияние конкретных генетических нарушений, лежащих в основе опухолевого роста, позволило обнаружить специфические молекулярные маркеры и разработать на их основе тесты ранней диагностики опухолей.

Известно, что неопластические трансформация клеток происходит в результате накопления наследуемых (герминативных) и приобретенных (соматических) мутаций в протоонкогенах или генах-супрессорах . Именно эти генетические нарушения с первую очередь могут быть использованы для обнаружения злокачественных клеток в клиническом материале.

Наиболее подходящим субстратом молекулярной диагностики является ДНК, т.к. она длительно сохраняется в образцах тканей и может быть легко размножена с помощью т.н. полимеразной цепной реакции (ПЦР) . Это позволяет осуществлять диагностику даже при наличии минимального количества исследуемого материала.

Помимо определения мутаций в онкогенах и генах-супрессорах в диагностических целях используют изменения, выявляемые в повторяющихся последовательностях ДНК , т.н. микро сателлитах.

При сравнении парных образцов опухоли и нормальных тканей может быть выявлено выпадение одного из аллелей в опухоли (потеря гетерозиготности (ПГ), что отражает наличие хромосомных делеций, лежащих в основе инактивации генов-супрессоров.

Введение

Рак грудной железы (РГЖ) является одним из самых распространенных онкологических заболеваний в Украине. По данным Национального канцер-регистра Украины, стандартизованный показатель заболеваемости РГЖ в 2009 г. составляет 60,5 случая на 100 тыс. женского населения. Хотя заболеваемость злокачественными новообразованиями грудных желез постоянно повышается, смертность от них имеет тенденцию к снижению .

РГЖ - это неоднородная группа опухолей, отличающихся по морфологии, клиническому течению и чувствительности к лечению. Однако даже гистологически аналогичные опухоли имеют разную естественную историю, что обусловлено определенной ограниченностью морфологической классификации РГЖ. Исследование экспрессии генов клетками РГЖ и их корреляции с фенотипическими проявлениями позволили выделить ряд биологических подтипов РГЖ, которые определяют естественную историю, клинические, патологические и молекулярные свойства опухоли, а также являются ключевыми факторами, предрешающими прогноз течения и эффективность системной лекарственной терапии. Использование в повседневной клинической практике трудоемких и дорогостоящих методик генетического анализа невозможно. Изучение корреляции между экспрессией генов и иммуногистохимическими маркерами в опухоли позволило выделить ряд так называемых молекулярных субтипов РГЖ, определение которых возможно в рутинной клинической практике. На основе иммуногистохимического исследования экспрессии клетками карциномы грудной железы рецепторов к эстрогену и прогестерону (ER и PR), а также рецептора эпидермального фактора роста 2-го типа (Hеr2/neu, ErbB2), РГЖ можно классифицировать на 4 молекулярных подтипа, которые отличаются между собой по прогнозу течения и ответом на медикаментозную терапию . Молекулярные подтипы РГЖ, которые имеют принципиальное клиническое значение, приведены в табл. 1.

Таблица 1. Иммуногистохимический фенотип молекулярных подтипов РГЖ

Молекулярный подтип	Иммуногистохимический портрет			Частота выявления
	ER	РR	Hеr2/ neu
Luminal A	+	+	-	56–61%
Luminal B	+	+	+	9–16%
HER2+	-	-	+	8–16%
Triple negative (Basal-like)	-	-	-	8–20%

Выделяют люминальный, HER2+ и трижды негативный (ТН) молекулярные подтипы РГЖ. К люминальным относятся опухоли, экспрессирующие рецепторы к ER и PR, и в зависимости от экспрессии Hеr2/neu их классифицируют на А (не экспрессируют Hеr2/neu) и Б (экспрессируют Hеr2/neu). HER2+ называются опухоли с гиперэкспрессией Hеr2/neu и отсутствием ER и РR. Опухоли, негативные по 3 выше названным признакам, относятся к ТН (базальноподобному) РГЖ. Установлено, что люминальные типы связаны с менее агрессивным течением и хорошим прогнозом по сравнению с HER2+ и ТН РГЖ . ТН подтип связан с высокой частотой мутации BRCA1 , агрессивным течением, отсутствием реакции на гормонотерапию и трастузумаб, низкой общей и безрецидивной выживаемостью .

Корреляция между иммуногистохимическими маркерами и чувствительностью опухоли к медикаментозному лечению хорошо изучена и лежит в основе клинических рекомендаций по адъювантному лечению РГЖ. Однако количество исследований, в которых бы оценивали взаимосвязь между молекулярными подтипами и клинико-биологическими характеристиками РГЖ, ограничено.

Целью данного популяционного исследования является изучение распространенности, клинико-морфологических особенностей, общей и безрецидивной выживаемости больных РГЖ в зависимости от молекулярного портрета.

Материалы и методы

Подбор пациентов

В исследование включено 350 больных РГЖ в возрасте от 23 до 76 лет (средний возраст - 53±1,7 года), которые находились на лечении в клинике кафедры онкологии Национального медицинского университета имени А.А. Богомольца на базе хирургического отделения Киевского городского клинического онкологического центра с 1 января 2005 г. по 31 декабря 2006 г.

У всех пациенток регистрировали возраст на момент установления диагноза, менструальную функцию, определяли размер, гистологический тип и степень дифференциации опухоли, а также наличие метастазов в регионарных лимфатических узлах (РЛУ).

Размер опухоли оценивали после измерения ее максимального диаметра и классифицировали согласно Международной TNM-классификации (5-е издание, 1997 г.) как Т1 (<2 см), Т2 (2–5 см), Т3 (≥5 см). Отсутствие менструаций у больных в течение 1 года до момента установления диагноза расценивалось как менопауза. Гистологический тип и степень дифференциации опухоли определяли в соответствии с национальными стандартами диагностики и лечения злокачественных новообразований, основанных на рекомендациях ведущих международных организаций. Для оценки метастатического поражения РЛУ из послеоперационного материала макроскопически отбирали 10 подозреваемых на наличие метастазов лимфатических узлов, из которых готовили гистологические препараты для микроскопического изучения.

Молекулярные подтипы РГЖ устанавливали на основании результатов иммуногистохимического исследования экспрессии ER, РR и Hеr2/neu. Все опухоли разделили на 4 подтипа: люминальний А (Luminal A) - ER+ и/или PR+, Hеr2/neu-, люминальний Б (Luminal B) - ER+ и/или PR+, Hеr2/neu+, HER2+ (ER- и PR-, Hеr2/neu+), ТН (Triple negative) - ER- и PR-, Hеr2/neu-.

Все больные получили адъювантную системную и лучевую терапию согласно национальным стандартам лечения РГЖ. Однако при гиперэкспрессии Hеr2/neu ни одна из пациенток, включенных в данное исследование, в адъювантном режиме не получала трастузумаб.

Иммуногистохимическое исследование

С парафиновых блоков готовили срезы толщиной 4–5 микрон, которые помещали на стекла, предварительно обработанные поли-L-лизином. Затем материал исследовали по общепринятой стандартной методике с использованием следующих антител: ER - клон 1D5, PgR - клон 636, Hеr2/neu - клон СВ11.

Интерпретацию результатов иммуногистохимической реакции проводили с использованием качественной оценки ядерной реакции: отрицательная «-», слабо положительная «+», умеренно положительная «++», выражено положительная «+++» - и количественной системы оценки реакции в процентах окрашенных опухолевых клеток.

При определении экспрессии Hеr2/neu отмечали выраженность окраски цитоплазматической мембраны: реакция «-», «+» - отсутствие гиперэкспрессии, реакция «+++» - гиперэкспрессия Hеr2/neu. Наличие гиперэкспрессии Hеr2/neu в случаях реакции «++» оценивали с помощью метода гибридизации in situ с использованием флюоресцентной метки FISH (fluorescence in situ hybridization - флюоресцентная in situ гибридизация). Исследования проводили в патогистологической лаборатории Киевского городского клинического онкологического центра (заведующая лабораторией - доктор медицинских наук Л.М. Захарцева).

Статистический анализ

Статистическую достоверность различий между клинико-биологическими особенностями молекулярных типов РГЖ оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (analysis of variance - ANOVA). Различия считали статистически достоверными при уровне значимости (р) <0,05.

Общую и безрецидивную выживаемость определяли с помощью метода Каплана - Мейера.

Все статистические расчеты проводили с помощью программы MS Exсel.

Результаты

В результате проведенного исследования всех больных на основе данных иммуногистохимического исследования экспрессии ER, РR и Hеr2/neu разделили на 4 группы: люминальний А - 152 (57,5%) пациентки, ТН - 49 (26,5%), люминальний Б - 28 (9%) и HER2+ - 15 (7%) женщин.

Клинико-биологические характеристики различных молекулярных типов РГЖ представлены в табл. 2.

Таблица 2. Клинико-биологические характеристики молекулярных подтипов РГЖ

Характеристика опухоли	Всего n=350 (100%)	Luminal A n=201 (57,5%)	Luminal B n=31 (9%)	HER2+ n=26 (7%)	Triple negative n=92 (26,5%)	p
Стадия заболевания						0,82516
І стадия (T1N0M0)	140 (40%)	83 (41%)	13 (42%)	9 (35%)	35 (38%)
ІІА стадия (TisN1M0, T1N1M0, T2N0M0)	119 (34%)	63 (31,5%)	10 (32%)	9 (35%)	37 (40%)
ІІБ стадия (T2N1M0, T3N0M0)	91 (26%)	55 (27,5%)	8 (26%)	8 (30%)	20 (22%)
Возраст на момент установления диагноза						0,01335
<40 лет	16 (5%)	9 (4,5%)	3 (10%)	0	4 (4%)
40–49 лет	93 (27%)	46 (23%)	7 (22,5%)	9 (34,5%)	31 (34%)
50–59 лет	129 (37%)	83 (41%)	7 (22,5%)	8 (31%)	31 (34%)
60–69 лет	85(24%)	48 (24%)	10 (32%)	6 (23%)	21 (23%)
70 и более лет	27 (8%)	15 (7,5%)	4 (13%)	3 (11,5%)	5 (5%)
Менструальная функция						0,03014
Пременопауза	139 (40%)	74 (37%)	10 (32%)	11 (42%)	44 (48%)
Менопауза	211 (60%)	127 (63%)	21 (68%)	15 (58%)	48 (52%)
Размер опухоли						0,1525
<2 см	184 (52%)	109 (54%)	17 (55%)	10 (38%)	48 (52%)
2–5 см	160 (46%)	87 (43%)	14 (45%)	16 (62%)	43 (47%)
>5 см	6 (2%)	5 (3%)	0	0	1 (1%)
Гистологический тип						0,04012
Дольковый	57 (16%)	38 (19%)	2 (6,5%)	2 (8%)	15 (16%)
Протоковый	254 (73%)	141 (70%)	26 (84%)	24 (92%)	63 (69%)
Смешанный*	19 (5%)	12 (6%)	1 (3%)	0	6 (6%)
Другие**	20 (6%)	10 (5%)	2 (6,5%)	0	8 (9%)
Степень дифференциации опухоли						0,04236
G1	17 (5%)	10 (5%)	2 (7%)	1 (4%)	4 (5%)
G2	275 (78%)	165 (82%)	27 (86%)	21 (80%)	62 (67%)
G3	58 (17%)	26 (13%)	2 (7%)	4 (16%)	26 (28%)
Статус РЛУ						0,53607
Нет метастазов	214 (61%)	125 (62%)	18 (58%)	15 (58%)	56 (61%)
Метастазы в ЛУ	136 (39%)	76 (38%)	13 (42%)	11 (42%)	36 (39%)

Примечания: *дольково-протоковая карцинома; **слизистая, медуллярная, папиллярная карцинома.

Статистически значимой достоверности различий в стадии заболевания между исследуемыми группами не выявлено, что свидетельствует об однородном распределении больных в группах по данному критерию.

Частота выявления различных молекулярных подтипов РГЖ статистически достоверно зависит от следующих клинико-морфологических характеристик: возраста и менструальной функции на момент установления диагноза, гистологического типа и степени дифференциации опухоли. У больных в возрасте 40–49 лет достоверно чаще диагностируют HER2+ и ТН подтипы РГЖ (34,5 и 34% случаев соответственно). Почти у половины пациенток (48%) с ТН молекулярным типом диагноз установлен в пременопаузе. У больных, которые на момент диагностирования находились в менопаузе, чаще других встречается люминальний А (63%) и люминальный Б (68%) типы РГЖ.

Также статистически значимые различия между иммуногистохимическими подтипами наблюдали при различных гистологических типах и степени дифференциации опухоли. Дольковые карциномы чаще диагностировали при люминальном А (19%) и ТН (16%) типах. Протоковый РГЖ регистрировали в 84 и 92% случаев HER2+ и люминального Б молекулярных подтипах соответственно. Дольково-протоковую, слизистую, медуллярную и папиллярную карциному одинаково часто выявляют при люминальных и ТН типах РГЖ, однако в данном исследовании не зафиксировано ни одного случая вышеперечисленных гистологических вариантов при типе HER2+. В исследуемых группах высокодифференцированные (G1) опухоли определяют с одинаковой частотой. Умереннодифференцированные (G2) карциномы грудной железы характерны для люминального А (82%) и Б (86%), а также HER2+ (80%) типов. У 28% пациенток из группы ТН РГЖ выявлены низкодифференцированные (G3) опухоли.

Статистически достоверной взаимозависимости между иммуногистохимическим фенотипом РГЖ и размером первичной опухоли, а также статусом РЛУ не установлено, что наряду со стадией заболевания свидетельствует о равномерном распределении больных в исследуемых группах по этим показателям.

Результаты анализа 5-летней общей и безрецидивной выживаемости пациенток с различными молекулярными типами РГЖ представлены на рис. 1 и 2, а также в табл. 3 и 4 соответственно.

Рис. 1.

Рис. 2.

Таблица 3. Общая выживаемость пациенток в зависимости от молекулярного типа РГЖ

Молекулярный тип РГЖ	Общая выживаемость больных (годы)
	1	2	3	4	5
Luminal A	99%	95%	92%	80%	74%
Luminal B	100%	100%	92%	83%	58%
HER2+	100%	71%	57%	57%	57%
Triple negative	98%	90%	86%	69%	60%

Таблица 4. Безрецидивная выживаемость пациенток в зависимости от молекулярного типа РГЖ

Молекулярный тип РГЖ	Безрецидивная выживаемость больных (годы)
	1	2	3	4	5
Luminal A	95%	84%	79%	66%	62%
Luminal B	100%	83%	67%	58%	42%
HER2+	85%	57%	57%	57%	57%
Triple negative	95%	81%	69%	57%	45%

Общая выживаемость наиболее высокая у пациенток с люминальным А (74%) типом РГЖ, а наиболее низкая - при HER2+ и люминальном Б (58 и 57% соответственно).

5-летняя безрецидивная выживаемость хуже у больных люминальным Б и ТН РГЖ (42 и 45% соответственно) по сравнению с пациентками с люминальным А иммуногистохимическим подтипом.

Обсуждение

Результаты настоящего исследования подтверждают вариабельность РГЖ, которая заключается в наличии различных молекулярных типов данной нозологической формы. Разделение РГЖ на биологические подтипы, которые имеют собственную естественную историю, находит все большее применение в повседневной клинической практике, так как позволяют определить прогноз течения заболевания и являются ключевым фактором для выбора тактики системной медикаментозной терапии . Тем не менее классификация на молекулярные типы не заменяет, а скорее дополняет важные традиционные прогностические критерии, такие как возраст и состояние менструальной функции на момент установления диагноза, размер и степень дифференциации опухоли, наличие метастазов в РЛУ, а также выявление сопутствующей патологии.

Определение молекулярных типов РГЖ на основе имммуногистохимической оценки экспрессии ER, РR и Hеr2/neu является недорогим и достаточно информативным, но вместе с тем упрощенным методом диагностики. Благодаря внедрению новых маркеров молекулярная классификация претерпевает изменения, что позволяет повысить ее прогностическую достоверность. Так, например, при высокой митотической активности клеток (Кі-67 >14%) опухоли с люминальным А фенотипом, согласно рекомендациям Сент-Галленского конгресса по лечению РГЖ (2011 г.), отнесены к люминальному Б Her2/neu-негативному молекулярному подтипу. Необходимость выделения люминального Б Her2/neu-негативного типа РГЖ продиктована особенностями естественной истории этих опухолей, которая больше сходна с естественной историей люминальных Б, чем люминальных А опухолей. Поэтому пациенткам с ER+ и/или PR+, Her2/neu- РГЖ при высокой митотической активности опухоли, которая определяет плохой прогноз течения заболевания, перед назначением антигормональной терапии показано проведение адъювантной полихимиотерапии .

Полученные в данном популяционном исследовании результаты свидетельствуют о том, что частота выявления различных молекулярных типов РГЖ, определенных на основе имммуногистохимической оценки экспрессии ER, РR и Hеr2/neu, неодинакова. Чаще всего встречается люминальный А (57,5%) молекулярный подтип РГЖ, вторым по частоте является ТН (26,5%), потом люминальный Б (9%) и HER2+ (7%) типы.

Люминальный А иммуногистохимический тип РГЖ в большинстве случаев диагностируют у пациенток после 50 лет, которые находятся в менопаузе. Данный вариант РГЖ чаще других характеризуется дольчатым гистологическим типом и умеренной степенью дифференциации опухоли. 5-летняя общая и безрецидивная выживаемость больных с этим молекулярным типом РГЖ наиболее высокая и составляет 74 и 62% соответственно.

ТН РГЖ чаще выявляют у больных в возрасте от 40 до 60 лет независимо от состояния менструальной функции, для него характерен дольчатый гистологическим тип в 16% случаев, и в 28% данные опухоли являются низкодифференцированными. По сравнению с люминальным А типом у больных ТН РГЖ 5-летняя общая и безрецидивная выживаемость ниже и составляет 60 и 45% соответственно.

Люминальный Б молекулярный тип, как и люминальный А, чаще диагностируют у женщин после 50 лет, которые находятся в постменопаузе. Более чем в 80% случаев это умереннодифференцированная протоковая карцинома. У пациенток с люминальным Б РГЖ - наименьшая 5-летняя общая и безрецидивная выживаемость и составляет 58 и 42% соответственно.

HER2+ тип, как и ТН, чаще возникает у пациенток в возрасте от 40 до 60 лет независимо от статуса менструальной функции, практически всегда является умереннодифференцированной карциномой. 5-летняя общая и безрецидивная выживаемость одинаковая и составляет 57%.

Итак, наиболее благоприятным молекулярным подтипом РГЖ с точки зрения прогноза течения является люминальный А. Неблагоприятное клиническое течение люминального Б и HER2+ типов, возможно, связано с отсутствием терапии трастузумабом.

Список использованной литературы

1. Бюллетень Национального канцер-регистра № 12. «Рак в Україні, 2009–2010», Киев: 2011.

2. Perou C.M., Sorlie T., Eisen M.B. et al. (2000) Molecular portraits of human breast tumours. Nature, 406(6797): 747–752.

3. Sorlie T., Perou C.M., Tibshirani R. et al. (2001) Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 19(98): 10869–10874.

4. Sorlie T., Tibshirani R., Parker J. et al. (2003) Repeated observation of breast tumor subtypes in independent gene expression data sets. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 14(100): 8418–8423.

5. Sotiriou C., Neo S.Y., McShane L.M. et al. (2003)Breast cancer classification and prognosis based on gene expression profiles from a population-based study. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 18(100): 10393–10398.

6. Carey L.A., Perou C.M., Livasy C.A. et al. (2006) Race, breast cancer subtypes, and survival in the Carolina Breast Cancer Study. JAMA, 21(295): 2492–2502.

7. Foulkes W.D., Stefansson I.M., Chappuis P.O. et al. (2003) Germline BRCA1 mutations and a basal epithelial phenotype in breast cancer. J. Natl. Cancer Inst., 19 (95): 1482–1485.

8. Liu H., Fan Q., Zhang Z. et al. (2008) Basal-HER2 phenotype shows poorer survival than basal-like phenotype in hormone receptor-negative invasive breast cancers. Hum. Pathol., 2 (39): 167–174.

9. Goldhirsch A., Wood W.C., Coates A.S. et al. (2011) Strategies for subtypes-dealing with the diversity of breast cancer: highlights of the St Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011. Ann. Oncol., 8(22): 1736–1747.

Молекулярні типи раку грудної залози, визначені на основі імуногістохімічних маркерів: клініко-біологічні особливості та прогноз перебігу

І.Б. Щепотін¹, О.С. Зотов¹, Р.В. Любота¹, М.Ф. Анікусько², І.І. Любота²

¹Національний медичний університет імені О.О. Богомольця, Київ

2 Київський міський клінічний онкологічний центр

Резюме. Рак грудної залози - неоднорідна група пухлин, які відрізняються етіологією, морфологічною картиною, клінічним перебігом і чутливістю до проведеного лікування. Метою даного популяційного дослідження було вивчення поширеності, клініко-морфологічних особливостей, загальної та безрецидивної виживаності хворих на РГЖ залежно від молекулярного типу. Обстежено 350 пацієнток із РГЖ у віці від 23 до 76 років (середній вік - 53±1,7 року), які проходили лікування в клініці кафедри онкології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця на базі хірургічного відділення Київського міського клінічного онкологічного центру в 2005–2006 рр. Виявлено ​статистично значущі відмінності між молекулярним типом РГЖ та клініко-морфологічними особливостями, а саме: вік і статус менструальної функції на момент встановлення діагнозу, гістологічний тип і ступінь диференціювання пухлини, а також загальна та безрецидивна виживаність хворих.

Ключові слова: рак грудної залози, молекулярні типи, прогноз перебігу, клініко-морфологічні особливості.

Molecular types of breast cancer, established on the basis of immunohistochemical markers: clinical and biological characteristics and prognosis

I.B. Schepotin¹, A.S. Zotov¹, R.V. Lіubota¹, N.F. Anikusko², I.I. Lіubota²

¹A.A. Bogomolets National Medical University, Kyiv

2 Kyiv municipal clinical oncological centre

Summary. Breast cancer (BC) is heterogeneous group of tumors that has different etiology, morphological pattern, clinical course and sensitivity to the treatment. The aim of this study was to investigate population prevalence, clinical and morphological features, general and disease-free survival of patients BC depending on the molecular type. The study involved 350 patients with BC aged 23 to 76 years (mean age 53±1,7 years.) They were treated in the clinic of the Department of Oncology A.A. Bogomolets National Medical University, based on the surgical department of the Kyiv City Clinical Cancer Center in 2005–2006 years. A statistically significant difference between type BC molecular and morphological features, namely age and status of menstrual function at the time of diagnosis, histological type and degree of tumor differentiation, as well as general and disease-free survival of patients.

Key words: breast cancer, molecular types, prognosis, clinical and morphological features.

Одним из наиболее современных и высокотехнологичных методов диагностики рака являются генетические (молекулярные) тесты. Эти исследования позволяют не только определять наследственную предрасположенность к тем или иным онкологическим заболеваниям, но и оценивать целесообразность назначения химиотерапии и определить степень агрессивности рака.

В Первом медицинском центре Тель-Авива проводят наиболее эффективные и доказанные генетические исследования из более чем 900 существующих на данный момент. При этом предоставляется услуга дистанционного тестирования, когда пациенту нет необходимости лететь в Израиль. Достаточно отправить по почте образец материала (после пункции либо операции), соблюдая некоторые правила, и ожидать результатов исследования.

Oncotype DX

Это молекулярное исследование применяется при раке молочной железы. В зависимости от целей исследования, типа опухоли и индивидуальных особенностей пациентки различают несколько видов Oncotype DX.

Oncotype DX Breast

Тест используется для определения степени дифференциации опухолевых клеток рака груди (соответственно определяется вероятность рецидива). Применяется после проведения операции по удалению опухоли для выяснения целесообразности назначения химиотерапии. Исследование подходит для эстроген-позитивных опухолей (ER+), инвазивного рака груди без метастазирования в регионарные лимфатические узлы.

Стандартными признаками для выбора тактики лечения после операции являются:

До появления генетических тестов, эти три признака были единственным источником информации, на основании которого определялась тактика о дальнейшем назначении химиотерапии. Однако, далеко не всегда агрессивность раковых клеток и, соответственно, вероятность отдаленного рецидива коррелирует с размерами опухоли и наличием метастазов в лимфатических узлах.

Сегодня в мировой медицине генетический тест Oncotype DX является золотым стандартом и ведущим критерием для выбора тактики терапии при раке груди. Он позволяет как предупредить рецидив заболевания, так и избежать ненужного назначения химиотерапии и всех связанных с ней побочных эффектов.

Fish-тест на рецепторы к Герцептину

Является иммуногистохимическим исследованием, с помощью которого на раковых клетках обнаруживаются специфические рецепторы (HER-2, PR, ER), которые делают ее чувствительной к таргетным лекарственным препаратам. Таковым, в частности, является препарат Герцептин, относящийся к классу моноклональных антител. Он давно успешно применяется при лечении рака молочной железы в Израиле и показал хорошие результаты по продлению жизни и предотвращению рецидивов даже в запущенной стадии и наличии метастазов.

Примерно в 1 из 4 случаев рака молочной железы, опухоль оказывается чувствительной к терапии Герцептином и выяснить это позволяет молекулярный тест на специфические рецепторы. Преимуществом лечения биологическими препаратами по сравнению со стандартными методами (радио и химиотерапия) является отсутствие вредных побочных явлений.

Молекулярный тест гена CYP2D6

Применяется исключительно в случаях гормон-зависимых опухолей молочной железы. В таких раковых клетках присутствуют рецепторы к гормонам — эстрогену и прогестерону, что делает их чувствительными к воздействию гормональной терапии (особенно у женщин в период климакса).

Исследования показали, что применяемые гормон заместительные препараты превращаются в печени в активное действующее вещество благодаря особому ферменту CYP2D6, кодируемому одноименным геном. В среднем до 10% людей имеют мутацию этого гена, из-за которой полноценная трансформация гормонов невозможна.

Генетический тест дает возможность выявить эту мутацию и таким образом определить, будет ли эффективным лечение гормональными препаратами и оценить риск развития рецидива. В Первом медицинском центре Тель-Авива данное исследование проводится с материалом из слюны пациента.

Oncotype DX Colon

Молекулярное исследование, которое применяется при раке толстого кишечника для комплексного взвешивания риска развития рецидива и степени опухолевой прогрессии. Суть теста заключается в анализе сложным программным обеспечением 12 генов ДНК раковой клетки, которые отвечают за степень дифференциации, атипичности и генных аберраций. Результат анализа преобразуется в числовой вид и имеет значение от 0 до 100.

Исследование Oncotype DX Colon назначается пациентам с злокачественными опухолями толстой кишки 2й стадии после операции удаления первичной опухоли и при условии отсутствия метастазов в регионарных лимфатических узлах. Около 15% пациентов с раком толстого кишечника имеют не агрессивную форму опухоли, не склонную к рецидивированию. Тест позволяет оценить этот риск и избежать ненужного назначения химиотерапии.

Длительность генетического тестирования Oncotype DX Colon в Израиле составляет около двух недель, а материал берется непосредственно из первичной опухоли. Оценку делают по 100-бальной шкале, производится комплексное заключение и выбирается дальнейшая тактика лечения.

Тест K-RAS

Специфический генетический тест, который позволяет определить чувствительность рака толстой и к таргетной терапии препаратом Сетуксимаб. Препарат является моноклональным антителом, которое избирательно блокирует рецепторы EGFR опухолевых клеток. Агрессивность рака толстой и прямой кишки напрямую зависит от экспрессии специфических рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR).

K-RAS представляет собой белок, который участвует в каскаде реакций, контролирующих клеточное деление эпителия кишечника. Мутации в гене, кодирующем этот белок, приводят к тому, что лечение Сетуксимабом становится неэффективным. Приблизительно 60% людей не имеют этой мутации, поэтому в случае негативного результата теста можно назначать препарат.

Тест K-RAS является крайне важным диагностическим критерием в современной онкологии. Это связано с тем, что лечение Сетуксимабом продлевает жизнь на 2-5 лет или даже приводит к полному выздоровлению больных с запущенными формами новообразований толстой и прямой кишки. Еще 10 лет назад метастатический рак этих отделов ЖКТ считался неизлечимым и больные получали паллиативную терапию, с внедрением биологической терапии пациенты получили шанс на выздоровление.

Тест на EGFR мутацию

Этот генетический тест применяется при немелкоклеточном раке легких. Есть два фермента, которые контролируют размножение клеток — тирозин-киназа и эпидермальный фактор роста EGFR. Поэтому в современных методах таргетной терапии опухолей применяются два препарата, ингибирующих эти ферменты, Эрлотиниб и Гефетиниб.

По статистике от 15 до 20% пациентов имеют мутацию гена EGFR, поэтому им нужно назначать таргетное лечение в виде моноклональных антител вместо химиопрепаратов второй линии. Особо актуально это для 3 и 4 стадий немелкоклеточного рака легких с наличием метастазов. Эрлотиниб и Гефетиниб могут годами ингибировать рост раковых клеток и вызвать длительную ремиссию у пациента. К тому же, моноклональные антитела не имеют негативных побочных действий, как химиотерапия (цитотоксический эффект), так как не воздействует на здоровые клетки.

Комплексное обследование Target Now

Каждая атипичная раковая клетка имеет свой уникальный набор рецепторов и экспрессию генов так же, как у каждого человека уникальны отпечатки пальцев. От их наличия или отсутствия зависит эффективность химиотерапии и лечения биологическими таргетными препаратами.

Современный этап развития лечения моноклональными антителами приобрел такой размах, что для максимально эффективного подбора препарата нужно провести массу молекулярных тестов. Методика Target Now позволяет объединить их все в одно исследование, которое в точности отразит генетический код атипичной клетки.

Впервые официальные результаты испытаний теста были представлены в 2009 году на конференции Американской Ассоциации исследований онкологических заболеваний. По ним у более 98% пациентов с запущенной формой рака (наличие метастазов) удалось получить полную картину молекулярных мишеней и подобрать соответствующую таргетную терапию. Более того, у 30-35% пациентов, вследствие модифицированной терапии по результатам Target Now, наблюдалось значительное улучшение качества жизни и увеличилась длительность жизни.

Тест показан к применению у пациентов, предыдущее лечение у которых оказалось не эффективным, либо с метастазами любой локализации. Для проведения исследования необходим материал из ткани опухоли (биопсия, либо после операции).

Mamma Print

Этот генетический тест предназначен для определения риска развития рецидива после рака молочной железы. По рекомендациям американской Food and drug administration (FDA) тест показан пациенткам с любой формой рака груди моложе 60 лет, без метастатического поражения лимфатических узлов и при условии, что опухоль имеет размер менее 5 сантиметров.

Суть исследования заключается в молекулярном анализе экспрессии 70 генов раковой клетки с последующей оценкой агрессивности опухоли и выведении итогового риска рецидива с помощью математической формулы. Результат позволяет выбрать тактику лечения и определить целесообразность назначения химиотерапии пациентам.

Отличие Mamma Print от аналогичных генетических тестов заключается в том, что исследование проводится на образце “свежей” ткани, поэтому при нем обязательно пребывание пациентки в Израиле для проведения пункции или операции. Результата ждать нужно около недели, но после процедуры можно ехать домой и получить ответ в письменном виде.

Заполнить заявку на лечение

В результате прогресса новых научных направлений молекулярной биологии, молекулярной генетики и генной инженерии сделан огромный шаг вперед, что позволяет сейчас задавать природе вопросы, которые ранее ставить было невозможно. Речь идет о понимании самых фундаментальных основ таких явлений, как клеточное деление и дифференцировка, а также причин механизма их нарушений.

В конкретном приложении к одной из самых злободневных и волнующих проблем, стоящих перед человечеством, — проблеме злокачественных опухолей — можно говорить о появлении новой науки — молекулярной онкологии. Ее поразительные успехи в сфере изучения молекулярных механизмов онкогенеза и молекулярных основ ракового фенотипа связаны с применением уникальных, присущих ей методов исследования.

Выходящая в свет и предлагаемая читателям книга «Молекулярная онкология» посвящена подведению первых итогов и изложению достижений указанной молодой науки. В ней четко прослеживается преемственность основных принципов и постулатов классической теоретической онкологии прежде всего в главных вопросах: полиэтиологичности возникновения опухолей и многостадийности этого процесса.

Однако решения даются уже на другом уровне организации живой материи — молекулярном. Данная книга — первая и единственная пока в нашей стране. Она написана авторами, непосредственно и активно работающими в данной области, что предопределило глубину осмысления приводимых конкретных фактов и конструктивность обобщений. Через всю книгу проходит мысль об универсальности молекулярных механизмов онкогенеза.

Эта идея естественно вытекает из проводимого авторами анализа новейших исследований основных видов канцерогенеза: химического, физического, биологического, основа которых, как убедительно показывают авторы, едина и может быть выражена в принципиально общих молекулярных терминах.

Каждому из этих видов онкогенеза посвящены отдельные главы. 1-я глава обращает читателя к истокам теоретической онкологии, к ее классическим исследованиям начала нынешнего столетия. 2-я и 3-я главы посвящены соответственно молекулярным механизмам химического и вирусного канцерогенеза.

Упомянутые первые три главы логически предшествуют заключительным — 4-й и 5-й главам — подлинной сердцевине книги.

Именно в этих главах в концентрированном виде представлены факты и идеи, символизирующие суть и дух современной теоретической онкологии — онкологии молекулярной. Ее достижения вселяют уверенность в конечной победе человеческого разума над тяжелым недугом.

«Молекулярная онкология»,
И.Ф. Сейц, П.Г. Князев

Критически мыслящему наблюдателю современная теоретическая онкология, возможно, представляется деревом цветущим, но не плодоносящим. Такое впечатление в какой-то мере оправдано и обусловлено явным дисбалансом огромных интеллектуальных усилий и материальных вложений, с одной стороны, и скромных практических выходов — с другой. Все еще остаются неясными как природа злокачественных новообразований, так и первичный побудительный импульс, инициирующий неотвратимую цепь…

С течением времени выявление канцерогенных свойств химических агентов стало лишь делом техники, и наметилось явное смещение акцентов исследований от рутинного их тестирования на канцерогенность к изучению механизма онкогенного действия. В этом деле, наряду со значительными успехами, выявились и немалые трудности. Успехи касались чисто химической стороны проблемы: была установлена необходимость активации исходных канцерогенов, изучены метаболизм, взаимодействие…

Каким образом вторжение осколков химических канцерогенов в ДНК результируется в неконтролируемый рост и трансформацию клеток? Теория химического канцерогенеза для того, чтобы сделать новый и решающий шаг вперед, нуждается в каком-то научном событии, аналогичном по значимости открытию обратной транскриптазы в онковирусологии. В теории химического канцерогенеза подобного события пока не произошло. Тем не менее можно ожидать, что…

Главным успехом онковирусологии наших дней следует считать открытие онкогенов — дискретных материальных генетических элементов в структуре ДНК клеток, ответственных за индукцию злокачественных опухолей у человека и животных. Это направление исследований является наиболее перспективным в современной теоретической онкологии. Онкогены обнаружены в геномной ДНК не только животных, но и человека, а вероятность их участия в индукции опухолей…

Еще И. М. Сеченов в 1860 г. в тезисах докторской диссертации писал, что при настоящем состоянии естественных наук единственно возможный принцип патологии есть молекулярный. Сейчас можно только удивляться этому провидению. Сегодня молекулярная онкология стоит у порога тайны рака. Именно ей принадлежат наиболее выдающиеся успехи в области теоретической онкологии последних лет. К ним можно отнести следующие…

Если молекулярная биология в наиболее лаконичной интерпретации может быть охарактеризована как наука, выражающая и объясняющая сложные общебиологические явления в терминах свойств и взаимодействия молекул, то молекулярная онкология, естественно, призвана раскрывать молекулярные механизмы процесса канцерогенеза и особенностей опухолей. В данной книге сделана попытка подытожить успехи этой молодой науки. Все величие прогресса в познании опухолей в наше…

Использование методов переноса генов и молекулярного клонирования позволило установить некоторые наиболее важные, центральные детерминанты ракового процесса. Эти детерминанты — онкогены и их продукты — онкобелки, действующие как на структуру, так и на функции клеток, влияющие на регуляторные механизмы биохимических реакций. Многие из этих функций онкогенов и онкобелков пока неизвестны, однако при современном уровне знаний их…

Онкобелок p21cras в процессе трансформации клеток, по-видимому, существенно влияет на биоэнергетику клетки и передачу регуляторного сигнала от клеточной мембраны в ядро . Несомненно также и то, что онкобелок p2jcras в своем многофункциональном действии в процессе малиг-низации клетки-мишени кооперирует с функциями других активированных протоонкогенов . Для некоторых стероидных гормонов, например глюкокортикоидов, установлен механизм передачи их информации от специфического…